梁宏衛(wèi)，Prakash Lakshmanan，劉曉燕，黃柯鈞，顏 睿，羅 霆

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所/廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點實驗室，南寧 530007；2.廣西博慶食品有限公司，廣西 宜州 546300)

【研究意義】土壤酸化造成耕地養(yǎng)分損失而危害作物生長[1]，是全世界面臨的最大農(nóng)業(yè)環(huán)境問題之一[2]。廣西是僅次于巴西圣保羅的世界第二大產(chǎn)糖省份，甘蔗栽培面積和蔗糖產(chǎn)量均占全國的60%以上，超過2600萬農(nóng)民(占廣西農(nóng)業(yè)人口的50%以上)從事甘蔗生產(chǎn)，但廣西約8×105hm2甘蔗種植在pH低于5.0的酸性土壤中[3]，而大量偏施氮肥是廣西蔗地土壤酸化的最主要原因[4-5]。廣西蔗地年施氮量為500～755 kg/hm2，是巴西的6～10倍，超世界平均施氮水平3倍以上，造成生產(chǎn)成本高、土壤酸化和環(huán)境污染，引發(fā)甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)下降、固氮效率低及大面積宿根黃化等問題[6-8]。割手密(SaccharumspontaneumL.)又稱甘蔗屬細莖野生種，國內(nèi)外現(xiàn)代甘蔗品種的親本除少部分含有個別大莖野生種、中國種或印度種的血緣外，其余絕大多數(shù)均為割手密和熱帶種原種的后代。割手密變異類型多、遺傳多樣性豐富[9-10]、適應(yīng)性廣、抗逆性強、對各種土壤類型具有很強的適應(yīng)性，甚至能生長在氮含量接近零的成土母質(zhì)或石縫中[11]，從中發(fā)掘兼具固氮和耐酸特性的變異類型用于甘蔗育種，不但能填補甘蔗耐酸種質(zhì)資源發(fā)掘研究的空白，還有望實現(xiàn)減少氮肥施用、緩解土壤酸化進程和獲得固氮且耐酸的甘蔗種質(zhì)資源。但目前甘蔗及其近緣屬的耐酸種質(zhì)資源發(fā)掘利用滯后，對割手密耐酸機制也一無所知。因此，評價和鑒定中國甘蔗種質(zhì)資源圃廣西分圃前期研究獲得的部分甘蔗屬野生割手密種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀、固氮能力和耐酸特性，對我國甘蔗屬野生割手密種質(zhì)資源的創(chuàng)新及固氮且耐酸品種選育具有重要意義。【前人研究進展】20世紀60年代巴西研究人員從甘蔗根際分離得到多種固氮菌并開創(chuàng)非豆科植物聯(lián)合固氮研究[12]，80年代末又從甘蔗體內(nèi)分離得到幾種固氮菌，將內(nèi)生固氮菌概念引入非豆科植物聯(lián)合固氮領(lǐng)域[13]。D?bereiner實驗室研究證實，巴西甘蔗品種能通過聯(lián)合固氮獲得生長所需氮素的30%～70%[14-15]，部分常年不施氮肥甘蔗品種的固氮效率甚至達85%[16]，而我國甘蔗品種聯(lián)合固氮效率相對較低，約為5%[17]，但在嚴格低氮和接種高效固氮菌條件下固氮效率能得到進一步提高[17-18]。已有研究認為，巴西甘蔗高效聯(lián)合固氮系統(tǒng)的形成與長期不施或少施氮肥有關(guān)，缺氮使得巴西甘蔗體內(nèi)固氮能力強的細菌受到選擇而長期存活，并穩(wěn)定地與寄主聯(lián)合固氮，使寄主逐漸被馴化成高固氮甘蔗品種[19-20]?？梢?，發(fā)掘甘蔗的固氮潛力能有效減少氮肥施用，但我國現(xiàn)有的甘蔗栽培品種由于長期處于高氮脅迫下，甘蔗體內(nèi)能低氮存活的細菌數(shù)量僅相當于巴西品種的最低水平(104CFU/g DW)，很難形成高效聯(lián)合固氮系統(tǒng)，不能作為發(fā)掘、探尋甘蔗高效聯(lián)合固氮機制和種質(zhì)資源的理想分析群體。土壤酸害或鹽堿毒害是限制作物生長與產(chǎn)量提高的主要非生物脅迫因子之一。Chen等[21]、Xue等[22]研究認為，在酸化土壤中，游離出來的鋁、錳和氫等離子對植物產(chǎn)生毒害，使得鈣、鎂和磷等元素有效性降低，造成植物養(yǎng)分缺乏；植物應(yīng)對酸性土壤脅迫的機制包括改變根際土壤pH降低鋁和錳的毒性以提高養(yǎng)分吸收效率，通過將鋁離子隔離在細胞液泡中隔絕其對細胞的傷害，以及通過根系分泌物將根際pH調(diào)整到有利于養(yǎng)分吸收范圍以降低養(yǎng)分缺乏程度，促進植物生長。培育耐酸鋁作物品種是有效利用酸性土壤、提高作物生產(chǎn)力的最根本和有效途徑。目前，通過選育獲得耐酸水稻、苜蓿、玉米、大麥和油茶等作物品種的研究已有報道[23-24]，也有研究證實MATE基因家族中的SbMATE基因?qū)Ω收崮退?鋁)發(fā)揮作用[23]。根尖是鋁的作用位點和積累區(qū)，抑制根尖生長是鋁毒害的最明顯特征[25-26]。鋁毒害能使根尖細胞分裂和伸長受阻、根冠生長緩慢、根尖變形、側(cè)根減少、主根變短，使根中的有機酸、酚類物質(zhì)和細胞壁相關(guān)多糖的產(chǎn)生、釋放及細胞骨架發(fā)生變化，進而影響植株的生長發(fā)育[27-28]。海洋細菌N-LY-1菌株具有一定的固氮能力，其一定濃度無菌發(fā)酵液能促進黃瓜幼苗生長，具有進一步開發(fā)為農(nóng)用微生物制劑的潛力?！颈狙芯壳腥朦c】通過育種手段改良甘蔗品種，使其耐酸和固氮，可能是解決氮肥過量施用和土壤酸化影響甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)的最有效途徑，但迄今鮮見甘蔗耐酸基因資源發(fā)掘利用及通過評價鑒定甘蔗屬野生割手密種質(zhì)資源農(nóng)藝性狀和固氮能力篩選兼具固氮和耐酸特性甘蔗特異種質(zhì)的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用設(shè)立于廣西南寧市的中國甘蔗種質(zhì)資源圃廣西分圃前期研究獲得的部分甘蔗屬野生割手密核心種質(zhì)，進行農(nóng)藝性狀、固氮酶活性及不同酸水平下的根重和根系活性變化情況分析，評價其固氮和耐酸能力，以期獲得兼具固氮和耐酸特性的割手密材料，為發(fā)掘我國甘蔗耐酸性品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試33份割手密材料由中國甘蔗種質(zhì)資源圃廣西分圃(南寧)保存提供，是該圃在前期研究中從2000余份割手密材料中篩選獲得的核心種質(zhì)。

1.2 試驗方法

1.2.1 外觀農(nóng)藝性狀和固氮特性分析與鑒定 將參試割手密材料以10 cm長的單芽截莖栽培于30 L容量、裝有v(沙)∶v(蛭石)=1∶1基質(zhì)的膠桶中，每桶種2芽，每個品種種5個重復(fù)(桶)。桶中基質(zhì)pH 5.61，全氮98.0 mg/kg，全磷169.0 mg/kg，全鉀360.0 mg/kg，有機質(zhì)1.4 g/kg。試驗材料于2020年3月11日種植，當年11月調(diào)查農(nóng)藝性狀和進行固氮特性分析。株高為從地面測量到第一片可見肥厚帶葉鞘處的高度；莖徑為以游標卡尺測量主莖中位節(jié)間中部的直徑，測量時游標卡尺的方向與節(jié)上芽點方向平行；錘度為莖基部節(jié)間的測量值；干物率測定采用烘干法，取新鮮+1葉(第一片可見肥厚帶葉片)剪碎，80 ℃烘干至恒重，計算干物率；參考羅霆[7]的方法進行固氮酶活性測定和nifH基因克??；分析所調(diào)查農(nóng)藝性狀和生理指標的變異情況及其相關(guān)性，并對其進行歐氏距離聚類。同時，按高、中、低對農(nóng)藝性狀進行分級(表1)，綜合評價割手密種質(zhì)的農(nóng)藝性狀和固氮酶活性，篩選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的固氮割手密材料。

表1 割手密種質(zhì)的主要性狀分級標準

1.2.2 耐酸特性鑒定 于2021年3月，將篩選得到的優(yōu)良固氮材料水培于半自動循環(huán)水培系統(tǒng)，每份材料種植8株，全生育期培養(yǎng)于Hoagland營養(yǎng)液[成分為KNO32.5276 g，Ca(NO3)2·4H2O 5.9038 g，K2SO40.4360 g，MgSO4·7H2O 2.4600 g，ZnSO4·7H2O 0.1099 mg，CuSO4·5H2O 0.3930 mg，KH2PO468.0420 mg，MnCl2·4H2O 0.9050 mg，H3PO31.4300 mg，F(xiàn)e-EDTA 0.3000 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0100 mg]。利用HCl將水培液的pH分別調(diào)至6.0和3.0，當年11月測定根系重量和根系活力。稱重根系時先將植株從水培系統(tǒng)取出，將根系與植株分離，用棉布擦干表面水分；根系活力測定采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)。

綜合分析農(nóng)藝性狀、固氮酶活性(還原乙烯量，以乙炔還原反應(yīng)中產(chǎn)生的乙烯含量計，下同)和酸性條件下的根重和根系活力等，篩選出兼具固氮和耐酸特性的種質(zhì)。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Excel 2016記錄和整理數(shù)據(jù)，以SPSS 22.0進行相關(guān)分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 各割手密材料的農(nóng)藝性狀變異情況及等級劃分

由表2可知，33份割手密種質(zhì)株高、總莖數(shù)、錘度、干物率和固氮酶活性的變異系數(shù)分別為18.00%～111.00%、22.00%～147.00%、21.00%～145.00%、58.00%～75.00%和25.00%～1810.00%，平均值分別為31.73%、37.22%、40.69%、6.77%和59.22%，變異系數(shù)的平均值排序為固氮酶活性>錘度>總莖數(shù)>株高>干物率，其中，固氮酶活性變異系數(shù)的平均值最大，說明這些割手密材料中存在固氮能力變異豐富的不同類型，參試割手密材料的固氮能力差異明顯，而干物率變異系數(shù)的平均值最小，實際干物率變化范圍在0.54%～0.68%(表3)，說明參試割手密材料的干物率遺傳變異不明顯。

表2 割手密種質(zhì)主要性狀的變異情況

表3 割手密種質(zhì)主要性狀的分級

續(xù)表3 Continued table 3

以5個性狀指標對參試33份割手密材料進行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果(表4)發(fā)現(xiàn)干物率與錘度、固氮酶活性與總莖數(shù)呈顯著正相關(guān)(P<0.05，下同)，相關(guān)系數(shù)分別為0.469和0.489；干物率與總莖數(shù)呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.381，其余性狀間無顯著相關(guān)性(P>0.05，下同)，說明株高、總莖數(shù)、錘度、干物率和固氮酶活性間相關(guān)性不強。

表4 割手密材料主要性狀的相關(guān)系數(shù)

表3中，固氮等級為1的高固氮種質(zhì)包括GSM627、GSM824、GSM1119、GSM1926、GSM111、GSM236、GSM226、GSM720、GSM20、GSM177、GSM03和GSM152，綜合這12份種質(zhì)的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)GSM177和GSM03的所有農(nóng)藝性狀指標分級均等于或高于2級，是綜合性狀優(yōu)良的固氮割手密材料，對分離自種質(zhì)GSM177和GSM03根系內(nèi)的細菌進行固氮nifH基因克隆，結(jié)果(圖1)證實種質(zhì)GSM177和GSM03體內(nèi)存在大量固氮細菌，進一步驗證GSM177和GSM03是綜合性狀優(yōu)良的固氮型割手密材料。

圖1 種質(zhì)GSM177(T1、T3、T4、T5、T9和T11)和GSM03(S2、S5、S7和S14)內(nèi)生細菌的nifH固氮基因克隆Fig.1 Cloning of nitrogen-fixing nifH gene of endophytic bacteria in germplasm GSM177(T1，T3，T4，T5，T9 and T11) and GSM03(S2，S5，S7 and S14)

2.2 割手密種質(zhì)的聚類分析

從圖2可看出，根據(jù)農(nóng)藝性狀，參試的33份割手密種質(zhì)在歐式距離10.63處可分為兩大類，第一大類包括GSM103、GSM327、GSM414、GSM418、GSM516、GSM602、GSM515、GSM427、GSM1126、GSM824、GSM1119、GSM720、GSM19和GSM20共14份種質(zhì)，其余19份種質(zhì)(GSM24、GSM27、GSM3-5、GSM3-18、GSM421、GSM511、GSM627、GSM825、GSM1926、GSM126、GSM111、GSM236、GSM226、GSM717、GSM8、GSM11、GSM177、GSM03和GSM152)聚為第二大類；在歐式距離8.51處，第一大類和第二大類均可進一步分為2個類群(分別為第一至第四類群)，第一大類的第一類群包括GSM103、GSM327和GSM414共3份種質(zhì)，其余11份種質(zhì)聚在第二類群；第二大類的GSM627、GSM03、GSM111、GSM236、GSM177和GSM152共6份種質(zhì)聚入第四類群，其余13份種質(zhì)聚在第三類群；一些種質(zhì)的聚類結(jié)果與種質(zhì)本身特性具有一定的一致性，如聚在第四類群的6份種質(zhì)為多莖的高固氮組合，其總莖數(shù)和固氮等級均為1級，在聚類圖中也表現(xiàn)出較高的相似性，在第三類群中，GSM3-18、GSM825、GSM226和GSM1926聚為一個小類，這4份種質(zhì)的株高和干物率均為3級，有植株矮小和干物率低的特點；種質(zhì)分類特點與地理來源關(guān)系不明顯，如來自云南、廣東和廣西的割手密種質(zhì)雖地理來源相對較遠，但很多種質(zhì)因具有相似的農(nóng)藝性狀或固氮特性而聚在一起，而來源相同的種質(zhì)卻分散聚在不同類群(聚在第四類群的多莖高固氮種質(zhì)GSM627、GSM03、GSM111、GSM236、GSM177和GSM152分別來源于云南蒙自、廣西靈山、廣西柳江、廣東湛江、廣西臨桂和廣西象州)，說明不同割手密種質(zhì)不能根據(jù)地域來源明顯聚類，但具有較多相同性狀特征的種質(zhì)可聚為一類?？梢姡钍置芊N質(zhì)的表型和固氮能力在長期演化和自然選擇過程中發(fā)生了顯著變化。

圖2 33份割手密種質(zhì)根據(jù)農(nóng)藝性狀和固氮酶活性的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 33 samples of S. spontaneum L. based on agronomic traits and nitrogen fixation activity

2.3 種質(zhì)GSM177和GSM03在不同pH水平下的根重和根系活力比較

通過外觀農(nóng)藝性狀和固氮特性分析，種質(zhì)GSM177和GSM03是農(nóng)藝性狀優(yōu)良的固氮割手密材料。利用不同pH水平對種質(zhì)GSM177和GSM03進行耐酸性篩選和鑒定，發(fā)現(xiàn)種質(zhì)GSM177在pH 3.0和pH 6.0下均表現(xiàn)植株高大、分蘗多、根系發(fā)達，外觀農(nóng)藝性狀差異不明顯(圖3-A)，而種質(zhì)GSM03在pH 6.0下植株高大、分蘗多、根系發(fā)達，在pH 3.0下植株矮小、根系短小、側(cè)根少(圖3-B)。從圖4和圖5可看出，種質(zhì)GSM03的根重和根系活力在pH 3.0和pH 6.0下均存在極顯著差異(P<0.01)，種質(zhì)GSM177的根重和根系活力在pH 3.0和pH 6.0均無顯著差異，進一步說明種質(zhì)GSM177較耐受酸性土壤環(huán)境，其在pH 3.0和pH 6.0下生長發(fā)育差異不明顯，而種質(zhì)GSM03是典型的酸敏感型材料，在pH 3.0下其根系生長受到明顯抑制，根系活力極顯著降低，生長發(fā)育受阻，外觀農(nóng)藝性狀發(fā)生明顯改變。

圖3 種質(zhì)GSM177和GSM03在不同pH下的植株形態(tài)Fig.3 Morphology of GSM177 and GSM03 at different pH levels

不同種質(zhì)圖柱上不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，下同Different lowercase letters on the bar of different germplasms represented extremely significant difference(P<0.01)，the same as below圖4 種質(zhì)GSM177和GSM03在不同pH下的根重Fig.4 Root weight comparison of germplasm GSM177 and GSM03 at different pH levels

圖5 種質(zhì)GSM177和GSM03在不同pH下的根系活力Fig.5 Root activity comparison of germplasm GSM177 and GSM03 at different pH levels

3 討 論

割手密是現(xiàn)代甘蔗品種十分重要的野生型原始種親本，主要用于改良甘蔗新品種的抗性、適應(yīng)性和產(chǎn)量。我國是割手密多樣性分布中心之一，其種質(zhì)資源類型豐富多樣，在抗旱[29]、耐寒[30]，抗病[31]、耐高溫[32]和耐鋁毒[33]等方面均存在豐富的變異類型，在株高、莖數(shù)和錘度等重要農(nóng)藝性狀及葉片蠟質(zhì)數(shù)量和葉片SPAD值等特殊性狀中也具有豐富的變異。俞華先等[34]分析發(fā)現(xiàn)，68份云南割手密F2創(chuàng)新種質(zhì)的變異系數(shù)為10.57%～35.30%。劉建樂等[35]研究揭示43份割手密種質(zhì)資源的變異系數(shù)為9.87%～206.37%。說明割手密種質(zhì)間差異明顯，資源類型豐富，有利于特異種質(zhì)材料的比較和篩選。本研究中，參試的33份割手密在干物率、株高、總莖數(shù)、錘度和固氮酶活性等性狀的平均變異系數(shù)分別為31.73%、37.22%、40.69%、6.77%和59.22%，從中也得出割手密種質(zhì)變異類型豐富的結(jié)論，其中固氮酶活性是變異最大的指標，說明這批割手密種質(zhì)的固氮能力變異潛力較大。可見，具有豐富固氮變異類型的割手密種質(zhì)群體很可能是發(fā)掘固氮基因資源的種質(zhì)資源庫，因此，在甘蔗固氮品種選育上應(yīng)加大對割手密種質(zhì)的利用力度。

俞華先等[34]對68份云南割手密F2創(chuàng)新種質(zhì)進行聚類分析，在歐氏距離10.00處可將其劃分為4個類群，同一類群種質(zhì)的農(nóng)藝性狀特征相似。劉建樂等[35]通過聚類分析，將43份割手密種質(zhì)分為3個類群，不同類群間遺傳關(guān)系與地理來源無必然聯(lián)系，割手密種質(zhì)后代耐旱性強弱與其父本割手密的氣候生態(tài)類型、地理位置和海拔無明顯相關(guān)性。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相似，在歐式距離為8.51處，可將參試割手密分為4個類群，其中，不同割手密材料未能根據(jù)地域來源明顯聚類，但具有較多相同性狀特征的種質(zhì)卻能聚在一起，說明割手密種質(zhì)在自然選擇中發(fā)生了大量基因遷移，使得不同地域來源的材料具有相似性狀。劉新龍[36]對我國6個省9個地區(qū)的171份十倍體割手密種質(zhì)進行聚類分析，結(jié)果表明，表型性狀與采集地的地勢具有一定關(guān)系，高地勢的滇東北地區(qū)和滇西北地區(qū)聚為一個小類群，低地勢的滇東南、滇西南、川東南和廣東地區(qū)聚為一個大類群，本研究結(jié)果與其不一致。究其原因可能是割手密種質(zhì)在長期自然選擇中依不同地勢發(fā)生了適應(yīng)性進化，在相同海拔高度的割手密種質(zhì)已進化出相似的農(nóng)藝性狀特征而聚在一起。

本研究中，在不同pH水平下，耐酸種質(zhì)GSM177的根重和根系活力未受到pH的明顯影響，而酸敏感種質(zhì)GSM03在pH 3.0時的根重和根系活力極顯著低于pH 6.0時，說明在pH 3.0下種質(zhì)GSM03的根細胞分裂和伸長嚴重受阻[37]。

目前，在苜蓿、玉米、大麥和油料等作物中已獲得耐酸(鋁)轉(zhuǎn)基因材料(品種)OsSTAR1/2、OsNrat1、OsFRDL4和OsALS1，MATE基因家族中的SbMATE、ZmMATE、VuMATE和AtMATE基因及ALMT基因家族的AtALMT1基因等也與植物耐酸(鋁)有關(guān)[23-24]，但甘蔗上僅驗證了MATE基因家族中的SbMATE基因?qū)Ω收崮弯X發(fā)揮作用[23]。迄今，各國對甘蔗及其近緣屬的耐酸基因資源發(fā)掘利用滯后，對割手密種質(zhì)耐酸遺傳機制仍一無所知，本研究團隊后續(xù)將開展酸脅迫對種質(zhì)GSM177形態(tài)、生理和分子水平影響的研究，為割手密種質(zhì)耐酸基因的篩選、鑒定和表達提供形態(tài)、生理和遺傳佐證。

4 結(jié) 論

33份割手密種質(zhì)變異類型豐富，種質(zhì)間的干物率與錘度、固氮酶活性與總莖數(shù)呈顯著正相關(guān)，干物率與總莖數(shù)呈顯著負相關(guān)，其余性狀間無明顯相關(guān)性；不同割手密種質(zhì)未能根據(jù)地域來源明顯聚類，但具有較多相同性狀特征的種質(zhì)能聚為一類。GSM177和GSM03是綜合性狀優(yōu)良的固氮型割手密種質(zhì)，其中，GSM03是典型的酸敏感型種質(zhì)，而種質(zhì)GSM177兼具固氮和耐酸特性，應(yīng)加強其在甘蔗育種中的利用。