高玉瓊 李春平 龔紹榮 趙家才 朱新培*

1.云南農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，昆明650212；2.云南省保山市保山豬繁育中心，云南保山678200

保山豬曾用名為保山大耳豬，是“云南六大名豬”之一，近年來因受各種因素的影響，飼養(yǎng)比例和飼養(yǎng)總數(shù)在急劇下降，根據(jù)國家遺傳資源調(diào)查瀕危程度標準界定：保山豬已處于瀕危——維持狀態(tài)。1999年開始，由保山市保山豬繁育中心對保山豬進行保種，但是活體保存需要投入大量的人力、物力和財力，再加上近年來疫情的威脅，活體保存存在一定的風險。豬冷凍精液作為活體保護的補充方式，不僅可以長期保存其遺傳物質(zhì)，實現(xiàn)地方豬遺傳物質(zhì)的靜態(tài)保存，為維持生物多樣性提供條件，還可以通過優(yōu)質(zhì)種公豬精液的交流來建立和增強場間遺傳聯(lián)系和跨群聯(lián)系，克服遠程輸精的困難，最大限度地利用種公豬遺傳物質(zhì)。但豬精子對溫度的變化敏感，國內(nèi)豬精液冷凍損傷的機理研究不足，冷凍保護劑的開發(fā)、冷凍技術、程序設計等環(huán)節(jié)還比較薄弱，豬凍精的生產(chǎn)還不成熟。本試驗的保山豬精液來源是位于保山市施甸縣的保山豬種豬場，因當?shù)夭痪邆渲谱骼鋬黾毠軆鼍臈l件，所以要將鮮精運輸至昆明小哨的云南省家畜冷凍精液站進行制作，豬新鮮精液活力具有時效性，地方品種又具有一定的地域性，因此異地制作保山豬冷凍精液是本試驗的難點。

1 材料與方法

1.1 準備工作

1）工作人員的準備。工作人員應著干凈利落的工作服，指甲剪短磨平，洗凈雙手、擦干，帶上雙層手套，內(nèi)層為聚乙烯手套，外層可戴一次性薄膜手套，以免精液的污染和人畜共患病的傳播。

2）公豬的準備。選擇系譜清楚，記錄完整，本品種特征突出明顯的優(yōu)秀公豬用于采精，提前對種公豬進行調(diào)教馴化，以便人工進行采精。采精時，將公豬趕至采精欄內(nèi)，擠出公豬包皮內(nèi)的尿液，先用溫水沖洗掉包皮周圍的污物，再用溫的0.1%高錳酸鉀溶液清洗腹部和包皮，然后再用溫水沖洗一遍，之后用毛巾擦干。

3）器械的準備。工作人員將集精袋放進集精杯中，將袋口打開，環(huán)套在杯口邊緣，然后將精液過濾膜罩在杯口，用橡皮筋固定住，放在35 ℃的恒溫箱中預熱備用。為避免污染，集精袋和濾膜每頭豬換一個，其他的玻璃器皿、器具也要進行高溫消毒，塑料器具用75%的酒精消毒或紫外線消毒。

1.2 采 精

保山種豬場在繁殖過程中多采用本交，因此人工采精難度大，調(diào)教時間和過程較長，一般采用手握法采精[1]。采精前，取一些母豬陰道分泌物涂抹在假臺畜尾部，以刺激其性欲。采精時，采精人員站在豬的左側(cè)，當公豬爬跨假臺豬，并伸出陰莖龜頭來回抽動，說明公豬性欲已經(jīng)旺盛，待公豬伸出陰莖龜頭時，采精員用手握緊伸出的龜頭，當公豬前沖時順勢將陰莖的“S”狀彎曲拉直，握緊陰莖，同時不斷擠壓。射精過程不可松手、力度適中、盡可能使陰莖與地面保持水平。開始射精時射出的清亮液體部分應棄之，射出白色液體時開始收集。在保山豬采精過程中，經(jīng)常出現(xiàn)采精人員觸摸到公豬龜頭或陰莖時，公豬陰莖便縮回的情況。遇到這種情況，不可強拉或敲打，應再次耐心引導，直至采精成功。采精結(jié)束后，先將濾膜及其上面部分丟棄，再將杯口外的集精袋撕去，蓋上蓋子，送入精液處理室進行處理。

1.3 鮮精的檢查和處理

鮮精的質(zhì)量不僅可以反映公豬的飼養(yǎng)管理水平和身體機能狀況，也能反映出采精人員的技能水平，更重要的是，在保山豬冷凍保存過程中，鮮精的質(zhì)量直接決定著凍后的精液質(zhì)量。鮮精的檢查主要鑒定鮮精的質(zhì)量，以判斷是否具有進行冷凍保存的實際意義。

1）鮮精的顏色和氣味。鮮精的顏色一般為乳白色，略帶腥味。精液中有時會有白色或灰白色絮狀物，一般可通過過濾去除。當精液顏色異?；驇в刑厥獬粑稌r，不宜留用。

2）精液量。為了避免精液轉(zhuǎn)移引起精子損傷，用電子秤按1 mL=1.0 g 計算其采精量[2]。

3）活力。取10 μL 精液置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400 倍顯微鏡下觀察直線運動精子數(shù)占總精子數(shù)的比列，至少觀察3 個視野，取平均值，鮮精活率需達65%以上方可用于制作凍精。

4）密度。采用精子密度儀進行密度測量，一般按照相應的操作規(guī)程即可。

5）精液的預處理。提前將原精稀釋液放置于35 ℃的水浴鍋中備用，待鮮精檢查合格后，按1∶1比列將原精稀釋液緩緩沿杯壁導入精液中。如果原精密度較高，可將原精稀釋液分2 次加入。稀釋好的精液先在室溫條件下放置1 h，然后再放入17 ℃的冰箱平衡2 h。

1.4 運 輸

本試驗中精液從保山市保山豬繁育中心送至客運站，通過大巴車運送到昆明西站，再從西站運至冷凍精液站進行制作，運輸過程長達12 h 以上。運輸前，準備好一個泡沫箱，在泡沫箱中放置適量的冰袋，蓋上蓋子靜置30 min，維持箱內(nèi)溫度恒定于12～17 ℃。然后將精液分裝在豬精液輸精瓶中，為避免運輸中搖晃震動帶來的精子損傷，盡量將輸精瓶裝滿，然后將輸精瓶裝入黑色塑料袋中扎緊，避免搖晃。每頭豬的精液分裝在一個塑料袋中，并做好標記，放置在泡沫箱中，蓋上蓋子，用膠布密封好。冰袋和精液需用干凈紙或者毛巾隔開，避免直接接觸冰袋[2]。

1.5 精液二次檢查

精液運至冷凍精液站后應及時進行處理，進行第二次精液質(zhì)量的檢查，主要是測量精液量、密度和活力。計算精液量時用每瓶輸精瓶的精液量乘以數(shù)量即可，密度和活力的檢查方法和原精一致，并做好記錄，活力低于60%的不再留用。

1.6 離 心

經(jīng)測量后達到要求的精液倒入50 mL 的離心管中，放置于離心機中以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min。然后倒去上清液，并測量上清液的密度和體積，如果上清液中總精子數(shù)多于10 億，需再次離心。

1.7 第二、三次稀釋和細管凍精制作

根據(jù)密度再進行2 次稀釋，所用稀釋液為Ⅰ和Ⅱ液，本試驗選取5 個稀釋液配方，分別編號1、2、3、4、5，Ⅰ液中不含甘油，Ⅱ液中含甘油，其他成分相同。為了篩選適宜的活性劑，試驗選取一個稀釋液配方，在該配方中加入Equex 膏(氨基鈉-十二烷硫酸脂)、OEP、十二烷基磺酸鈉（SDS）3 種不同的活性劑，最后根據(jù)試驗數(shù)據(jù)進行分析。稀釋時Ⅰ、Ⅱ液的加入量相同，均為總稀釋量的一半?？傁♂屃?（密度×精液量-上清液中精子數(shù)）/目標密度，本試驗中目標總精子數(shù)為6 億/mL。稀釋時將Ⅰ液緩慢分加到離心沉淀后的離心瓶中，用一次性滴管以不斷吸吐的方式混懸精子，然后幾個離心瓶中的精液合并，在用Ⅰ液沖洗，再合并，并做好標記。將標記好的精液放入4 ℃的冰箱中平衡3～4 h，然后用4 ℃Ⅱ液進行第三次稀釋，稀釋方法和稀釋液的數(shù)量和第二次稀釋相同，稀釋后搖勻。然后4 ℃的環(huán)境條件下用細管分裝機進行細管分裝，并在細管上標記制作日期、豬的品種、耳號等信息。將分裝好的細管平鋪在細管架上，再將細管架置于盛有液氮的液氮槽中，液氮槽中液氮的高度不能太低，細管距離液氮面3～5 cm，蓋上蓋子冷凍13 min。冷凍后再進行1 次活力的檢測，檢測前取1 支細管凍精在37 ℃的水浴鍋中進行解凍，然后在400 倍的顯微鏡下進行觀察檢驗活力，方法同上，活力低于30%者不能保存，其他的做好標記裝袋浸入液氮中進行保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 采精情況

保山豬以本交為主，人工采精比較困難，需要用發(fā)情母豬誘導刺激才能采集到精液，采精環(huán)境要求安靜，固定采精員，采精技術嫻熟才能順利采到精液。

2.2 保山豬的精液品質(zhì)

1）保山豬原精液品質(zhì)。保山豬精液品質(zhì)良好，保山豬采精量為（215.69±66.40）mL，原精活力（64.68±5.57）%，精子密度（1.23±0.62）億/mL，8 個家系9 頭不同個體精液品質(zhì)詳見表1。

表1 不同個體保山豬精液品質(zhì)指標比較[3]

2）保山豬冷凍精液品質(zhì)。保山豬細管凍精解凍活力均在30%以上，符合全國畜牧總站畜禽遺傳資源保存利用中心的要求，平均解凍活力為（34.92±4.59）%，解凍后精子頂體完整率為（48.27±8.11）%，畸形率為（9.07±5.12）%。

3）不同冷凍稀釋液的效果。本試驗選取5 種不同稀釋液配方，經(jīng)分析，不同稀釋液配方對原精活力、解凍活力、正常頂體率、精子畸形率的影響差異不顯著（表2）。

表2 不同稀釋液對保山豬精液冷凍效果的比較 %

3 討 論

豬精液對溫度變化敏感，運輸距離遠，精液保存時間較長，實施異地制作和冷凍保存，公豬精液采集后必須盡快用營養(yǎng)液稀釋并在17 ℃恒溫保存，做好精液的保溫隔熱，豬精液不能與冷源直接接觸，每份精液間要相對隔開，不能堆擠，避免激烈震動和溫度變化，豬精液送達后及時加工制作。

3.1 異地制作保山豬冷凍精液切實可行

通過本研究結(jié)果得出，公豬采精后用營養(yǎng)稀釋液稀釋、17 ℃恒溫保存、運輸、24 h 內(nèi)異地制作保山豬凍精，凍精質(zhì)量良好，解凍活力30%以上，符合保存使用要求，為地方優(yōu)良品種遺傳物質(zhì)保存提供可靠技術和便捷途徑。

3.2 篩選出效果良好的冷凍稀釋液

種公豬精液常（低）溫保存技術已經(jīng)比較成熟，稀釋液是影響冷凍效果的重要因素[4]，專用稀釋劑保存效果良好，在17 ℃恒溫下可保存1～7 d；該項目研究得出1 號和4 號配方冷凍解凍活力和頂體完整率均高于2 號、3 號和5 號配方，1 號和4 號配方冷凍解凍活力和頂體完整率達到進口稀釋液的效果，可大幅節(jié)約凍精制作成本。

3.3 優(yōu)選獲得效果較好的活性劑

試驗得出：活性劑Equex 膏（氨基鈉-十二烷硫酸脂）的效果好于OEP 和十二烷基磺酸鈉（SDS），SDS 使用效果較差，但差異不明顯。

保山豬冷凍精液異地制作技術可作為活體保種的有效補充方式，不僅可以長期保存其遺傳物質(zhì)，實現(xiàn)地方豬遺傳物質(zhì)的長期安全保存，為維持生物多樣性提供條件，而且還可以通過優(yōu)質(zhì)種公豬精液的交流來建立和增強場間遺傳交流和跨群聯(lián)系，防止疾病傳播和疫病危害，克服活體遠程運輸?shù)睦щy，最大限度地保護和利用優(yōu)良種公豬遺傳品質(zhì)。