劉燕, 馬清昌, 徐偉, 狄海萍

開封市中心醫(yī)院 1醫(yī)學(xué)檢驗科， 2燒傷整形科， 3骨科(河南開封 475000)； 4鄭州市第一人民醫(yī)院燒傷中心(河南鄭州 450004)

燒傷作為一種復(fù)雜的損傷形式，可導(dǎo)致機體生理紊亂，患者表現(xiàn)為皮膚功能受損、體液丟失、組織壞死、細菌移位等，患者極易發(fā)生感染，感染是導(dǎo)致病死率升高的主要原因[1]。但由于感染癥狀不明顯，不具有典型性和特異性，在早期診斷中很難發(fā)現(xiàn)，增加了風(fēng)險[2]。因此，發(fā)現(xiàn)與燒傷感染相關(guān)的基因?qū)τ诩霸缭\斷燒傷患者感染具有較高價值。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)作為天然免疫模式識別受體，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠識別受損組織和壞死細胞釋放的內(nèi)源性病原分子，進而促進炎癥反應(yīng)[3]；淋病奈瑟菌能夠?qū)е氯祟愖訉m內(nèi)膜上皮感染損傷，抑制TLR4可減少感染誘導(dǎo)的細胞凋亡和炎癥，可能成為減少人子宮內(nèi)膜上皮淋病奈瑟菌感染的治療方法[4]。髓樣細胞觸發(fā)受體1(triggering receptor expressed on myeloid cell 1，TREM1)屬于免疫球蛋白超家族，是先天免疫效應(yīng)細胞的模式識別受體之一，作為炎癥的上游因子，胞外細菌、脂多糖等均可促進TREM1上調(diào)[5]；在膿毒癥中表達上調(diào)，從而誘發(fā)肺損傷等并發(fā)癥[6]。進一步發(fā)現(xiàn)，激活TREM1后能夠激活TLR4通路直接或間接放大炎性反應(yīng)，從而參與多種急、慢性炎癥疾病過程[7]。但目前少見兩者在燒傷患者中的相關(guān)研究。因此，本研究檢測TLR4、TREM1在燒傷感染患者血清中的表達情況并探究其診斷價值，以期為臨床上及早發(fā)現(xiàn)影響燒傷患者感染的基因提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2018年6月至2021年3月本院78例燒傷科住院病例為研究對象(研究組)，男47例、女31例，年齡19～73歲、平均(37.48±7.92)歲；同期健康體檢者80例作為對照(對照組)，男50例、女30例，年齡20～75歲、平均(39.41±8.17)歲。兩組性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。研究組燒傷原因：熱液燒傷42例、火焰燒傷21例、電燒傷12例，其他3例。燒傷面積：燒傷面積≥30% 11例、10%≤燒傷面積<30% 21例、燒傷面積<10% 46例。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)燒傷24 h內(nèi)就醫(yī)；(2)患者成年；(3)本研究患者知情并同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院72 h內(nèi)死亡患者；(2)存在心肌梗死、腦出血、惡性腫瘤等重大疾病患者；(3)入院前使用抗生素患者；(4)哺乳期婦女或孕婦。對照組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無發(fā)熱感染等癥狀；(2)心、肝、腎功能正常；(3)白細胞計數(shù)正常。

研究組分為3個亞組：膿毒癥患者為重癥感染組(n=18)，男10例、女8例，年齡23～70歲、平均(37.85±8.13)歲，燒傷面積≥30% 3例、10%≤燒傷面積<30% 6例、燒傷面積<10% 9例；局部感染為局部感染組(n=37)，男21例、女16例，年齡19～71歲、平均(37.62±7.81)歲，燒傷面積≥30% 5例、10%≤燒傷面積<30% 10例、燒傷面積<10% 22例；單純燒傷未發(fā)生感染為未感染組(n=23)，男16例、女7例，年齡20～73歲、平均(36.97±8.16)歲，燒傷面積≥30% 3例、10%≤燒傷面積<30% 5例、燒傷面積<10% 15例。3組性別、年齡及燒傷面積情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。膿毒癥符合燒傷膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]：(1)臨床表現(xiàn)為精神抑郁、煩躁或譫語，出現(xiàn)腹脹、腹瀉或消化道出血癥狀，舌質(zhì)絳紅、毛刺，干而少津；(2)體溫>39℃或<35.5℃，連續(xù)3 d；(3)氣促>28次/min；(4)心率>120次/min；(5)白細胞計數(shù)>12×109·L-1或<4×109·L-1，其中中性粒細胞百分比>80%或幼稚粒細胞百分比>10%。符合第1條中任何一項加后4項中任何2項即確診為燒傷膿毒癥。局部感染診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床表現(xiàn)為：體溫升高(最高≤38℃)或降低(最低≥36℃)，白細胞計數(shù)升高(最高≤12×109·L-1)或降低(最低≥4×109·L-1)、中性粒細胞計數(shù)升高(最高≤7×109·L-1)或降低(最低≥2×109·L-1)等，但不符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)具有明顯感染癥狀：局部紅、腫、熱、痛、創(chuàng)面有膿性分泌物、異味等；(3)創(chuàng)面細胞培養(yǎng)呈陽性、血培養(yǎng)呈陰性。符合上述標(biāo)準(zhǔn)為局部感染。單純燒傷未感染標(biāo)準(zhǔn)：(1)臨床指標(biāo)：36.3℃≤體溫≤37.7℃、白細胞計數(shù)及中性粒細胞在正常范圍內(nèi)且波動不大；(2)一般情況良好，創(chuàng)面以滲出為主，未見明顯感染癥狀；(3)創(chuàng)面及血培養(yǎng)均為陰性。符合上述標(biāo)準(zhǔn)為單純創(chuàng)傷未感染。

本研究經(jīng)本院倫理委員會審核并通過(2018021)。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中TLR4、TREM1水平 單純燒傷患者、重癥感染者及局部感染者、健康體檢者分別于入院當(dāng)天、獲得臨床診斷當(dāng)天、體檢當(dāng)天空腹抽取靜脈血5 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，上清備用。嚴(yán)格按照人TLR4、TREM1 ELISA試劑盒(英國abcam公司，貨號分別為：ab277392、ab270884)說明書檢測血清中TLR4、TREM1水平。

2 結(jié)果

2.1 研究組、對照組血清中TLR4、TREM1水平情況 與對照組相比，研究組血清中TLR4、TREM1水平升高(P<0.05)。見表1。

表1 研究組、對照組血清中TLR4、TREM1水平比較

2.2 重癥感染組、局部感染組、未感染組血清中TLR4、TREM1水平情況 與重癥感染組相比，局部感染組、未感染組血清中TLR4、TREM1水平降低(P<0.05)；與局部感染組相比，未感染組血清中TLR4、TREM1水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 重癥感染組、局部感染組、未感染組血清中TLR4、TREM1水平比較

2.3 燒傷患者血清中TLR4與TREM1的關(guān)系 血清中TLR4與TREM1呈正相關(guān)(r=0.526，P<0.05)。見圖1。

圖1 燒傷患者血清中TLR4與TREM1的相關(guān)性

2.4 血清TLR4、TREM1水平對燒傷患者感染的診斷價值 因重癥感染組、局部感染組均發(fā)生感染，將兩組數(shù)據(jù)合并，通過ROC曲線探究血清TLR4、TREM1水平對燒傷患者感染與否的診斷價值。ROC曲線顯示，血清TLR4水平預(yù)測燒傷患者感染的ROC曲線下面積為0.825(95%CI:0.732～0.918)，截斷值為4.686 ng/mL，其敏感度為65.45%、特異度為91.30%、準(zhǔn)確度為73.08%；血清TREM1水平預(yù)測燒傷患者感染的ROC曲線下面積為0.801(95%CI:0.699～0.916)，截斷值為242.482 ng/L，其敏感度為81.82%、特異度為69.57%，準(zhǔn)確度為78.21%；兩者聯(lián)合預(yù)測燒傷患者感染的ROC曲線下面積為0.911(95%CI:0.829～0.973)，敏感度為87.27%、特異度為86.96%、準(zhǔn)確度為87.18%。見圖2。血清TLR4水平與TLR4+TREM1 ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=1.438，P=0.075)；與血清TREM1水平相比，TLR4+TREM1 ROC曲線下面積升高(Z=1.659，P=0.048)。血清TLR4水平敏感度、準(zhǔn)確度均低于TLR4+TREM1(P<0.05)。見表3。

圖2 血清TLR4、TREM1水平預(yù)測燒傷患者發(fā)生感染的ROC曲線

表3 血清TLR4、TREM1水平及兩者聯(lián)合對燒傷患者感染的診斷價值的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度比較 %

3 討論

燒傷是常見的創(chuàng)傷性疾病，會導(dǎo)致患者機體免疫功能及抵抗力低下，細菌等乘虛而入，引起局部或全身感染，從而減慢傷口愈合，嚴(yán)重患者會出現(xiàn)多器官臟器功能衰退，其中膿毒癥作為大面積燒傷感染的主要并發(fā)癥之一，影響患者生命安全[9]。且在治療過程中，感染貫穿燒傷治療的全過程，可能因感染而加重，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡。因此，尋找與燒傷感染關(guān)系密切的基因，及早發(fā)現(xiàn)感染并對應(yīng)治療對于疾病意義重大。

在本研究中檢測燒傷感染患者血清中TLR4、TREM1的表達水平，以期早期發(fā)現(xiàn)燒傷患者感染，為患者治療提供一定參考依據(jù)。TLR4在非特異性免疫細胞和特異性免疫反應(yīng)的T、B淋巴細胞表面，是炎癥信號傳遞的門戶，在免疫防疫過程中發(fā)揮重要作用，且免疫系統(tǒng)在過敏反應(yīng)、微生物感染、腫瘤免疫等方面均發(fā)揮重要作用[10-11]。TLR4作為經(jīng)典的炎癥通路，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3部分組成，胞外區(qū)富含亮氨酸，能與CD14分子中的亮氨酸重復(fù)序列結(jié)合從而介導(dǎo)蛋白質(zhì)之間的相互作用，胞內(nèi)區(qū)存在與IL-1受體結(jié)合的高度保守序列，該序列是與下游信號傳導(dǎo)分子、蛋白激酶相互作用的關(guān)鍵部位，當(dāng)細菌或微生物感染時，病原菌及其成分與靶細胞膜上TLR4結(jié)合后跨膜信號通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域激活轉(zhuǎn)錄因子，進而引起多種炎癥因子表達，發(fā)生炎癥發(fā)應(yīng)，這是創(chuàng)面皮膚傷口愈合緩慢的原因之一[12]。在澳大利亞紅桿菌引起的感染中激活巨噬細胞中的ASC炎癥小體會誘發(fā)炎癥反應(yīng)，TLR4-/-小鼠骨髓源性巨噬細胞中炎癥因子水平下降可降低澳大利亞紅桿菌的感染效果[13]；燒傷大鼠模型中下調(diào)TLR4可抑制腎臟炎癥從而預(yù)防燒傷誘導(dǎo)的早期急性腎損傷[14]。TREM1作為多核細胞炎癥受體，被稱為炎癥因子放大器，可應(yīng)答內(nèi)源性和外源性危險信號，從而協(xié)同和放大TLR4介導(dǎo)的信號通路，誘導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生，加強炎癥反應(yīng)過程[15]。哥倫比亞人群瘧疾中TREM1出現(xiàn)基因突變與瘧疾的易感性關(guān)系密切，參與免疫過程[16]。

本研究中燒傷患者血清中TLR4、TREM1表現(xiàn)出高表達；提示燒傷可能誘導(dǎo)機體各項功能發(fā)生變化，進而影響TLR4、TREM1水平。在燒傷患者中，部分患者出現(xiàn)局部感染，部分出現(xiàn)嚴(yán)重感染導(dǎo)致膿毒癥產(chǎn)生，患者感染越嚴(yán)重，血清中TLR4、TREM1水平越高，提示燒傷感染患者中微生物等感染可能與靶細胞膜上TLR4結(jié)合后跨膜信號通過胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域激活TREM1的表達，從而擴大炎癥反應(yīng)，進而延緩傷后愈合。進一步研究表明，在燒傷患者中TLR4與TREM1呈正相關(guān)，且兩者聯(lián)合診斷對燒傷患者感染具有更高的診斷價值；提示TREM1能夠協(xié)同和放大TLR4介導(dǎo)的信號通路，進而誘導(dǎo)炎癥過程。且燒傷患者血清中TLR4水平高于4.686 ng/mL、TREM1水平高于242.482 ng/L在臨床上應(yīng)該受到重視，患者感染的概率升高。TLR4+TREM1 ROC曲線下面積高于血清TREM1 ROC曲線下面積；敏感度、準(zhǔn)確度高于血清TLR4敏感度、準(zhǔn)確度；兩者聯(lián)合診斷可使診斷價值更高，綜合兩者指標(biāo)對于燒傷患者感染更有價值。

綜上所述，燒傷感染患者血清中TLR4、TREM1水平升高，兩者關(guān)系密切，且對燒傷患者感染與否有一定診斷價值。但受樣本例數(shù)限制，本研究結(jié)果可能與實際情況存在一定偏差，擴大樣本量進一步研究是本研究接下來研究重點。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻說明：馬清昌負責(zé)研究設(shè)計、實施、資料收集和論文撰寫及修訂，劉燕和徐偉、狄海萍負責(zé)研究實施、資料收集和數(shù)據(jù)分析。