陳婷婷， 張新友， 周繼豪

暨南大學第二臨床醫(yī)學院血液內科(廣東深圳 518000)

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuselarge bcell lymphoma，DLBCL)是一組在細胞形態(tài)、免疫表型、分子生物學、臨床特點以及治療反應等諸多方面表現(xiàn)出高度異質性的腫瘤[1]。如何對DLBCL這種特殊的非霍奇金淋巴瘤(NHL)進行合理的分類以指導精準治療，是淋巴瘤研究領域的熱點話題，本文將結合基因表達譜技術、免疫組織化學及基因突變譜技術的進步，就近年來DLBCL的臨床和分子分型方面的研究進展進行綜述。

1 DLBCL基因表達譜分類

基因表達譜技術(gene expression profiling，GEP)是建立在基因探針和雜交測序技術上的一種高效快速的核酸序列分析手段。該技術出現(xiàn)后成為基因組及后基因組時代科學研究的重要手段。GEP揭示了決定淋巴瘤生物學和臨床行為的關鍵分子事件，開啟了DLBCL精準分型的時代[2-4]。2000年，Alizadeh等[5]學者采用cDNA微陣列技術，通過分析B細胞分化不同階段的標志性基因表達的模式，首次將DLBCL區(qū)分為兩個亞型，一種表達生發(fā)中心B細胞(GCB)特征性的基因；第2種表達基因通常是在外周血B細胞體外活化(ABC)過程中誘導表達的基因。GCB亞型DLBCL的患者預后顯著優(yōu)于ABC亞型的患者。2002年Rosenwald等[6]學者使用cDNA芯片檢測240例DLBCL患者應用以蒽環(huán)類為基礎化療方案治療前的基因表達情況并分析基因組異常，不僅同樣得出結論GCB亞型預后優(yōu)于ABC亞型，還提出了第3型(type3)的概念，所謂第3型的DLBCL無法用細胞起源來分型，其基因表達譜特性介于GCB亞型和ABC亞型之間，至于第3型能否作為獨立分型，現(xiàn)在仍存在爭議。這種基于GEP分析，從而確定DLBCL腫瘤細胞起源的分型方法，被稱為COO(cell of origen)分型。

雖然GEP開創(chuàng)了DLBCL分型的新時代，但是在面向臨床推廣應用的過程中，研究人員卻發(fā)現(xiàn)了一系列的困難。首先，微陣列技術需要新鮮或冰凍標本以提取足夠的RNA，但臨床上往往難以保證標本送檢的時效性。2012年，Barrans等[7]學者建立了從福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織中提取RNA和反轉錄cDNA的方法，使得臨床石蠟包埋標本也可以進行GEP分析；其次，基因表達譜檢測建立在基因芯片的基礎上，由于傳統(tǒng)的基因芯片技術要求核酸量較多，且價格昂貴，所以GEP技術也難以在臨床推廣。2014年，Scott等[8]學者首次報道利用NanoString數(shù)字基因定量技術對石蠟包埋組織的基因表達譜進行檢測。該技術可直接檢測探針標記的單個mRNA轉錄子并進行定量，所需RNA量少、無需酶促反應和PCR擴增過程，適合大批量檢測，敏感性和準確性與實時熒光定量PCR相當，因此特別適用于臨床樣本的基因表達譜檢測。研究者設計了針對20個基因表達的Lymph2Cx表達譜芯片，可對石蠟包埋標本進行精確的表達譜分析，與傳統(tǒng)基因芯片方法的檢測一致性達到98%以上。但是，一方面，Lymph2Cx所涉及的基因是基于高加索人種DLBCL患者而得出的實驗室結果，在中國患者中的準確性仍有待驗證；另一方面，由于該設備和耗材仍然相對昂貴，保養(yǎng)維護困難，且目前國內缺乏相應的收費標準，因此也尚未在臨床上廣泛普及。

2 DLBCL免疫組織化學分型

雖然基于基因芯片法的基因表達譜分析是DLBCL分型的金標準，但是由于前文提及的缺陷，其難以在臨床上推廣普及。為了將GEP分型的結論以廉價簡便的方式應用于臨床，有學者致力于利用免疫組織化學染色(IHC)的方法，通過建立特殊算法來間接提示GEP分型，從而指導臨床實踐[3]。2004年Hans等[9]學者以cDNA微陣列為金標準，使用3個分子標志物：CD10、BCL6及MUM1/IRF4進行分類：CD10(+)為GCB類，當CD10(-)且BCL-6(-)則為non-GCB類：若CD10(-)且BCL-6(+)則需檢測MUM1/IRF4，若MUM1(+)則為non-GCB類，反之為GCB類DLBCL。該研究發(fā)現(xiàn)入組患者中42%是GCB亞型，58%被認為是non-GCB亞型，且Hans法分類與臨床預后密切相關，GCB組和non-GCB組5年OS率分別為76%和34%。以上結論與使用cDNA微陣列作為金標準得出的結果一致性高達86%。之后Choi等[10]學者使用CD10、BCL6、MUM1、GCET1和FOXP1這5個生物標記抗體對接受R-CHOP方案一線治療的DLBCL患者進行分類，新加入的GCET1抗體既可以區(qū)別GCB亞型和non-GCB亞型，同時也提示DLBCL較好的臨床預后。FOXP1抗體是非NHL重現(xiàn)性染色體易位的靶點之一，該蛋白高表達提示預后不良。Choi分類能預測的GCB亞型的3年OS率為87%，而non-GCB亞型3年OS為44%。Choi分類與GEP的一致性為93%，顯著高于Hans法的84%。因此Choi法能更加準確地預測DLBCL患者的風險分層。但是Choi分類需要5種抗體，其中GCET1和FOXP1這兩種抗體在大多數(shù)病理科免疫組織化學實驗室不常用，所以此分類方法在臨床上應用較為困難。此外，2011年，Meyer等[11]學者又提出了Tally分類，該分類使用了5種標志物：CD10、GCET1、FOXP1、MUM1 和 LOM2，其與 GEP的一致性高達93%，也優(yōu)于Hans法。但是類似于Choi分類，一方面Tally分類中使用的3種生物標記物GCET1、FOXP1和 LM02在很多免疫組織化學實驗室中并不常備；另一方面由于部分腫瘤組織對GCET1、FOXP1和LM02三類抗體會顯示高背景或非特異性染色，導致不同的實驗室對這3個抗體染色結果的判讀缺乏統(tǒng)一標準，所以Tally法也沒有能夠得到廣泛采用。

目前Hans法仍然是免疫組織化學判斷COO分型的主流手段。美中不足的是，首先，以上介紹的3種主要的免疫組織化學分型來源的主要研究對象是西方人群，而在西方人群中GCB亞型所占比例高于亞洲人群；其次，以上介紹的COO分型方法，入組分析的都是利妥昔單抗時代之前的病例，接受利妥昔單抗治療的病例比例較低。因此對于采取R-CHOP方案一線治療的亞洲DLBCL患者來說，DLBCL分子亞型對其治療結果的預測作用是否一樣準確，目前仍存在爭議[9]。例如Lee等[12]學者就曾經(jīng)通過IHC和Lymph2Cx兩種方法，對384例東南亞地區(qū)DLBCL患者的COO分型的預后進行了單中心回顧性分析。所有患者都接受R-CHOP樣方案一線治療。結果發(fā)現(xiàn)Hans分類的non-GCB型和 GCB型的5年OS率分別為70%和71%，而Lymph2Cx方法區(qū)分出的ABC型與GCB型的5年OS率分別為74%和92%。Hans分類的non-GCB型和GCB型的5年PFS率分別為65%和70%；而Lymph2Cx方法的ABC型與GCB型的5年PFS率分別為64%和86%。該研究提示在如今利妥昔單抗治療時代的東亞人群患者中，Hans法確定的細胞起源不一定有明確的預后意義，而通過Lymph2Cx的亞型分析則同樣顯示出GCB亞型具有更好的PFS和OS率。

3 DLBCL基因突變譜分型

隨著二代測序技術的進步，各種研究發(fā)現(xiàn)在DLBCL樣本中存在大量重現(xiàn)性突變，且鑒定出多個淋巴瘤相關驅動基因突變[13-14]。研究者逐漸認識到，基因表達譜的不同，其內在本質是源于基因突變譜上的差異[15]。因此，在COO分型的基礎上，研究者開始探索基于基因突變譜的分型方法，希望更深入揭示不同DLBCL亞型的分子生物學本質[16]。2018年，Schmitz等[17]學者發(fā)現(xiàn)根據(jù)基因突變、易位及拷貝數(shù)異常等特征，DLBCL可以分為不同的基因亞型。為了驗證這個結論，學者們收集了574例DLBCL患者的新鮮冰凍活檢標本，基于陣列的DNA拷貝數(shù)分析和372個基因的深度擴增重測序，使用外顯子和轉錄組測序技術來識別具有重現(xiàn)性突變的基因，最終確定了4種相對獨立的基因亞型，分別命名為MCD型(基于MYD88L265P和CD79B共突變?yōu)樘卣?、BN2型(基于BCL6融合及NOTCH2突變?yōu)樘卣?、N1型(基于NOTCH1突變)和EZB型(基于EZH2突變及BCL2易位)。且進一步發(fā)現(xiàn)，不同的COO亞型往往對應于不同的基因突變譜亞型。在GCB亞型中，EZB型的比例較高，而MCD型和N1型更常見于ABC亞型，BN2型在ABC、GCB及type3型均可發(fā)現(xiàn)。這些不同基因亞型的患者在接受一線R-CHOP方案免疫化療后在PFS率和OS率方面存在顯著差異：BN2和EZB亞型病例預后良好，而MCD和N1亞型病例預后不佳。MCD、N1、BN2和EZB亞型的預測5年OS率分別為26%、36%、65%和68%。多變量分析發(fā)現(xiàn)，不同基因亞型間的IPI評分差異其實并不顯著，但新的基因亞型分類能獨立地預測DLBCL患者的生存率。

同Schmitz幾乎同一時間，Chapuy等[18]學者對304例B細胞淋巴瘤患者的低頻重現(xiàn)性突變、體細胞拷貝數(shù)改變和結構變異進行聚類分析，整合基因驅動因素，最終確定了5種大B細胞淋巴瘤亞群。C1型多屬于ABC亞型，主要為TNFAIP3、NOTCH2、SPEN、CD70、B2M、PD-1配體突變及BCL-6、BCL-10易位，多與邊緣區(qū)淋巴瘤相關[19-20]；C2型與ABC、GCB亞型無關，主要為TP53雙等位基因失活、9p21.13/CDKN2A和13q14.2/RB1的拷貝丟失，從而影響染色體穩(wěn)定性和細胞周期[21]；C3型多屬于GCB亞型，主要為BCL2、CREBBP2、EZH2、KMT2D及TNFRSF14突變，多見于de novo GCB型DLBCL和濾泡型淋巴瘤[22]；C4型多屬于GCB亞型，主要為多種免疫逃逸分子(CD83、CD58和CD70)、BCR/Pi3K信號中間體(RHOA、GNA13和SGK1)、NF-κB修飾因子(CARD11、NFKBIE和NFKBIA)和RAS/JAK/STA T通路 (BRAF和STAT3)發(fā)生突變，多見于濾泡性淋巴瘤[22-24]；C5型多屬于ABC亞型，主要為BCL-2、CD79B、MYD88L265P、PIM1、BTG1和ETV6突變，多見于原發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及睪丸DLBCL[25-26]；C0型(少數(shù)病例無法分到C1～C5型中)主要為炎癥或者免疫細胞彌漫性浸潤，但缺乏明確的遺傳驅動因素，多見于富于T細胞或組織細胞的大B細胞淋巴瘤[27]；研究表明不同亞型之間的預后指數(shù)也存在明顯差異，如同屬于ABC亞型的C1和C5亞型，C1型的PFS率優(yōu)于C5型，而同屬于GCB亞型的C3型和C4型，C4型的PFS率明顯高于C3型。綜上所述，這項研究從基因水平上更加精細地區(qū)分了GCB和ABC亞型，從而得知C0、C1和C4亞型患者的預后較好，而C2、C3及C5亞型，尤其是C3、C5這兩個亞型預后更差。

2020年，Wright等學者將以上兩項的2018年基因譜分析文獻結果匯總分析[17-18]，針對DLBCL的遺傳亞型進一步建立了LymhGen算法。這種基因亞型的概率分類方法是根據(jù)DLBCL的致癌途徑、基因表達表型、腫瘤微環(huán)境、治療后存活率及潛在治療靶點，在先前Schmitz的4種基因分類基礎上作了補充，增加了A53亞型(具有TP53失活的非整倍體)和ST2亞型(以SGK1、TET2及P2RY8突變?yōu)橹?，均屬于ABC 亞型。由于一些DLBCL病例具有復雜且獨特的特征，在建立LymhGen算法的包括574例DLBCL患者的研究中，只有329例(63.1%)病例可以明確其基因亞型(包括“核心”、“延伸”以及“組合”亞型)。這幾種遺傳亞型揭示了DLBCL與惰性淋巴瘤的潛在致病關系：BN2亞型類似于邊緣性淋巴瘤(MZL)；EZB亞型與濾泡性淋巴瘤(FL)相關；以DUSP2、SGK1和JUNB為主高度重復突變的ST2亞型，與結節(jié)性淋巴細胞為主型霍奇金淋巴瘤(NLPHL)和富含T細胞/組織細胞的大B細胞淋巴瘤(THRLBCL)具有很強相似性[28]。值得注意的是，MCD亞型經(jīng)常會涉及結外器官，如中樞系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、睪丸、乳房等部位。學者們?yōu)轶w現(xiàn)“雙打擊淋巴瘤”基因表達印記特征，根據(jù)MYC基因有無重排又將EZB進一步分為EZB(-)MYC(-)和EZB(-)MYC(+)兩個亞型。由于ST2、BN2、N1及A53型多在EZB(-)MYC(-)亞型出現(xiàn)，而EZB(-)MYC(+)亞型中的往往表現(xiàn)為伯基特淋巴瘤(BL)[29]，而EZB(-)MYC(-)比EZB(-)MYC(+)有更好的生存率，因此可將EZB(-)MYC(+)亞型視為EZB(-)MYC(-)亞型的某種轉化。在該研究中，進一步闡述了不同的亞型對應于不同的潛在治療靶點。BCR依賴性NF-κB通路活化在BN2、MCD和A53亞型最為常見，故該亞型對以伊布替尼為代表的BTK抑制劑具有高度敏感性[30]；MCD、BN2、ST2、EZB亞型通常與PI3K通路相關，故可以嘗試用PI3K抑制劑；而另外一些MCD、BN2、EZB亞型與BCL-2高表達相關，可能在未來可以試用BCL-2抑制劑；EZB型也可以應用EZH2抑制劑治療。LymhGen算法通過基因突變譜來推斷DLBCL亞型，并提示不同患者的發(fā)病機制和治療敏感性，為將來的臨床研究提供了可靠的分型基礎[31]。

4 復發(fā)/難治性DLBCL基因組的克隆演化

由于DLBCL在臨床特征、免疫表型、分子遺傳等方面的異質性，盡管以R-CHOP為代表的標準一線治療方案取得很大成功[32]，但仍有部分患者出現(xiàn)復發(fā)、進展甚至死亡。為了探索復發(fā)/難治性彌漫性大B細胞淋巴瘤(relapsed and refractory DLBCL，R/R DLBCL)治療耐藥的分子機制并識別候選基因，Lee等[33]學者對58例R/R DLBCL患者的430個淋巴瘤相關基因進行了靶向深度測序，發(fā)現(xiàn)最頻繁突變(>20%)的基因是CDKN2A、PIM1、CD79B、TP53、MYD88、MYC、BTG2、BTG1、CDKN2B、DTX1、CD58、ETV6和IRF4。與較低的OS率相關的基因突變主要包括NOTCH1、FGFR2、BCL7A、BCL10、SPEN和TP53(P<0.05)。FGFR2、BCL2、BCL6、BCL10和TP53與較短的PFS率相關。為了進一步了解DLBCL的克隆演化規(guī)律，該研究還比較了18例患者的R-CHOP治療前和治療后復發(fā)/難治二次活檢的樣本，得出3個重要結論：(1)CXCR4、MEF2B和DUSP2突變傾向于化療后首次在主克隆中出現(xiàn)；(2)NCOR2、GNAS、EBF1、FOXP1、RUNX1、PCLO、CD58、RICTOR、CREBBP等體細胞拷貝數(shù)改變在化療后有增加的趨勢；(3)MYD88、CD79B等NF-κB通路激活驅動基因多為突變體[34]，系統(tǒng)性化療前后變化較小。同時該研究還比較了擴增基因和缺失基因的拷貝數(shù)，得出：MCL1、AKT2、CARD11、GNA12、CKS1B、ACTB、TNFRSF11A、HIST1H2BJ、BTG2、CD79A、POU2F2、VHL和HIST1H2BC的拷貝數(shù)在復發(fā)難治患者有增加趨勢。相比而言，B2M、CDKN2B、CDKN2A、TNFAIP3、BCL7A、FYN、TNFRSF14、SGK1、ESR1、CD70、TP53和ECT2L的拷貝數(shù)在復發(fā)難治患者趨于減少。R/R DLBCL的基因組可以通過參與細胞周期、NF-κB通路、RAS信號、轉錄調控、DNA損傷、B細胞分化凋亡、PI3K Akt mTOR通路和免疫逃逸等方式致使基因突變路徑尤其豐富。一些驅動突變更容易在R/R DLBCL中富集，如CD79B、CDKN2A、MYD88、MYC和CCND3等，提示這些基因突變對DLBCL的預后有負面影響[35-36]。CDKN2A突變是R/R DLBCL最常見的突變，是R-CHOP治療后不良預后的指標[37]。CDKN2A和TP53突變同時存在，提示患者較低的OS率，且獨立于IPI評分[24]。以上結果可能與2014年Jiang等[38]首次提出的克隆演化的兩種模式相對應，第1種為“后期發(fā)散”模式：復發(fā)克隆基因可以通過獲得額外的復發(fā)驅動突變直接從初診克隆基因組演化而來。第2種是“早期分歧”模式：初診和復發(fā)克隆的基因突變可以同時從一個早期祖細胞演化而來，但攜帶有非常不同的體細胞突變模式。R/R DLBCL是DLBCL治療中一個尚未解決的問題，通過識別突變譜和整合分析克隆演化規(guī)律，將為進一步深入理解R/R DLBCL的耐藥機制和選擇治療靶點提供了有價值的信息。

5 根據(jù)DLBCL分子亞型指導臨床治療的探索

近年來，在DLBCL的治療探索領域，免疫療法研究“沖鋒在前”，靶向藥物之間的聯(lián)合以及靶向藥物與新的小分子抑制劑或化療藥物聯(lián)合的研究“緊追其后”。隨著我們對DLBCL分子分型的認識加深，目前學界已經(jīng)開始出現(xiàn)根據(jù)分子分型調整DLBCL治療策略的早期嘗試。例如在2021年ICML會議上，來自瑞金醫(yī)院趙維笠教授團隊就報道了一項2期臨床研究[39]。該研究主要是根據(jù)不同基因亞型，在R-CHOP中加入新的靶向藥物(R-CHOP+X)，以觀察新診斷DLBCL治療后的預后情況。研究者首先對128例患者FFPE的腫瘤標本進行靶向測序，利用18個基因突變、BCL2易位和BCL6融合，采用簡化方法將患者分為MCD、BN2、N1、EZB、TP53和NOS這6個基因亞型。62%的入組患者根據(jù)Hans算法歸為non-GCB型，36%的入組患者為MYC/BCL2雙表達。MCD、BN2、N1、EZB、TP53、NOS分型所占患者比例分別為20%、18%、4%、2%、16%、39%。入組患者分為標準R-CHOP組和R-CHOP+X組。R-CHOP+X組患者在接受標準的R-CHOP治療基礎上，MCD和BN2亞型患者加用BTK抑制劑伊布替尼420 mg/d治療，N1和NOS亞型患者加用免疫調節(jié)劑來那度胺25 mg/d，第1～10天治療，EZB亞型患者加用組蛋白去乙?；敢种苿┪鬟_本胺20 mg，第1、4、8、11天治療，TP53亞型患者加用靜脈注射去甲基化藥物地西他濱10 mg/m2，第1～5天治療。截止2021年3月1日，所有入組患者完成至少3個周期免疫化療。研究者對107例可評估療效患者分析后得出結論：R-CHOP+X組CR率為85%，ORR為91%；R-CHOP組CR率為65%，ORR為72%。中位隨訪14.1個月，R-CHOP+X組的1年PFS和OS率分別為96%和98%，而R-CHOP組的1年PFS和OS率分別為79%和94% (PFS:HR0.22，95%CI0.09～0.61；OS：HR0.28，95%CI0.05～1.60)。R-CHOP+X組相比R-CHOP組3、4級血液學和非血液學不良事件發(fā)生均有所增加，但絕大多數(shù)患者可耐受。上述研究表明，根據(jù)不同基因亞型加入靶向藥物的R-CHOP+X治療方案，有望在R-CHOP基礎上進一步改善患者的近期和遠期療效，這將是未來的治療方向。

綜上所述，隨著DLBCL分子分型的進步，我們對不同類型DLBCL的生物學行為和內在發(fā)病機制的認識日益深入，從而對不同類型患者的臨床病程、治療反應和預后判斷也愈加精確，未來必將持續(xù)提高臨床治療手段的個體化程度。在2017年修訂版的WHO分型中，已經(jīng)開始強調各亞型的細胞分子生物學標記的診斷、治療及判斷預后的作用，同時突出了病理和臨床緊密聯(lián)合的影響[40]。未來如何繼續(xù)深化DLBCL的臨床分子分型體系，如何在此基礎上深入挖掘和探索新的治療方案及研發(fā)新的靶向治療藥物還需要更長時間系統(tǒng)性的基礎和臨床研究[41]。相信在此基礎上，DLBCL超越R-CHOP時代，進入下一個精準診療和個體化的時代，必將很快成為現(xiàn)實。

利益相關聲明：本文作者聲明不存在任何與本論文相關的利益沖突。

作者貢獻說明：張新友：發(fā)現(xiàn)問題、提出意見；周繼豪：設計框架、構思內容；陳婷婷：文獻收集、撰寫論文。