旦慧文，張煥敏，王婷婷

0 引言

宮頸癌（cervical carcinoma,CC）是女性生殖系統(tǒng)常見的婦科惡性腫瘤[1]。盡管早期CC可以通過手術或放療進行治療，但部分晚期CC患者的預后仍然較差[2-3]。因此，闡明CC在臨床上的分子機制尤為重要。

有研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是一種在表觀遺傳、轉錄或翻譯水平上調控基因表達的基因組非編碼轉錄物，在疾病進展中起著重要作用[4]。因此，lncRNAs被用來作為各種癌癥診斷和預后分析的生物標志物，LINC00649被確定為前列腺癌和結直腸癌的預后標志物[5]，但并無與CC相關的報道。miR-424-5p的異常表達在各種腫瘤中均有報道，其在CC組織和細胞中顯著降低，過表達miR-424-5p可抑制CC細胞增殖，促進細胞凋亡[6]。此外，生物信息學預測表明miR-424-5p可靶向胰島素樣生長因子受體1（IGF1R）。IGF1R是一種跨膜受體酪氨酸激酶。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-375能靶向IGF1R抑制CC細胞增殖和遷移，促進細胞凋亡[7]。

本研究旨在探討LINC00649是否通過海綿吸附miR-424-5p上調IGF1R的表達，進而參與調控內質網應激（endoplasmic reticulum stress,ERs）過程，以調節(jié)CC細胞增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

正常宮頸上皮細胞系H8和HeLa、MS750、Caski、SiHa四株CC細胞系均購自美國ATCC細胞庫。Lipofectamine 3000（L3000001）、TRIzol試劑（15596026）和PARIS?試劑盒（AM1921）購自賽默飛世爾科技公司。C C K-8 試劑盒（CA1210）購自北京索萊寶科技有限公司。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（S0185XL）購自上海雅集吉生物科技有限公司。RIPA裂解緩沖液（MT0065）和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（YBP165）購自北京百奧萊博科技有限公司。實驗所用抗體均購自英國Abcam公司。反轉錄試劑盒（K1622）和ABI 7500系統(tǒng)（4351104）購自北京智杰方遠科技有限公司。ECL試劑盒（AS16-ECL-SN）購自艾美捷科技有限公司。流式細胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取CC相關芯片表達數據，選擇GSE55478分析差異表達miRNAs。該芯片中包含3例CC組織及對應的正常子宮頸組織。篩選條件為校正后P值<0.05和|LogFoldChange|>1，miRNAs注釋平臺為GPL18358 Agilent-041686 Unrestricted Human miRNA Microarray（miRNA ID version）。RNA22（http://cm.jefferson.edu/rna22/）和StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）在線預測網站用于預測miR-424-5p的上游靶點。GEPIA數據庫（http://gepia.cancer-pku.cn）用于預測LINC00649在CC中的表達及生存曲線。TargetScan（http://targetscan.org/vert_72/）、miRDB（http://mirdb.org）和miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）用于預測miR-424-5p的下游靶基因。DAVID（http://david.ncifcrf.gov）數據庫用于基因的KEGG功能富集分析，并將P<0.05的生物學通路繪制條形圖。DisGeNET（http://disgenet.org）數據庫獲取CC（CUI：C1334177）的疾病風險基因，篩選條件為GDA Score≥0.05。STRING（http://string-db.org）用于分析蛋白間的互作用關系。

1.2.2 組織采集 從中國人民解放軍海軍第971醫(yī)院婦產科獲取2018年4月—2020年12月的58例CC患者的腫瘤組織及其配對鄰近正常組織（腫瘤周圍2～5 cm）?；颊吣挲g范圍為29～63歲，平均年齡為51.2±4.8歲，根據國際婦產科聯(lián)合會（FIGO）標準進行病理分級和臨床分期，其中Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期24例。納入標準：（1）經組織病理學檢查證實；（2）未接受免疫治療、化療或放療；（3）愿意捐獻組織活檢。排除標準：（1）有其他惡性腫瘤病史；（2）CC復發(fā)；（3）心臟、腎臟和其他器官衰竭；（4）免疫性疾??；（5）孕婦或哺乳期婦女。收集所有樣品，在液氮中快速冷凍，并在使用前保存在?80°C環(huán)境下。所有患者均簽署書面知情同意書。研究方案經本院倫理委員會批準。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 在RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)正常宮頸上皮細胞系H8和4株CC細胞系，添加10%胎牛血清（FBS）及青霉素（100 u/ml）和鏈霉素（100 μg/ml）。所有細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 細胞轉染 設計并合成針對LINC00649的特異性小干擾RNA（siRNAs）以敲減LINC00649，以si-NC作為陰性對照。獲取miR-424-5p模擬物（miR-424-5p mimic）、NC對照物和miR-424-5p抑制劑（miR-424-5p inhibitor）。為過度表達IGF1R，將IGF1R序列插入pcDNA3.1質粒中以獲得IGF1R過度表達質粒pcDNA3.1-IGF1R。CC細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用Lipofectamine 3000將siRNA（100 pmol）、miRNA模擬物（100 pmol）、miRNA抑制劑（100 pmol）或質粒（4 μg）轉染HeLa細胞。

1.2.5 CCK-8檢測 24 h后收集轉染細胞，培養(yǎng)基添加10%FBS，懸浮細胞。將含有2×103個細胞的100 μl懸液接種到96孔板中，在上述條件下分別培養(yǎng)0、24、48和72 h，每孔添加10 μl CCK-8試劑，37℃再培養(yǎng)2 h。使用微孔板分光光度計測量450 nm波長處吸光度值。

1.2.6 流式細胞術檢測 使用AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒，用不含EDTA的胰蛋白酶處理細胞，離心后收集細胞，用預先培養(yǎng)的PBS洗滌，細胞濃度調整至（1～5）×105/ml。用100 μl 1×結合緩沖液懸浮。添加5 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI染色液，輕輕混合。室溫下避光反應10～15 min。加入400 μl 1×結合緩沖液混合，置于冰上。1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.7 Western blot檢測 收集轉染后的細胞，RIPA裂解緩沖液和2%蛋白酶抑制劑混合液分離總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。蛋白質通過10%SDS-PAGE電泳分離，轉移到0.45 μm PVDF膜。5%脫脂奶粉37℃封閉膜1 h，4℃一抗孵育過夜。在ECL試劑盒檢測之前，將膜與辣根過氧化物酶（HRP）結合的二抗IgG（1:2 000）37℃搖床孵育1 h。使用ImageJ軟件通過密度測定法測量蛋白質表達水平。實驗所用一抗有：GRP78（1:1 000）、CHOP（1:1 000）和Caspase-12（1:1 000），GAPDH（1:1 000）為內參。

1.2.8 qRT-PCR檢測 使用TRIzol試劑從CC組織或細胞中提取總RNA，并使用反轉錄試劑盒合成cDNA。ABI 7500系統(tǒng)上使用SYBR-Green試劑進行qRT-PCR檢測。GAPDH和U6分別作為LINC00649和IGF1R、miR-424-5p的內參。2-ΔΔCt法分析各標本的相對基因表達。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primer sequences

1.2.9 雙熒光素酶報告實驗 將LINC00649（WTLINC00649）或IGF1R（WT-IGF1R）的3’UTR野生型序列及其相應的突變型（MUT-LINC00649或MUT-IGF1R）序列克隆到pGL4熒光素酶報告質粒中。將報告質粒（WT-LINC00649、WT-IGF1R、MUT-LINC00649或MUT-IGF1R）與miR-424-5p模擬物共轉染HeLa細胞。轉染48 h后，用雙熒光素酶報告試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.10 核質分離試驗 使用PARIS?試劑盒，收集HeLa細胞（1×107個/孔），懸浮在細胞組分緩沖液中進行細胞質和核分離，置于冰上10 min。按照試劑盒使用說明書，4℃下5 000g離心30 s，細胞裂解緩沖液分離上清液和核組分，提取RNA并進行qRT-PCR檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS22.0軟件進行數據分析，所有數據均表示為平均值±標準差（）。計數資料以n表示，采用卡方檢驗或Fisher確切概率檢驗進行檢驗。在計量數據符合正態(tài)分布的前提下，采用t檢驗分析兩組間的差異，使用單因素方差分析比較多組間的差異。在不符合正態(tài)分布條件下，兩組間使用曼-惠特尼U檢驗，采用Tukey檢驗進行事后比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 生物信息學預測結果

對GSE55478數據集中的miRNAs進行差異表達分析，根據CC組織中miRNAs較正常子宮頸組織中的差異表達倍數，選擇CC組織中顯著下調的前5個miRNAs繪制熱圖，見圖1A。由于miR-424-5p在CC中的作用已得到初步明確[6]，對miR-424-5p進行下一步分析。在StarBase和RNA22獲取miR-424-5p的上游靶點并取交集，結果為CERS6-AS1、LINC00649、GABPB1-AS1、UBA6-AS1和EPB41L4A-AS1。GEPIA數據庫發(fā)現(xiàn)LINC00649在CC組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，見圖1B，推測LINC00649在CC中的異常表達可能發(fā)揮調控作用。LINC00649和miR-424-5p的結合位點見圖1C。在TargetScan、miRWalk和miRDB獲取miR-424-5p的下游靶點并取交集，共有479個共同靶基因，隨后進行KEGG功能富集分析，選取FDR（校正后P值）<0.05的生物學通路繪制成條形圖，見圖1D，其中有較多基因顯著富集在癌癥相關的生物學通路：hsa05200:Pathways in cancer，將該生物學通路中的基因與DisGeNET數據庫獲取的CC疾病風險基因通過STRING在線預測網站進行蛋白互作用分析，見圖1E，并根據以往的研究，選擇IGF1R進行后續(xù)分析。IGF1R和miR-424-5p的靶向結合位點見圖1F。

2.2 LINC00649在CC組織和細胞中表達上調，并與CC患者預后不良有關

與鄰近正常組織相比，C C 組織中的LINC00649表達水平顯著上調（P<0.05），見圖2A。ROC曲線下面積（AUC）為0.8639（P<0.0001），見圖2B。此外，與H8細胞相比，LINC00649在CC細胞系中的表達增加，且在HeLa細胞中表達水平最高，后續(xù)選擇HeLa細胞進行實驗（均P<0.05），圖2C。LINC00649的表達水平與FIGO分期、淋巴結轉移和腫瘤分期有關。未發(fā)現(xiàn)LINC00649水平與年齡、腫瘤大小、組織學類型和分化程度之間的相關性，見表2。

表2 宮頸癌中LINC00649的表達與臨床病理特征的關系(n=58)Table 2 Relation between LINC00649 expression and clinicopathological features of cervical carcinoma patients(n=58)

2.3 敲減LINC00649可促進ERs，加速CC細胞凋亡

用LINC00649 siRNA及其陰性對照轉染HeLa細胞，qRT-PCR結果顯示，轉染后LINC00649的表達水平顯著降低（P<0.05），見圖3A。CCK-8法和流式細胞儀檢測結果顯示，敲減LINC00649后，細胞增殖活力顯著降低，細胞凋亡數目增加（均P<0.05），見圖3B～C。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)LINC00649的下調促進了GRP78、CHOP和Cas-pase-12的蛋白表達（均P<0.05），見圖3D～E。

2.4 miR-424-5p是LINC00649的靶點

核質分離實驗結果顯示LINC00649主要定位于細胞質，可以穩(wěn)定發(fā)揮競爭性內源RNA的作用（P<0.05），見圖4A。雙熒光素酶報告實驗證實miR-424-5p為LINC00649的下游靶點，miR-424-5p mimic可顯著抑制WT-LINC00649的熒光活性，而對MUT-LINC00649的熒光活性幾乎沒有影響（P<0.05），見圖4B。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-424-5p在CC組織中顯著下調（P<0.05），見圖4C，且與LINC00649負相關（P=0.0281），見圖4D。此外，miR-424-5p在CC細胞系中的表達較H8顯著降低（P<0.05），在HeLa細胞中表達最低，見圖4E，敲減LINC00649可顯著上調miR-424-5p的表達（P<0.05），見圖4F。

2.5 下調miR-424-5p可部分逆轉si-LINC00649介導的增殖、凋亡和氧化應激效應

qRT-PCR檢測結果顯示，si-LINC00649顯著升高的LINC00649水平被miR-424-5p inhibitor部分抑制（P<0.05），見圖5A。細胞增殖和凋亡檢測結果顯示，敲減LINC00649抑制細胞增殖活力，誘導細胞凋亡，而miR-424-5p inhibitor的轉染顯著促進了HeLa細胞的增殖活力，減少了凋亡細胞（均P<0.05），圖5B～C。此外，敲減LINC00649上調的GRP78、CHOP和Caspase-12被miR-424-5p inhibitor部分抑制（均P<0.05），圖5D～E。

2.6 IGF1R是miR-424-5p的靶點

雙熒光素酶報告實驗結果顯示，miR-424-5p mimic可顯著抑制WT-IGF1R的熒光活性，而對MUT-IGF1R的熒光活性幾乎沒有影響（P<0.05），見圖6A。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)IGF1R在CC組織中表達升高（P<0.05），與LINC00649的表達呈正相關（P=0.0184），與miR-424-5p負相關（P=0.0282），見圖6B～D。同樣的，IGF1R在CC細胞系中的表達較H8細胞系顯著升高（P<0.05），見圖6E。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞中，敲減LINC00649可顯著抑制IGF1R的表達，而miR-424-5p inhibitor可顯著逆轉這一效果（P<0.05），見圖6F。

2.7 過表達IGF1R可部分逆轉si-LINC00649介導的增殖、凋亡和氧化應激效應

qRT-PCR檢測顯示，IGF1R在si-LINC00649+pcDNA3.1-NC組的表達水平顯著低于si-LINC 00649+pcDNA3.1-IGF1R組（P<0.05），見圖7A。細胞增殖和凋亡數據顯示，敲減LINC00649抑制的細胞增殖活力和促進的細胞凋亡均被上調的IGF1R部分逆轉（均P<0.05），見圖7B～C。Western blot檢測結果顯示，敲減LINC00649后上調的GRP78、CHOP和Caspase-12被pcDNA3.1-IGF1R部分抑制（均P<0.05），見圖7D～E。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00649在CC組織和細胞中均異常高表達，且與CC患者的預后不良有關。一系列實驗證實了LINC00649/miR-424-5p/IGF1R對CC細胞生物學行為的調控作用。lncRNAs可以參與基因表達調控、劑量補償、基因組印記、轉錄激活、轉錄干擾和核轉運、X染色體敲減和染色質修飾等多個重要的生物學過程[8-9]。lncRNA已經成為癌癥轉錄組中重要的組成部分，它通過與蛋白質、DNA和RNA的相互作用在各種癌癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用[10]。研究表明，LINC00649通過結合miR-15a-5p上調HMGA1的表達，以增強膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，是膀胱癌潛在的生物標志物和治療靶點[11]。此外，還發(fā)現(xiàn)LINC00649在前列腺癌和結直腸癌中異常高表達[12-13]。本研究采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，LINC00649在CC組織和細胞系中較癌旁正常組織和H8細胞顯著高表達，且對于CC具有良好的診斷價值。細胞增殖和凋亡實驗分析結果顯示，敲減CC細胞中LINC00649的水平有助于抑制CC細胞增殖活力，誘導細胞凋亡。此外，內質網是一種經歷蛋白質合成、折疊、修飾和調節(jié)細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)的細胞器，多種刺激可干擾內質網的穩(wěn)態(tài)，導致未折疊或錯誤折疊的蛋白質累積和內質網應激（ERs）[14]。Western blot檢測ERs相關蛋白的表達結果顯示，敲減LINC00649上調了GRP78、CHOP和Caspase-12的表達，提示抑制LINC00649可能通過促進ERs來誘導CC細胞凋亡。

miRNAs可以與mRNAs結合，導致基因敲減，從而影響細胞行為[15]。miR-424-5p可調節(jié)腫瘤細胞的各種惡性生物學行為，如miR-424-5p通過調控PTEN/mTOR軸調節(jié)乳腺癌細胞的化療敏感度[16]。miR-424-5p靶向E2F7調控細胞周期，進而抑制肝癌細胞的增殖[17]。腫瘤抑制因子miR-424-5p靶向ACSL4消除卵巢癌的鐵死亡[18]。此外，miR-424-5p在CC中發(fā)揮抑癌功能也被報道證實[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-424-5p在CC組織和細胞中均為異常低表達，與LINC00649負相關。敲減LINC00649促進的ERs、誘導的CC細胞凋亡和抑制的細胞活力均能被miR-424-5p抑制劑部分逆轉，這表示LINC00649可能通過抑制miR-424-5p的表達在CC中發(fā)揮促癌作用。

為進一步探究LINC00649和miR-424-5p在CC中的作用機制，我們利用TargetScan、miRWalk和miRDB獲取miR-424-5p的下游靶基因并進行功能富集分析，結果篩選得到IGF1R。IGF1R作為一種跨膜受體，由IGF-1和相關生長因子IGF-2激活[21]。配體與受體的結合導致受體寡聚化、蛋白酪氨酸激酶激活、分子間受體自身磷酸化和細胞底物磷酸化，從而導致基因激活、DNA合成和細胞增殖，在包括CC在內的多種人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了IGF1R的過度表達[22]。據報道，IGF1R是CC細胞侵襲和增殖的有效刺激因子，由αvβ3整合素信號調節(jié)[23]，且miR-497可靶向IGF1R抑制CC的發(fā)生[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，IGF1R在CC組織和細胞中的表達升高，與LINC00649正相關，與miR-424-5p負相關。敲減LINC00649促進的ERs、誘導的CC細胞凋亡和抑制的細胞活力均能被上調的IGF1R部分逆轉，這些結果表示LINC00649可能通過靶向miR-424-5p上調IGF1R的表達在CC中發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，本研究揭示了敲減LINC00649可通過調節(jié)miR-424-5p/IGF1R軸促進ERs的發(fā)生，進而誘導CC細胞凋亡，為CC的治療提供了新的理論依據。然而本實驗僅對LINC00649在CC中的體外實驗進行驗證，未來還需要對體內實驗及LINC00649可能參與調控的信號通路展開相應的探討。