單文豪，易偉江，張司軍，江偉，夏劍

0 引言

骨肉瘤是起源于間葉組織的惡性腫瘤，好發(fā)于股骨遠(yuǎn)端及脛骨近端，主要發(fā)生于青少年，具有惡性程度高、易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[1]。骨肉瘤預(yù)后較差，其術(shù)后5年生存率為60%[2]。骨肉瘤嚴(yán)重影響青少年兒童的健康，盡管當(dāng)前骨肉瘤的臨床診斷技術(shù)及外科治療技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但骨肉瘤患者的整體預(yù)后依舊較差，因此，亟需尋找有效的分子靶點(diǎn)。腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者治療失敗的主要原因，腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生是一個(gè)多因素多步驟的結(jié)果[3]。Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶2（ROCK2）在腫瘤的發(fā)生及惡性進(jìn)展中扮演著重要角色，是Rho信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，目前研究表明其可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的收縮、黏附、遷移、增殖和凋亡[4-5]。研究還證實(shí)其在肝癌[6]、結(jié)直腸癌[7]及乳腺癌[8]中異常高表達(dá)，且證實(shí)了轉(zhuǎn)移性腫瘤組織中ROCK2的表達(dá)高于其原位癌中的表達(dá)[9]，然而，其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究?；诖?，本研究旨在分析ROCK2在骨肉瘤組織中的表達(dá)，并進(jìn)一步分析其對(duì)骨肉瘤侵襲及遷移的影響和機(jī)制，為骨肉瘤的分子靶向治療提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS及Saos-2購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，兔抗人單克隆ROCK2、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及鼠抗人GAPDH（內(nèi)參照）單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，ROCK2及GAPDH引物由廣州銳博公司合成，空轉(zhuǎn)質(zhì)粒（shNC）、ROCK2下調(diào)質(zhì)粒（shROCK2）均由上海吉瑪基因公司合成，其序列如下：F：5'-CACCGCAGCTGGAATCTAACAATAGCGAACTATTGTTAGATTCCAGCTGC-3',R：5'-AAAAGCAGCTGGAATCTAACAATAGTTCGCTATTGTTAGATTCCAGCTGC-3'。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

經(jīng)南昌市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并經(jīng)患者或其家屬知情同意，收集25例外科手術(shù)后切取的骨肉瘤組織及其相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本。所有患者均未接受放化療，標(biāo)本經(jīng)4%中性多聚甲醛固定，脫水后石蠟進(jìn)行固定，切成4 μm的薄片，5%BSA封閉30 min，滴加ROCK2抗體（1:200稀釋）4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育2 h，顯色，根據(jù)細(xì)胞染色（棕色、黃色、藍(lán)色）深淺及比例進(jìn)行評(píng)分。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將收集好的骨肉瘤組織經(jīng)過(guò)研磨后采用TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）法提取組織RNA及總RNA。按照TAKARA（日本）試劑說(shuō)明，將其轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。將閾值定義為循環(huán)數(shù)Ct，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的基因ROCK2及GAPDH的mRNA量，每個(gè)樣品ROCK2與GAPDH基因濃度比值，即為校正后的相對(duì)含量，最終結(jié)果以2-ΔΔCt表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Western blot檢測(cè)

將收集好的骨肉瘤組織通過(guò)組織抽提試劑盒（北京碧云天公司）提取組織蛋白，RIPA（北京碧云天公司）裂解法提取骨肉瘤細(xì)胞蛋白，通過(guò)BCA（北京碧云天公司）法測(cè)定其蛋白濃度，并加入蛋白質(zhì)Buffer將其稀釋，經(jīng)沸水煮10 min使其發(fā)生變性，每個(gè)上樣孔加入約30 μg蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于含ROCK2（1:1 000稀釋）一抗中孵育過(guò)夜（4℃），相應(yīng)種屬二抗室溫孵育1.5 h，將其置于凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

按照空轉(zhuǎn)質(zhì)粒（shNC）、ROCK2下調(diào)質(zhì)粒（shROCK2）、ROCK2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（HAROCK2）進(jìn)行分組，采用0.25%的胰酶消化后并計(jì)數(shù)，以每孔50×104個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，待細(xì)胞鋪勻后，轉(zhuǎn)染攜帶有shROCK2的質(zhì)粒及空轉(zhuǎn)質(zhì)粒于骨肉瘤細(xì)胞中，待細(xì)胞鋪滿整個(gè)六孔板，使用200 μm槍頭進(jìn)行垂直劃痕處理，PBS清洗細(xì)胞2次，按照既定的時(shí)間進(jìn)行拍照觀察并分析愈合率。

1.6 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

按照shNC、shROCK2、HA-ROCK2進(jìn)行分組，骨肉瘤經(jīng)胰酶消化后并計(jì)數(shù)，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell板中，預(yù)冷處理實(shí)驗(yàn)器械，每孔加入50 μl稀釋基質(zhì)膠，37℃孵育30 min，待其凝固后，上室加入200 μl含1×104個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加入500 μl含10%血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育48 h后，用棉簽輕輕擦拭未穿透的細(xì)胞，甲醇固定20 min，1%結(jié)晶紫染色30 min，室溫晾干后，電子顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雄性裸鼠來(lái)源于湖南斯萊克景達(dá)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司（BALB/c-nu/nu,6周）；按照shNC及shROCK2進(jìn)行分組，每組6只。構(gòu)建轉(zhuǎn)染shNC及shROCK2質(zhì)粒的骨肉瘤細(xì)胞，PBS清洗2次，經(jīng)胰酶消化后收集細(xì)胞沉淀并將細(xì)胞稀釋成每毫升1×107個(gè)備用。尾靜脈接種100 μl shNC及shROCK2組細(xì)胞，無(wú)菌環(huán)境下繼續(xù)喂養(yǎng)30天后處死，取出雙肺，HE染色。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均通過(guò)軟件SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示計(jì)量數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)或者Welch校正t檢驗(yàn)方法，多組實(shí)驗(yàn)均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次以上。

2 結(jié)果

2.1 ROCK2蛋白在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況

qRT-PCR結(jié)果表明骨肉瘤組織中ROCK2 mRNA表達(dá)水平約為相應(yīng)非癌組織的2.5倍（P<0.01），見(jiàn)圖1A；25例骨肉瘤組織標(biāo)本中，21例蛋白表達(dá)水平顯著提升，4例表達(dá)水平無(wú)明顯差異（P<0.01），見(jiàn)圖1B～C，；免疫組織化學(xué)結(jié)果表明ROCK2在骨肉瘤組織中表達(dá)升高（P<0.05），見(jiàn)圖1D～E。

2.2 ROCK2促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞侵襲及遷移的發(fā)生

下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞U2-OS中ROCK2的表達(dá)后，qRT-PCR及Western blot證實(shí)其蛋白表達(dá)下調(diào)效果顯著（P<0.01），見(jiàn)圖2A。劃痕愈合及Transwell結(jié)果表明其遷移及侵襲能力明顯被抑制（P<0.05;P<0.01），見(jiàn)圖2C、E；相反，過(guò)表達(dá)ROCK2后（P<0.01），其蛋白表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)圖2B，骨肉瘤細(xì)胞的侵襲及遷移能力顯著提升（P<0.05;P<0.01），見(jiàn)圖2D、F。

2.3 ROCK2誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生

下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2的表達(dá)后，Western blot結(jié)果顯示E-cadherin表達(dá)下降，而N-cadherin及Vimentin蛋白明顯增加（P<0.05），見(jiàn)圖3A。免疫熒光同樣也證實(shí)此結(jié)果，見(jiàn)圖3B。上調(diào)后則與其相反，見(jiàn)圖3C。進(jìn)一步采用TGF-β誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的發(fā)生，下調(diào)ROCK2的表達(dá)，Western blot結(jié)果表明TGF-β能夠減弱下調(diào)ROCK2對(duì)E-cadherin蛋白的抑制作用，能夠減弱下調(diào)ROCK2對(duì)N-cadherin及Vimentin蛋白的促進(jìn)作用，見(jiàn)圖3D。劃痕愈合及Transwell實(shí)驗(yàn)表明TGF-β能夠減弱下調(diào)ROCK2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲及遷移的抑制作用（P<0.05），見(jiàn)圖3E～F。

2.4 ROCK2對(duì)體內(nèi)骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響

裸鼠尾靜脈轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)表明，下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2的表達(dá)后，其轉(zhuǎn)移的發(fā)生率明顯降低，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為0，而相應(yīng)的對(duì)照組有5例發(fā)生肺轉(zhuǎn)移（n=6）。

3 討論

骨肉瘤是骨組織來(lái)源最為常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占骨惡性腫瘤的三分之一，早期即易發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，通?；颊哳A(yù)后很差[10-11]。以往的骨肉瘤治療局限于臨床手術(shù)切除根治治療。據(jù)報(bào)道，患者5年的預(yù)后存活率僅為20%[2,12]。目前骨肉瘤的治療主要是新輔助化療和臨床手術(shù)兩種方式，患者的5年預(yù)后存活率也僅僅保持在50%左右，較其他腫瘤而言存活率低[13-14]。研究證實(shí)腫瘤進(jìn)展是一個(gè)多因素多步驟的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，在此過(guò)程中總會(huì)伴隨著基因及蛋白質(zhì)水平的不斷變化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞的生物學(xué)表象改變，腫瘤惡性生長(zhǎng)及向遠(yuǎn)處發(fā)生轉(zhuǎn)移是當(dāng)前臨床治療的難點(diǎn)，也是患者死亡的主要原因，因此，探究其惡性生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的原因及機(jī)制，對(duì)臨床腫瘤的指導(dǎo)治療尤為重要。

Rho家族相關(guān)基因擔(dān)負(fù)著蛋白分子開(kāi)關(guān)的作用，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也起著關(guān)鍵作用。Rho激酶（Rho kinase,ROCK）是Rho亞家族下游的關(guān)鍵靶點(diǎn)效應(yīng)蛋白分子之一[15-16]。研究證實(shí)在肝癌、腎癌、乳腺癌等惡性腫瘤中觀察到ROCK2表達(dá)升高,然而在不同腫瘤中其機(jī)制卻不相同：ROCK2介導(dǎo)GSK-3β/β-catenin通路抑制CEBPD表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖[6]；ROCK2通過(guò)介導(dǎo)β-catenin/TCF4通路來(lái)抑制SCARA5表達(dá)，從而促進(jìn)腎癌細(xì)胞增殖[7]；ROCK2基因的Thr431Asn多態(tài)性可能是乳腺癌轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)因素[8]。ROCK2參與了許多細(xì)胞生物學(xué)活動(dòng)，主要包括細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞分裂、增殖、遷移和細(xì)胞黏附。ROCK2是與Rho/GTP酶兩者間相互作用而激活，并通過(guò)一些分子信號(hào)途徑來(lái)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架，進(jìn)而影響細(xì)胞的侵襲遷移。研究也證實(shí)ROCK2在平滑肌和神經(jīng)再生以及神經(jīng)元發(fā)育中起著重要作用[17]。此外，多數(shù)研究表明，ROCK2活化通過(guò)直接影響腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)以及對(duì)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的間接影響來(lái)增加細(xì)胞外基質(zhì)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，從而在增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮直接作用[18]。在此方面，很多Rho相關(guān)通路抑制劑可減少腫瘤的生長(zhǎng)、遷移和進(jìn)展，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌等。然而ROCK2與骨肉瘤的研究報(bào)道不多，因此探討ROCK2在骨肉瘤中的表達(dá)及其影響機(jī)制尤為重要。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是上皮細(xì)胞表型向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變的過(guò)程，可導(dǎo)致腫瘤上皮細(xì)胞的極性和細(xì)胞間連接的逐漸喪失，細(xì)胞骨架重構(gòu)，在腫瘤發(fā)生及演變中發(fā)揮著重要的作用[19]。EMT的發(fā)生涉及多種通路的參與，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β/Smad）通路、Wnt/β-catenin通路、Notch通路等[20]。Ding等發(fā)現(xiàn)TGF-β可通過(guò)介導(dǎo)Slug信號(hào)通路連接、進(jìn)而抑制miR-203啟動(dòng)子的表達(dá)，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移特性[21]。有多種轉(zhuǎn)錄因子在EMT過(guò)程中發(fā)揮重要作用，如E-cadherin作為上皮表型的標(biāo)志物，是一種跨膜細(xì)胞黏附蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附和維持上皮組織的結(jié)構(gòu)和功能完整性，其缺失或者降低被認(rèn)為是發(fā)生EMT的重要標(biāo)志，其他如Snail、Twist、ZEB等E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制的相關(guān)因子在EMT過(guò)程中表達(dá)增多，從而抑制E-cadherin的表達(dá)[22]。此外，N-cadherin、Vimentin等反映細(xì)胞的間質(zhì)成分變化的蛋白表達(dá)升高[23]。研究表明，EMT在多種腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著重要角色。Akalay等[24]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞呈現(xiàn)EMT表型改變，抑制Snail、逆轉(zhuǎn)EMT可抑制其侵襲與遷移能力。近年研究表明EMT在骨肉瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Yuan等[25]證實(shí)EMT可以誘導(dǎo)骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生。由此可見(jiàn)EMT在骨肉瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著重要角色。本研究首先通過(guò)提取骨肉瘤患者中的mRNA及蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)癌組織的ROCK2表達(dá)量明顯升高，免疫組織化學(xué)檢測(cè)也證實(shí)了同樣的結(jié)果。Transwell和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2促進(jìn)細(xì)胞遷移能力，而通過(guò)RNAi干擾技術(shù)下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞中ROCK2的表達(dá)，其侵襲遷移能力減弱，提示ROCK2在骨肉瘤發(fā)展中有促進(jìn)作用。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ROCK2過(guò)表達(dá)的骨肉瘤細(xì)胞中E-cadherin蛋白減少，N-cadherin、Vimentin蛋白增加；ROCK2敲低的骨肉瘤細(xì)胞結(jié)果則相反，免疫熒光實(shí)驗(yàn)也得到了同樣的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，TGF-β可以減弱敲低ROCK2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用。以上結(jié)果證實(shí)了ROCK2是通過(guò)誘導(dǎo)骨肉瘤EMT的發(fā)生進(jìn)而促進(jìn)其侵襲及遷移的發(fā)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)降低ROCK2表達(dá)能明顯降低骨肉瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移率。

綜上，本研究揭示了ROCK2在骨肉瘤中的表達(dá)及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞侵襲及遷移的影響，為骨肉瘤的靶向治療提供更多的理論基礎(chǔ)，提示ROCK2有可能成為骨肉瘤的潛在治療靶點(diǎn)。