魏佳韻，李鋒，李楠，陳園園，李香豫，沈昊偉，王優(yōu)美，3，徐鵬，3**，狄斌**

（1.中國藥科大學，江蘇 南京 210009；2.國家禁毒委員會辦公室-中國藥科大學禁毒關(guān)鍵技術(shù)聯(lián)合實驗室，北京 100193；3.毒品監(jiān)測管控與禁毒關(guān)鍵技術(shù)公安部重點實驗室，公安部禁毒情報技術(shù)中心，北京 100193；4.寧波大學醫(yī)學院，浙江 寧波 315211）

阿片類藥物是臨床上廣泛使用的麻醉性鎮(zhèn)痛藥，近年來芬太尼類藥物逐步替代嗎啡作為臨床常用的麻醉誘導(dǎo)與鎮(zhèn)痛藥，而嗎啡目前則主要用于其他鎮(zhèn)痛藥無效的急性銳痛，如嚴重創(chuàng)傷、癌痛等[1]。由于芬太尼類物質(zhì)具有強效鎮(zhèn)痛和致成癮性作用，因此這類物質(zhì)越來越多地參與了阿片類物質(zhì)濫用導(dǎo)致的死亡[2]。卡芬太尼是最受關(guān)注的芬太尼類似物之一，其是由Van Bever WF 等[3]人首次合成，并在1976 年進行了報道。卡芬太尼是在芬太尼哌啶環(huán)的4 位碳上進行羧基化[4-5]，據(jù)報道，卡芬太尼是2016～2017 年美國10 個州阿片類藥物過量死亡中最常見的芬太尼類似物[6]?？ǚ姨嶙鳛橐环N極強效的麻醉鎮(zhèn)痛類物質(zhì)，目前還沒有被批準用于臨床治療，只作為商用獸藥（Wildnil?），通常以5～20 μg/kg 的劑量用于固定和捕獲非洲象等大型動物[7-8]。為了解卡芬太尼的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及潛在的臨床應(yīng)用價值，本研究擬通過小鼠熱板法，以臨床常用阿片類鎮(zhèn)痛藥嗎啡為陽性對照，對卡芬太尼的鎮(zhèn)痛效應(yīng)進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級ICR 雌性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗開始前，動物在動物房至少適應(yīng)環(huán)境1～2 d，飼料與清潔水可自由攝取。對實驗動物進行的操作均符合實驗動物倫理學，遵循國家動物使用和保護委員會頒布的條例。

1.2 實驗藥品

卡芬太尼鹽酸鹽由中科院上海有機化學研究所提供，嗎啡堿由公安部禁毒局國家毒品實驗室提供，純度均≥98%?？ǚ姨猁}酸鹽采用0.9%的生理鹽水溶解，嗎啡堿采用枸櫞酸緩沖液溶解。陰性對照組給予0.9%的生理鹽水或枸櫞酸緩沖液。

1.3 主要儀器

ZS-YLS-21A 型冷熱板測痛儀，購自北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司。

1.4 動物篩選

先用熱板儀對小鼠進行篩選，熱板溫度調(diào)節(jié)至（55±0.5） ℃，以舔后足為痛覺指標，將小鼠置于熱板上，選擇從放在熱板上到出現(xiàn)舔后足的反應(yīng)時間（即痛閾值）在5～30 s 之間的小鼠。測試小鼠在給藥前的2 次痛閾（間隔15 min），取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾。

1.5 分組及給藥

將篩出的小鼠隨機分為四大組：卡芬太尼的陰性對照組（給予0.9%生理鹽水），嗎啡的陰性對照組（給予枸櫞酸緩沖液），卡芬太尼不同給藥劑量組（分別給予1、2、4 及8 μg/kg 不同劑量）及嗎啡不同給藥劑量組（分別給予2、4、6 及8 mg/kg 的不同劑量）。各劑量組小鼠數(shù)量為8～10 只，給藥方式均為皮下注射，固定體積給藥。各劑量組小鼠分別在給藥后的5、20、40、60 min進行一次痛閾值的測定，并做好記錄。設(shè)置實驗截止時間為60 s，若小鼠超過60 s 仍不舔足，應(yīng)當立即取出以防止燙傷，且痛閾值按60 s 計算。最大鎮(zhèn)痛百分率（percent of maximal possible potential effect，MPE%）由下列公式進行計算：MPE%=[（給藥后痛閾-基礎(chǔ)痛閾）/（60-基礎(chǔ)痛閾）]×100%。

1.6 統(tǒng)計方法

利用GraphPad Prism 8 軟件進行數(shù)據(jù)處理，將熱板鎮(zhèn)痛的實驗數(shù)據(jù)輸入計算得出該化合物鎮(zhèn)痛效應(yīng)的半數(shù)有效量（ED50）和95%置信區(qū)間（95%CI）。實驗數(shù)據(jù)均以（±s）表示，數(shù)據(jù)比較采用單因素或者雙因素方差分析（One-way or two-way ANOVA）以及采用Bonferroni post hoc 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 卡芬太尼和嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線

雙因素方差分析的結(jié)果顯示，卡芬太尼的給藥時間[F（3.357，151.1）=52.88，P＜0.000 1]、給藥劑量[F（4，45）=66.55，P＜0.000 1]以及給藥時間與給藥劑量之間的交互作用[F（16，180）=18.51，P＜0.000 1]均顯著影響了小鼠的熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)。Bonferroni post hoc 檢驗顯示，在小鼠給藥5 min 后，實驗劑量4 和8 μg/kg 均顯著增加小鼠的熱板痛閾值，且都達到了該劑量組的最大痛閾值（圖1A）。其中給予4 μg/kg 卡芬太尼可持續(xù)顯著增加小鼠的熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)超過20 min，但不到40 min，而給予8 μg/kg 卡芬太尼顯著增加小鼠熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)的持續(xù)時間較長，60 min 之后仍未恢復(fù)。陰性對照組的小鼠在給藥前后的痛閾值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1A）。

嗎啡的給藥時間[F（3.078，113.9）=38.71，P＜0.000 1]、給藥劑量[F（4，37）=40.73，P＜0.000 1]以及給藥時間與給藥劑量之間的交互作用[F（16，148）=10.34，P＜0.000 1]也均顯著影響了小鼠的熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)。Bonferroni post hoc 檢驗顯示，在給藥20 min 后，與各組基礎(chǔ)熱板痛閾值相比，4、6 和8 mg/kg 嗎啡實驗劑量組的小鼠痛閾值均顯著增加，且都達到各劑量組的最大痛閾值（圖1B）。其中，給予4 mg/kg 和6 mg/kg 嗎啡顯著增加小鼠熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)的持續(xù)時間超過20 min，但不到40 min，而給予8 mg/kg 的嗎啡可顯著增加小鼠熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)，超過60 min 仍未恢復(fù)。陰性對照組的小鼠在給藥前后的痛閾值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1B）。

圖1 卡芬太尼和嗎啡的鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線

2.2 卡芬太尼和嗎啡鎮(zhèn)痛效應(yīng)的半數(shù)有效量（ED50）

熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線顯示卡芬太尼在小鼠給藥5 min 后產(chǎn)生了最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)。而嗎啡則在給藥20 min 后對小鼠產(chǎn)生了最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)。根據(jù)不同劑量的卡芬太尼和嗎啡的最大鎮(zhèn)痛百分率（MPE%），分別得到了卡芬太尼和嗎啡的給藥劑量對數(shù)值與其MPE%之間的關(guān)系曲線，同時計算出這兩種化合物的半數(shù)有效量（ED50）和95%置信區(qū)間（95%CI） （圖2）。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同劑量的卡芬太尼對小鼠在5 min 時產(chǎn)生的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)有顯著的影響[F（4，45）=50.91，P＜0.000 1]。Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，卡芬太尼在4 和8 μg/kg 劑量組均能顯著增強小鼠在5 min 時的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但這兩個劑量的鎮(zhèn)痛效應(yīng)之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.352 9），提示給藥劑量為4 μg/kg 時即可達到卡芬太尼小鼠熱板鎮(zhèn)痛的最大鎮(zhèn)痛閾值（圖2A）。卡芬太尼的給藥劑量對數(shù)值與MPE%呈現(xiàn)出較為典型的“S”型關(guān)系曲線。經(jīng)計算，給予卡芬太尼的小鼠熱板鎮(zhèn) 痛 效 應(yīng) 的ED50和95%CI 分 別 為2.60 μg/kg 和2.30～2.89 μg/kg（圖2B）。

圖2 卡芬太尼在給藥5 min 后和嗎啡在給藥20 min 后的鎮(zhèn)痛效應(yīng)

不同劑量的嗎啡對小鼠在20 min 時產(chǎn)生的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)也有顯著的影響[F（4，37）=102.9，P＜0.000 1]。Bonferroni post hoc 檢驗顯示，與陰性對照組相比，嗎啡4、6 和8 mg/kg 三個劑量組均能引起小鼠在20 min 時的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)顯著增強，4 mg/kg 給藥劑量組與6 mg/kg 給藥劑量組的鎮(zhèn)痛效應(yīng)有顯著性差異（P＜0.000 1），但6 mg/kg與8 mg/kg 兩個給藥劑量組的鎮(zhèn)痛效應(yīng)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示嗎啡給藥劑量為6 mg/kg 時可達到最大鎮(zhèn)痛閾值（圖2C）。嗎啡的給藥劑量對數(shù)值與MPE%之間的關(guān)系曲線也呈現(xiàn)出了較為典型的“S”型。同樣計算得到給予嗎啡的小鼠熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)的ED50和95%CI，分別為3.99 mg/kg 和2.85～4.49 mg/kg（圖2D）。

3 討論

3.1 卡芬太尼鎮(zhèn)痛起效快且持久

卡芬太尼的鎮(zhèn)痛作用起效較快，在給藥5 min后即達到鎮(zhèn)痛最大效應(yīng)，而嗎啡的起效稍慢，在給藥20 min 后才達到最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)。由于卡芬太尼的高度親脂性使其能夠非常迅速地穿過血腦屏障，因此，與嗎啡相比，卡芬太尼的起效明顯更快[9-10]。另外，當卡芬太尼的給藥劑量為8 μg/kg 時，最大鎮(zhèn)痛百分率可達100%，可以維持最大鎮(zhèn)痛效率的時間至少為55 min，而嗎啡給藥劑量為8 mg/kg時的最大鎮(zhèn)痛百分率才達到100%，其可以維持最大鎮(zhèn)痛效率的時間只有20 min，即卡芬太尼維持的最大鎮(zhèn)痛效應(yīng)持續(xù)時間比嗎啡更長。有報道稱卡芬太尼對多種有蹄類動物的麻醉作用時間可以長達數(shù)小時[7，11]，另外研究發(fā)現(xiàn)大鼠皮下注射10 μg/kg 卡芬太尼后藥物作用的持續(xù)時間可長達8 h[12]，這些都與本實驗結(jié)果中卡芬太尼作用持久的情況相似。

3.2 卡芬太尼鎮(zhèn)痛強度大

卡芬太尼與嗎啡一樣，均對小鼠產(chǎn)生明顯的劑量依賴性的鎮(zhèn)痛作用。但與嗎啡相比，卡芬太尼的熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)曲線明顯左移。據(jù)報道[13]，芬太尼的效力約為嗎啡的50～100 倍。本研究結(jié)果顯示，嗎啡熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)的ED50為3.99 mg/kg，而本課題組前期的實驗結(jié)果得到芬太尼熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)的ED50為0.08 mg/kg[14]，由此可以得出芬太尼的熱板鎮(zhèn)痛效應(yīng)約為嗎啡的50 倍，與文獻報道的一致。目前國內(nèi)外學者對卡芬太尼鎮(zhèn)痛效應(yīng)的研究報道較少，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的報道大都來自Van Bever WF 等[3]人在1976 年對卡芬太尼進行的一項鎮(zhèn)痛實驗，通過大鼠甩尾實驗測定卡芬太尼的ED50為0.32 μg/kg，并且得到其鎮(zhèn)痛效應(yīng)大約為芬太尼的100 倍和嗎啡的10 031 倍，但該項研究僅提供了摘要，缺乏具體的實驗結(jié)果及描述。而在本實驗中卡芬太尼熱板鎮(zhèn)痛的ED50值為2.60 μg/kg，與芬太尼和嗎啡相比，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)約為芬太尼的31倍和嗎啡1 535 倍，與Van Bever WF 等[3]描述的100 倍和10 031 倍的差異較大，這種差異可能是由動物種類、給藥途徑和測定方法等的不同造成的。

3.3 與卡芬太尼其他早期研究相比較

卡芬太尼是芬太尼哌啶環(huán)的4-甲氧基衍生物，早期研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，在芬太尼哌啶環(huán)的4 位引入一個適當?shù)臉O性基團能大大增強該物質(zhì)的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)[17]，卡芬太尼與μ 阿片受體的結(jié)合親和力是芬太尼的20 倍。而本研究結(jié)果顯示，卡芬太尼的鎮(zhèn)痛效應(yīng)是芬太尼的31 倍，與既往研究結(jié)果一致[18-19]。另外Shafer SL[20]博士使用11C-卡芬太尼作為阿片配體研究人類正電子發(fā)射斷層掃描（PET）時，發(fā)現(xiàn)11C-卡芬太尼的有效劑量為0.1 μg/kg 時，芬太尼的有效劑量為2 μg/kg，而當11C-卡芬太尼和芬太尼的使用劑量分別為0.02 μg/kg 和0.4 μg/kg 時，則幾乎不會產(chǎn)生明顯的效果，這也與卡芬太尼的效力是芬太尼的20 倍相一致，綜合表明卡芬太尼的鎮(zhèn)痛效應(yīng)約為芬太尼的20～30 倍，和本實驗結(jié)果相符。這些卡芬太尼的最新實驗結(jié)果與以往文獻中卡芬太尼比芬太尼效力高100 倍的報道形成對比。盡管如此，相比于芬太尼和嗎啡，卡芬太尼的鎮(zhèn)痛效力也遠遠大于二者，也間接說明了卡芬太尼的濫用量增加以及有關(guān)的意外死亡原因。

4 結(jié)論

卡芬太尼與嗎啡一樣，能對小鼠產(chǎn)生劑量依賴性的鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛的作用強度和持續(xù)時間均顯著強于嗎啡。