劉麗娟，姜向陽，劉慧慧，黃會(huì)，宮向紅，何金霞，劉小靜，王瑋云，張秀珍

山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，煙臺(tái) 264006

撲草凈(prometryn)化學(xué)名稱為4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，分子式為C10H19N5S，是一種高效低毒的內(nèi)吸型除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中主要用于防除一年生禾本科及闊葉草[1]。美國、巴西和加拿大等分別將撲草凈作為除草劑或殺蟲劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)；不過為避免撲草凈對(duì)環(huán)境、人類和動(dòng)物造成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，歐盟自2004年起禁止其作為農(nóng)藥銷售和使用[2]；在我國，撲草凈不僅在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用于防除雜草，還在水產(chǎn)養(yǎng)殖中用于清除大型藻類[3]，但由于其在魚體內(nèi)代謝情況不明，無法對(duì)食品安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)，2010年水產(chǎn)用撲草凈粉被列入中華人民共和國農(nóng)業(yè)部《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》(公告第1435號(hào))[4]。

撲草凈在20 ℃水中溶解度為33 mg·L-1，屬于低水溶性，不易滲入土層下面，并且其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期長，難降解，容易隨著降水、淋溶和徑流的作用由土壤遷移入水體[5]，撲草凈殘留在國內(nèi)外海洋環(huán)境中常有檢出[6-10]。2012年以來，日本在從中國進(jìn)口的海水貝類中多次檢出撲草凈殘留超過基準(zhǔn)值(0.01 mg·kg-1)[11-12]。我國7個(gè)省份多種養(yǎng)殖水產(chǎn)品中檢出撲草凈[13]，水環(huán)境中撲草凈殘留對(duì)水生生物的影響受到廣泛關(guān)注。謝劍等[14]和王田田等[15]先后研究了撲草凈對(duì)不同海洋生物的急性毒性；田秀慧等[16]、劉麗娟等[17]和張望等[18]研究發(fā)現(xiàn)，刺參、菲律賓蛤仔和文蛤均對(duì)養(yǎng)殖海水中的撲草凈有一定富集效應(yīng)；Stará等[19-20]和黃會(huì)等[21]研究發(fā)現(xiàn)，水體中的撲草凈對(duì)鯉魚、克氏原螯蝦和四角蛤蜊抗氧化酶活性產(chǎn)生影響。但在mRNA水平上的研究不足，迄今為止尚未見撲草凈對(duì)水生生物的基因表達(dá)影響研究。

本文以我國沿海重要海水灘涂養(yǎng)殖貝類四角蛤蜊(Mactraveneriformis)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)項(xiàng)目組2018年對(duì)黃河口海域除草劑污染調(diào)查結(jié)果，海水中撲草凈平均檢出濃度為0.24 μg·L-1，最高檢出濃度1.09 μg·L-1，設(shè)計(jì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度0.2、1.0和10.0 μg·L-1并開展脅迫試驗(yàn)，經(jīng)篩選以肌動(dòng)蛋白β-Actin基因作為參比基因[22-23]，研究了不同濃度撲草凈脅迫下，四角蛤蜊6個(gè)解毒相關(guān)基因：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)、細(xì)胞色素P450第四亞族(cytochrome P450, CYP4)和金屬硫蛋白(metallothionein, MT)基因表達(dá)隨時(shí)間變化的規(guī)律，首次從mRNA水平揭示了撲草凈對(duì)水生生物的生理影響，探討了其致毒機(jī)理，以期為海洋生態(tài)環(huán)境保護(hù)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

四角蛤蜊取自東營市黃河口灘涂貝類養(yǎng)殖區(qū)，體質(zhì)量(8.38±0.51) g，殼長(4.10±0.38) cm。小新月菱形藻藻種來自山東省海洋資源與環(huán)境研究院藻種室。養(yǎng)殖用海水取自煙臺(tái)近海，鹽度30±1，pH 7.9～8.1，經(jīng)砂濾后使用。

撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98.0%)，德國Dr. Ehrenstorfer公司；M-MLV Reverse Transcriptase (Promega)；SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) (Takara)；dNTP Mix (Takara)；RNase Inhibitor (BBI)；TRIzol (Invitrogen)；實(shí)驗(yàn)用引物均由華大基因合成；實(shí)驗(yàn)用水均為滅菌一級(jí)水。

1.2 方法1.2.1 撲草凈脅迫實(shí)驗(yàn)

撲草凈脅迫實(shí)驗(yàn)參考劉麗娟等[17]的方法。選擇健康、完整的四角蛤蜊，經(jīng)新鮮海水清洗干凈后，在實(shí)驗(yàn)條件下暫養(yǎng)7 d，連續(xù)充氣，每天定時(shí)換海水1次、投喂實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的小新月菱形藻藻液4次，及時(shí)清除死亡及狀態(tài)不佳個(gè)體。

依據(jù)本項(xiàng)目組2018年4月、7月和10月開展的黃河口貝類增養(yǎng)殖區(qū)海水中除草劑污染特征調(diào)查結(jié)果，海水中撲草凈平均檢出濃度為0.24 μg·L-1，最高檢出濃度1.09 μg·L-1，設(shè)計(jì)撲草凈脅迫濃度為0.2、1.0和10.0 μg·L-1。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組3個(gè)平行水箱，每個(gè)實(shí)驗(yàn)水箱內(nèi)注入新鮮海水100 L，實(shí)驗(yàn)組加入撲草凈儲(chǔ)備液至質(zhì)量濃度為0.2、1.0和10.0 μg·L-1，對(duì)照組僅加相同體積的助溶劑乙醇，各放入經(jīng)暫養(yǎng)的健康四角蛤蜊100 只，實(shí)驗(yàn)水溫(15±1) ℃。采用半靜態(tài)水質(zhì)接觸染毒法，每24 h換一半相同撲草凈質(zhì)量濃度的海水。

1.2.2 取樣與cDNA制備

分別在脅迫實(shí)驗(yàn)開始6、24、48、96、144、240、360和504 h取樣，每次從每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行水箱內(nèi)隨機(jī)取四角蛤蜊3只，放于冰盤上解剖，從每只貝取等量消化腺、鰓絲組織，按組織分別放入標(biāo)記清楚的2.0 mL凍存管中混勻密封，液氮冷凍，-80 ℃保存。

保存的樣品用冷凍研磨儀液氮研磨成粉末，取適量用Trizol法提取總RNA，核酸測定儀測定總RNA濃度，選擇A260/A280>1.8且A260/A230>1.8的樣品，按照M-MLV Reverse Transcriptase使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋10倍，保存于-20 ℃作為qPCR模板備用。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與篩選

實(shí)驗(yàn)所用引物均為自行設(shè)計(jì)，由華大基因合成。參考鮑相渤等[23]和曹滕飛等[24]對(duì)海洋貝類內(nèi)參基因研究方法，選擇β-肌動(dòng)蛋白(beta-Actin,β-Actin)、甘油醛-3-磷酸鹽脫氫酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、β-微管蛋白(beta-tublin,β-Tub)、轉(zhuǎn)錄延伸因子1α(elongation factor 1α, EF1α)、親環(huán)素A(cyclophilin A, CPA)、泛素蛋白(ubiquitin protein, UQP)和18S核糖體RNA(18S rRNA) 7種基因作為備選管家基因。按照本項(xiàng)目組對(duì)四角蛤蜊消化腺轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，用Primer Premier 6.0軟件分別設(shè)計(jì)7種基因的特異性引物。以對(duì)照組、1.0 μg·L-1、10.0 μg·L-1撲草凈脅迫48 h的四角蛤蜊消化腺、鰓樣品cDNA稀釋50倍，分別作為模板進(jìn)行qPCR檢測，用geNorm軟件進(jìn)行參比基因篩選[23]。選擇20≤Ct值≤30的基因進(jìn)行穩(wěn)定性排序，消化腺中各基因穩(wěn)定性β-Tub=β-Actin>GAPDH>UQP>18SrRNA，鰓中各基因穩(wěn)定性β-Actin=18SrRNA>GAPDH>β-Tub，因此選擇β-Actin作為本實(shí)驗(yàn)的參比基因。

CAT基因克隆參考常悅[25]的方法，從NCBI蛋白庫中搜索CAT的雙殼軟體動(dòng)物的蛋白核苷酸序列，用j-CODEHOP設(shè)計(jì)兼并引物，用兼并引物對(duì)四角蛤蜊cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化、克隆、測序、產(chǎn)物測序、BLAST比對(duì)，獲得四角蛤蜊CAT基因序列。從NCBI Genbank中搜索獲得四角蛤蜊β-Actin、SOD、CYP4、GSH-Px、MT和GST等6個(gè)基因mRNA的cDNA序列，用Primer Premier 6.0軟件分別設(shè)計(jì)特異性引物。

選擇qPCR熔解曲線峰值單一、Ct值≤30的引物，進(jìn)行擴(kuò)增效率測定。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)4倍梯度稀釋，共設(shè)5個(gè)系列濃度，測定每種基因的引物擴(kuò)增效率，篩選R2≥0.99、擴(kuò)增效率為90%～110%的引物，用于后續(xù)qPCR研究。相關(guān)引物如表1所示。

表1 四角蛤蜊解毒相關(guān)基因的熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qPCR analysis of genes related to detoxification

1.2.4 指標(biāo)測定

以β-Actin為參比基因，采用2-△△ct法進(jìn)行qPCR相對(duì)定量。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，20 μL反應(yīng)體系包括：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL，cDNA模板2 μL、ddH2O 7.2 μL。qPCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，53 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s(采集熒光信號(hào))，共計(jì)40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后根據(jù)擴(kuò)增曲線情況人工調(diào)節(jié)基線閾值，分析每個(gè)樣品、基因的相對(duì)表達(dá)量(relative quantity, RQ)值。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)均以3個(gè)平行組數(shù)據(jù)的平均值表示。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOWA)分析和Duncan’s多重比較，分析數(shù)值的差異顯著性。以脅迫時(shí)間為橫坐標(biāo)，參考欒偉[26]的方法稍加改動(dòng)，以目的基因相對(duì)表達(dá)量的對(duì)數(shù)值log2(RQ)為縱坐標(biāo)，用WPS office軟件分析作圖。其中0.2 μg·L-1撲草凈脅迫504 h和1.0 μg·L-1撲草凈脅迫240 h的四角蛤蜊消化腺樣品總RNA質(zhì)量不符合要求，未進(jìn)行后續(xù)qPCR測定分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 撲草凈對(duì)四角蛤蜊SOD基因表達(dá)的影響

由圖1可知，四角蛤蜊消化腺中，撲草凈脅迫6 h、24 h時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組SOD表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01)，且1.0 μg·L-1組表達(dá)量高于其他2組；48 h及以后各實(shí)驗(yàn)組均以下調(diào)為主，總體呈波動(dòng)變化趨勢并逐漸接近對(duì)照組。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組均在6 h時(shí)上調(diào)量最高，表達(dá)量分別達(dá)對(duì)照組的7.4倍、24.6倍和14.1倍；最大下調(diào)量分別為對(duì)照組的0.160倍(48 h)、0.340倍(96 h)和0.019倍(48 h)。

圖1 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織SOD mRNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達(dá)量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達(dá)量下調(diào)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 1 Relative quantity of SOD mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Data (0 μg·L-1)=0, data>0 indicates increased expression level, and data<0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), and **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，脅迫6 h時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組四角蛤蜊SOD表達(dá)量均有所上調(diào)，但僅有10.0 μg·L-1組上調(diào)顯著(P<0.01)，表達(dá)量為對(duì)照組的4.9倍；24 h時(shí)1.0 μg·L-1組上調(diào)顯著，表達(dá)量為對(duì)照組的3.3倍，其他2組下調(diào)；48 h及以后各實(shí)驗(yàn)組均以下調(diào)為主，總體呈波動(dòng)變化趨勢并逐漸接近對(duì)照組。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.150倍(24 h)、0.043倍(96 h)、0.10倍(48 h)。

2.2 撲草凈對(duì)四角蛤蜊CAT基因表達(dá)的影響

由圖2可知，撲草凈脅迫下，四角蛤蜊消化腺CAT表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上調(diào)后下調(diào)的變化規(guī)律，其中，6 h、24 h時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組CAT基因表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01)，且1.0 μg·L-1組表達(dá)量高于其他2組；48 h及以后各實(shí)驗(yàn)組均以下調(diào)為主且呈波動(dòng)變化。撲草凈脅迫6 h時(shí)，0.2、1.0和10.0 μg·L-1組CAT基因表達(dá)量均上調(diào)至最大值，分別達(dá)對(duì)照組的29.1倍、48.0倍和20.2倍；下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.13倍(48 h)、0.12倍(504 h)和0.004倍(48 h)。

圖2 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織CAT mRNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達(dá)量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達(dá)量下調(diào)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 2 Relative quantity of CAT mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，0.2 μg·L-1組CAT基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，1.0 μg·L-1組有所下調(diào)但與對(duì)照組差異不明顯、10.0 μg·L-1組顯著上調(diào)；24 h時(shí)，0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組CAT基因表達(dá)量有所下調(diào)但與對(duì)照組差異不明顯，1.0 μg·L-1組顯著上調(diào)(P<0.01)；隨著脅迫時(shí)間的延長，各實(shí)驗(yàn)組CAT基因表達(dá)量不斷上下波動(dòng)，0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值均出現(xiàn)在504 h，分別為對(duì)照組的112.1倍、151.9倍和112.2倍，下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.091倍(48 h)、0.074倍(144 h)和0.061倍(48 h)。

2.3 撲草凈對(duì)四角蛤蜊GSH-Px基因表達(dá)的影響

由圖3可知，撲草凈脅迫下，四角蛤蜊消化腺GSH-Px表達(dá)量總體呈現(xiàn)先上調(diào)后上調(diào)的變化規(guī)律，其中，6 h、24 h時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組GSH-Px基因表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.01)，之后以下調(diào)為主。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對(duì)照組的4.0倍(6 h)、5.0倍(24 h)和4.3倍(24 h)；下調(diào)最大值均低于對(duì)照組的0.001倍(144、360和504 h)。

圖3 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織GSH-Px mRNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達(dá)量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達(dá)量下調(diào)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 3 Relative quantity of GSH-Px mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，0.2 μg·L-1組GSH-Px基因表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，1.0 μg·L-1和10.0 μg·L-1組有所上調(diào)但與對(duì)照組差異不明顯；24 h時(shí)，0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組均顯著上調(diào)，1.0 μg·L-1組GSH-Px基因表達(dá)量不明顯下調(diào)；隨著脅迫時(shí)間的延長，各實(shí)驗(yàn)組GSH-Px基因表達(dá)量不斷上下波動(dòng)，0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對(duì)照組的22.4倍(360 h)、6.4倍(240 h)和207.3倍(504 h)；下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.008倍(504 h)、0.02倍(504 h)和0.01倍(48 h)。

2.4 撲草凈對(duì)四角蛤蜊GST基因表達(dá)的影響

由圖4可知，消化腺中，撲草凈脅迫6 h，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組GST基因表達(dá)均上調(diào)，且上調(diào)量隨著撲草凈濃度的升高而下降，GST基因相對(duì)表達(dá)量(RQ)與脅迫濃度(ρ)呈顯著相關(guān)關(guān)系：ρ=86.688RQ5.445(R2=0.9616)。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對(duì)照組的3.155倍(6 h)、2.241倍(360 h)和2.143倍(240 h)；下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.053倍(48 h)、0.461倍(48 h)和0.036倍(360 h)。

圖4 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織GST mRNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達(dá)量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達(dá)量下調(diào)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 4 Relative quantity of GST mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組GST基因表達(dá)均上調(diào)，且上調(diào)量隨著撲草凈濃度的升高而下降，GST基因RQ值與脅迫濃度(ρ)呈顯著相關(guān)關(guān)系：ρ=146.53RQ4.262(R2=0.9963)。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值分別為對(duì)照組的4.605倍(6 h)、3.459倍(24 h)和1.856倍(6 h)；下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.463倍(96 h)、0.195倍(144 h)和0.308倍(96 h)。

四角蛤蜊GST基因表達(dá)調(diào)控與撲草凈脅迫濃度相關(guān)：脅迫6 h消化腺和鰓的GST相對(duì)表達(dá)量與脅迫濃度呈顯著相關(guān)關(guān)系；且在撲草凈脅迫24、96和360 h，消化腺GST基因表達(dá)均表現(xiàn)為0.2 μg·L-1促進(jìn)、10.0 μg·L-1抑制；撲草凈脅迫24、360和504 h，鰓的GST基因表達(dá)均表現(xiàn)為1.0 μg·L-1促進(jìn)，10.0 μg·L-1抑制，有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制現(xiàn)象。因此認(rèn)為四角蛤蜊GST基因有作為撲草凈污染分子標(biāo)記的潛質(zhì)。

2.5 撲草凈對(duì)四角蛤蜊CYP4基因表達(dá)的影響

由圖5可知，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中，四角蛤蜊消化腺和鰓組織CYP4基因表達(dá)量均顯著下調(diào)至一個(gè)低值(P<0.01)，然后逐步上升，升高到一定程度后逐漸下降，然后又上升，總體呈現(xiàn)反復(fù)波動(dòng)變化趨勢。

圖5 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織CYP4 mRNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達(dá)量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達(dá)量下調(diào)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 5 Relative quantity of CYP4 mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

消化腺中，撲草凈脅迫6 h時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組CYP4基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)，且1.0 μg·L-1組表達(dá)量低于其他2組；0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值分別為0.303倍(6 h)、0.042倍(504 h)和0.034倍(504 h)；上調(diào)最大值分別為對(duì)照組的3.078倍(240 h)、2.102倍(96 h)和4.896倍(48 h)。

鰓中，脅迫6 h時(shí)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組CYP4基因表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.01)，其中1.0 μg·L-1組表達(dá)量高于其他2組；0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值均出現(xiàn)在504 h，分別為0.038倍、0.164倍和0.017倍；上調(diào)最大值分別為對(duì)照組的7.282倍(24 h)、3.720倍(144 h)和7.220倍(24 h)。

2.6 撲草凈對(duì)四角蛤蜊MT基因表達(dá)的影響

由圖6可知，撲草凈脅迫6 h，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組四角蛤蜊消化腺中MT基因表達(dá)量均上調(diào)，其中1.0 μg·L-1組表達(dá)量顯著上調(diào)且達(dá)到最大值(P<0.01)，為對(duì)照組的3.292倍。0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中上調(diào)均不顯著。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.267倍(144 h)、0.413倍(504 h)和0.084倍(48 h)。

圖6 撲草凈脅迫下四角蛤蜊消化腺(a)、鰓(b)組織MT mRNA相對(duì)含量注：數(shù)據(jù)(0 μg·L-1)=0，數(shù)據(jù)>0表示基因表達(dá)量上調(diào)，數(shù)據(jù)<0表示基因表達(dá)量下調(diào)；*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.01)。Fig. 6 Relative quantity of MT mRNA in digestive gland (a), gill (b) of Mactra veneriformis after prometryn exposureNote: Number (0 μg·L-1)=0, number >0 indicates increased expression level, number <0 indicates decreased expression level; *indicates a significant difference compared with the control group (P<0.05), **indicates a significant difference compared with the control group (P<0.01).

鰓中，撲草凈脅迫6 h，MT基因表達(dá)均無顯著變化；24 h，1.0 μg·L-1組表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.01)，而0.2 μg·L-1和10.0 μg·L-1組顯著下調(diào)(P<0.01)。0.2、1.0和10.0 μg·L-1組上調(diào)最大值均出現(xiàn)在504 h，分別為對(duì)照組的12.764倍、9.569倍和6.104倍；下調(diào)最大值分別為對(duì)照組的0.430倍(24 h)、0.436倍(144 h)和0.322倍(24 h)。

3 討論(Discussion)

3.1 四角蛤蜊應(yīng)對(duì)撲草凈脅迫解毒代謝相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)分析

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP)酶系是一個(gè)超基因家族，參與多種親脂外源物和內(nèi)源物質(zhì)在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化與代謝過程，在解毒和激活食物鏈中的鹵代、非鹵代烴中起著重要的作用[27]。CYP4是CYP家族中的一個(gè)重要亞族。有研究表明，持久性有機(jī)污染物(persistent organic pollutants, POPs)進(jìn)入生物體細(xì)胞內(nèi)后，其中一部分與受體蛋白結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，介導(dǎo)Ⅰ相代謝酶基因如CYP4基因的表達(dá)，將污染物轉(zhuǎn)化為更具極性的代謝中間產(chǎn)物，誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶基因如GST-pi的表達(dá)，加速代謝物排出體外[28]。GST催化外源化合物分子或經(jīng)第Ⅰ相反應(yīng)的代謝產(chǎn)物以及氧化應(yīng)激引起親脂性過氧化損傷化合物與還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)的巰基(—SH)結(jié)合，保護(hù)生物大分子免受侵襲[29]。與多

氯聯(lián)苯(PCB)對(duì)翡翠貽貝CYP4基因表達(dá)具有顯著的誘導(dǎo)作用不同[30]，在撲草凈脅迫實(shí)驗(yàn)過程中，最初四角蛤蜊消化腺和鰓組織中CYP4基因相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)顯著下調(diào)(P<0.01)，而后其表達(dá)量反復(fù)上下波動(dòng)變化?？赡苁怯捎谖廴疚锊煌瑢?duì)四角蛤蜊CYP基因家族中不同亞族的基因表達(dá)影響不同所致，具體規(guī)律需開展進(jìn)一步研究。脅迫實(shí)驗(yàn)開始后，四角蛤蜊消化腺和鰓組織GST基因表達(dá)均先上調(diào)，而后呈現(xiàn)以下調(diào)為主的波動(dòng)變化趨勢，相同實(shí)驗(yàn)組不同組織中表達(dá)量變化不完全同步，但均顯示GST有作為撲草凈對(duì)四角蛤蜊污染的生物標(biāo)志物的潛力。

許多外源性化學(xué)物質(zhì)是通過誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量活性氧，從而誘發(fā)其多種損傷。生物體的抗氧化防御系統(tǒng)在消除活性氧、降低機(jī)體損傷方面發(fā)揮著重要作用。撲草凈脅迫24 h，四角蛤蜊消化腺中3種重要的抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px基因表達(dá)均被顯著誘導(dǎo)(P<0.01)，而同時(shí)檢測的SOD、CAT酶活性無顯著變化，GSH-Px酶活性被顯著誘導(dǎo)[20]，顯示生物體中的基因表達(dá)調(diào)控與酶活性調(diào)控不同步，二者沒有明確的對(duì)應(yīng)關(guān)系。0.2 μg·L-1和1.0 μg·L-1撲草凈脅迫下，四角蛤蜊的消化腺組織中SOD基因表達(dá)量最高分別達(dá)對(duì)照組的7.4倍和24.6倍，而SOD酶活性誘導(dǎo)率最高為29.0%和34.9%[20]，基因表達(dá)水平的變化程度比酶活性變化顯著，可見與蛋白水平相比，基因的表達(dá)水平是更為靈敏的污染物暴露作用的生物標(biāo)記物[31]。SOD、CAT、GSH-Px和MT是抗氧化防御系統(tǒng)的重要成員，其中SOD可催化超氧陰離子與氫離子反應(yīng)生成過氧化氫，從而解除活性氧對(duì)機(jī)體的損傷[32]；CAT催化H2O2分解為H2O與O2，在減輕活性氧自由基對(duì)機(jī)體細(xì)胞的氧化損傷方面起著重要作用[33]；GSH-Px可清除機(jī)體內(nèi)的H2O2及脂類氫過氧化物，防止細(xì)胞膜和其他生物組織免受過氧化損傷[34]；MT是一類分子量較小的富含巰基和半胱氨酸的蛋白質(zhì)，對(duì)多種重金屬具高親和性，在體內(nèi)具有顯著和廣譜的抗氧化作用效果。撲草凈脅迫實(shí)驗(yàn)中，四角蛤蜊消化腺呈現(xiàn)SOD、CAT、GSH-Px和MT基因表達(dá)均先上調(diào)，而后呈現(xiàn)以下調(diào)為主的波動(dòng)變化趨勢；鰓中，SOD、GSH-Px基因表達(dá)均先上調(diào)，1.0 μg·L-1組的CAT基因表達(dá)先下調(diào)其他組先上調(diào)，MT基因表達(dá)先上調(diào)其他組先下調(diào)，而后反復(fù)波動(dòng)變化。因此推斷撲草凈脅迫使四角蛤蜊體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，誘導(dǎo)了抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)，這是生物體適應(yīng)環(huán)境變化的一種應(yīng)急性解毒措施。隨著撲草凈脅迫時(shí)間的延長，四角蛤蜊不同組織中抗氧化防御系統(tǒng)的部分基因表達(dá)受到不同程度的抑制，可能導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力下降，引起機(jī)體對(duì)環(huán)境中其他威脅的防御能力下降。

本研究發(fā)現(xiàn)，相同實(shí)驗(yàn)時(shí)間不同濃度撲草凈脅迫下，四角蛤蜊相同組織的同一基因表達(dá)調(diào)節(jié)趨勢不盡相同，分析認(rèn)為由于生物體解毒代謝是一個(gè)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的過程，基因表達(dá)調(diào)節(jié)與底物種類、濃度、脅迫時(shí)間和代謝產(chǎn)物濃度等因素密切相關(guān)，該結(jié)果與菲律賓蛤仔對(duì)撲草凈的生物富集規(guī)律研究結(jié)果一致[17]。撲草凈脅迫504 h，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組四角蛤蜊鰓組織的CAT、GSH-Px、CYP4和MT基因，和消化腺組織的CAT、GSH-Px和CYP4基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比均出現(xiàn)顯著變化(P<0.01)。黃會(huì)等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在0.2、1.0和10.0 μg·L-1撲草凈脅迫下15 d和21 d時(shí)，四角蛤蜊鰓組織形態(tài)與對(duì)照組相比均發(fā)生不同程度變化，且時(shí)間-效應(yīng)和濃度-效應(yīng)明顯。因此認(rèn)為，長時(shí)間撲草凈脅迫超出四角蛤蜊抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致其組織結(jié)構(gòu)損傷，從而引起部分組織的基因表達(dá)調(diào)控異常。

3.2 以貝類解毒基因作為撲草凈污染生物標(biāo)記物在近岸海域研究中應(yīng)用的可行性

研究發(fā)現(xiàn)，四角蛤蜊的基因表達(dá)調(diào)控對(duì)撲草凈脅迫十分敏感，即使在最低脅迫濃度0.2 μg·L-1，所測6種解毒有關(guān)基因表達(dá)量均在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生變化。徐雄等[35]調(diào)查了我國8個(gè)重點(diǎn)流域水體農(nóng)藥污染情況，撲草凈的檢出率達(dá)59.3%，濃度范圍ND～104.2 ng·L-1；張望等[36]對(duì)海州灣沿岸水體調(diào)查結(jié)果顯示，撲草凈檢出率80%，濃度最大值31.9 ng·L-1；喬丹[37]調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳山灣、東營河口區(qū)和東營廣饒縣海域海水中撲草凈最高值分別為342、538和196 ng·L-1；鄭磊等[38]調(diào)查南四湖流域撲草凈在地表水中廣泛存在，濃度介于0～667.7 ng·L-1之間，且推導(dǎo)撲草凈水環(huán)境基準(zhǔn)值為82.4 ng·L-1。本項(xiàng)目組在黃河口貝類增養(yǎng)殖區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，海水中撲草凈檢出率為100%，平均檢出濃度0.24 μg·L-1，最高檢出濃度1.09 μg·L-1?？梢娢覈逗Ｓ驌洳輧魵埩魪V泛存在，山東近岸多個(gè)監(jiān)測點(diǎn)撲草凈質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于水環(huán)境基準(zhǔn)值，且足以對(duì)四角蛤蜊基因表達(dá)產(chǎn)生影響，證明以雙殼貝類解毒代謝相關(guān)基因作為撲草凈污染生物標(biāo)記物，在近岸海域研究中的應(yīng)用具有可行性。本研究填補(bǔ)了在mRNA水平上撲草凈對(duì)海洋生物影響研究的空白，為評(píng)價(jià)撲草凈殘留對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)提供了參考依據(jù)。