邱 宇 高洪蓮 于 睿 李欣蒙 崔鈺瑩 張 磊

近視是最常見的眼部疾病[1-3]，高度近視眼底病變是致盲的主要原因[4]。東亞和東南亞一些地區(qū)的青少年近視率為80%～90%[5]，青少年的視力健康問題日益突出。多種視網(wǎng)膜信號(hào)分子已被證實(shí)與近視的發(fā)生和發(fā)展息息相關(guān)，如多巴胺(DA)、胰高血糖素、乙酰膽堿等，其中，DA作為視網(wǎng)膜中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，可以調(diào)節(jié)視覺信號(hào)和屈光發(fā)育[6]。大量研究表明，玻璃體內(nèi)注射DA或DA受體激動(dòng)劑可以抑制形覺剝奪性近視形成，DA是近視發(fā)展的停止信號(hào)[7-8]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)、修復(fù)和營(yíng)養(yǎng)的作用[9]，而當(dāng)VEGF水平降低時(shí)，DA相關(guān)疾病阿爾茨海默病(AD)的風(fēng)險(xiǎn)增加[10]，基于此，我們推測(cè)玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物可能會(huì)影響視網(wǎng)膜中DA水平。本研究通過(guò)建立形覺剝奪性近視(FDM)模型，探討抗VEGF藥物康柏西普(Conbercept)玻璃體內(nèi)注射對(duì)FDM豚鼠視網(wǎng)膜中DA水平的影響及其作用機(jī)制，為近視相關(guān)DA信號(hào)通路和近視防控研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取健康3周齡英國(guó)短毛三色豚鼠60只(濟(jì)南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心提供)，雌雄不限，體重150～200 g。本研究經(jīng)濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)和使用嚴(yán)格遵循濱州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物管理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑與儀器10 g·L-1Conbercept(成都康弘生物科技有限公司)；復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥中國(guó)有限公司)；Davidson固定液(北京索萊寶生物科技有限公司)；OCT冰凍切片包埋劑(美國(guó)Sakura公司)；兔抗鼠TH多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；山羊抗兔IgG(英國(guó)Abcam公司)；帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技有限公司)；A型超聲(法國(guó)Quantel公司)；冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；正置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及FDM模型構(gòu)建60只3周齡三色豚鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組、FDM組、FDM+生理鹽水組、FDM+Conbercept組，每組15只?？瞻讓?duì)照組豚鼠雙眼不作任何處理，其余3組豚鼠采用半透明無(wú)毒乳膠氣球套頭，修剪氣球暴露左眼、口鼻和耳部，遮蓋右眼2周建立FDM模型。

1.2.2 玻璃體內(nèi)Conbercept注射造模前10 min對(duì)FDM+生理鹽水組和FDM+Conbercept組豚鼠進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射藥物1次，所有實(shí)驗(yàn)均在右眼操作，提前1 d使用左氧氟沙星滴眼液滴右眼(每天3次)。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，碘伏消毒眼周，聚維酮碘消毒結(jié)膜囊后用生理鹽水沖洗干凈，根據(jù)分組分別向FDM+生理鹽水組和FDM+Conbercept組注射0.002 mL生理鹽水和0.02 mg(0.002 mL)Conbercept，注射后左氧氟沙星滴眼液滴眼(每天3次)。

1.2.3 眼部生物學(xué)參數(shù)測(cè)量分別在遮蓋前和遮蓋2周后測(cè)量各組豚鼠的屈光度和眼軸長(zhǎng)度。測(cè)量屈光度前，復(fù)方托吡卡胺滴眼液滴右眼，睫狀肌充分麻痹后使用帶狀光檢影鏡驗(yàn)光，達(dá)到滿圓時(shí)記錄中和度數(shù)，并加上工作距離，連續(xù)測(cè)量5次取平均值。測(cè)量眼軸長(zhǎng)度前，鹽酸丙美卡因滴眼液滴右眼，角膜表面麻醉后使用眼部A超測(cè)量眼軸長(zhǎng)度，設(shè)置前房聲速 1557.5 m·s-1，晶狀體聲速1723.3 m·s-1，玻璃體聲速1540 m·s-1，增益調(diào)整至中等，測(cè)量模式選擇手動(dòng)測(cè)量，連續(xù)測(cè)量5次取平均值。

1.2.4 免疫熒光法檢測(cè)豚鼠視網(wǎng)膜中酪氨酸羥化酶的表達(dá)頸椎脫臼處死各組豚鼠，冰上摘取右眼眼球，置于Davidson固定液中，3 h后取出眼球，去除角膜、虹膜、晶狀體和玻璃體，制成眼杯，依次放入100 g·L-1、200 g·L-1和300 g·L-1的蔗糖溶液中梯度脫水，充分脫水后取出眼杯，吸水紙去除多余溶液，OCT包埋，冰凍切片機(jī)速凍、切片，制備冰凍切片，4 ℃丙酮處理10 min，自然風(fēng)干，1倍磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次10 min；3 g·L-1Triton x-100洗3次，每次10 min；PBS洗3次，每次10 min；滴加50 g·L-1BSA封閉液，37 ℃孵育30 min;滴加兔抗鼠酪氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體(11000)，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS洗3次，每次10 min；滴加山羊抗兔IgG(1500)，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次10 min；滴加含DAPI的封片劑封片，正置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.5 高效液相色譜法檢測(cè)豚鼠視網(wǎng)膜中DA和3,4-二羥基苯乙酸的含量頸椎脫臼處死各組豚鼠，冰上摘取右眼眼球，快速分離視網(wǎng)膜并稱重，加入勻漿液，-40 ℃勻漿，4℃離心，取上清后上樣檢測(cè)。使用HPLC-ECD檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)DA和3,4-二羥基苯乙酸(DOPAC)含量。色譜柱為 Acclaim C18色譜柱(2.2 μm，2.1×100 mm)，流動(dòng)相含90 mmol·L-1NaH2PO4、50 mmol·L-1檸檬酸、1.7 mmol·L-1OSA、50 μmol·L-1EDTA和36 g·L-1乙腈，流速為0.2 mL·min-1，柱溫保持在38 ℃，檢測(cè)池電壓設(shè)置350 mV，Guard Cell 電壓設(shè)置360 mV。所有數(shù)據(jù)均由Chromeleon 6.9色譜工作站進(jìn)行采集與分析，以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算目標(biāo)物含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究的計(jì)量資料數(shù)據(jù)經(jīng)W檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)經(jīng)Levene檢驗(yàn)方差齊性。各組數(shù)據(jù)總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 豚鼠眼部生物學(xué)參數(shù)分析遮蓋前，4組豚鼠雙眼均呈遠(yuǎn)視狀態(tài)，各組豚鼠間的屈光度和眼軸長(zhǎng)度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。遮蓋2周后，與空白對(duì)照組相比，F(xiàn)DM組、FDM+生理鹽水組、FDM+Conbercept組豚鼠的屈光度和眼軸長(zhǎng)度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。與FDM組比較，F(xiàn)DM+生理鹽水組豚鼠屈光度和眼軸長(zhǎng)度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)。與FDM組和FDM+生理鹽水組相比，F(xiàn)DM+Conbercept組豚鼠近視度升高，眼軸長(zhǎng)度延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(表1)。

表1 4組豚鼠建模前后屈光度和眼軸長(zhǎng)度的比較

2.2 免疫熒光檢測(cè)結(jié)果免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，各組豚鼠視網(wǎng)膜厚度正常，結(jié)構(gòu)完整，視網(wǎng)膜中TH表達(dá)呈綠色點(diǎn)狀熒光(圖1箭頭指示區(qū)域)，主要位于無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞層?？瞻讓?duì)照組表達(dá)TH的細(xì)胞數(shù)量為(36.250±6.112)個(gè)，F(xiàn)DM組和FDM+生理鹽水組表達(dá)TH的細(xì)胞數(shù)量分別為(26.125±4.454)個(gè)和(25.875±4.121)個(gè)，較空白對(duì)照組均降低(均為P<0.05)。與FDM組和FDM+生理鹽水組相比，F(xiàn)DM+Conbercept組表達(dá)TH的細(xì)胞數(shù)量[(18.375±3.889)個(gè)]均更低(均為P<0.05)。

2.3 高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果4組豚鼠視網(wǎng)膜中DA和DOPAC的色譜分離圖見圖2，根據(jù)出峰時(shí)間確定其所代表的物質(zhì)，計(jì)算各物質(zhì)峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，最后將比值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得出所測(cè)物質(zhì)的含量，結(jié)果顯示，遮蓋2周后，與空白對(duì)照組比較，F(xiàn)DM組、FDM+生理鹽水組、FDM+Conbercept組的DA和DOPAC差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與FDM組比較，F(xiàn)DM+生理鹽水組DA和DOPAC差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；與FDM+生理鹽水組比較，F(xiàn)DM+Conbercept組DA和DOPAC含量均減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；4組間的DA代謝率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.964)(表2)。

視網(wǎng)膜中TH表達(dá)呈綠色點(diǎn)狀熒光(箭頭指示區(qū)域)，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光；ONL：視網(wǎng)膜外核層；INL：視網(wǎng)膜內(nèi)核層。圖1 豚鼠視網(wǎng)膜中TH的表達(dá)(×400)

A:標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖；B:空白對(duì)照組色譜圖；C：FDM組色譜圖；D：FDM+生理鹽水組色譜圖；E：FDM+Conbercept組色譜圖。圖2 豚鼠視網(wǎng)膜中DA和DOPAC的色譜分離圖

表2 各組豚鼠視網(wǎng)膜中DA、DOPAC的含量

3 討論

視網(wǎng)膜DA系統(tǒng)對(duì)正常視覺發(fā)育至關(guān)重要，在動(dòng)物近視模型的視網(wǎng)膜中，DA水平會(huì)顯著降低[11]，缺乏視網(wǎng)膜DA信號(hào)會(huì)導(dǎo)致近視的發(fā)展[12]，而通過(guò)注射DA激動(dòng)劑可抑制近視發(fā)展[13]，這表明DA是近視的停止信號(hào)，對(duì)視覺有保護(hù)作用。DA有5種受體，根據(jù)DA受體對(duì)腺苷酸環(huán)化酶活性的不同影響，可分為D1類受體和D2類受體[14]。有研究表明，DA受體激動(dòng)劑在近視中的抑制作用是通過(guò)激活D2類受體介導(dǎo)的[15]，但也有部分研究表明，D1類和D2類受體的激活達(dá)到平衡狀態(tài)對(duì)抑制近視的發(fā)生發(fā)展也很重要[16]。DA在近視發(fā)展中的作用是復(fù)雜的，在FDM和透鏡誘導(dǎo)性近視(LIM)之間的作用機(jī)制可能并不相同，DA在抑制FDM中更為顯著，在抑制LIM中相對(duì)不明顯，存在更多的爭(zhēng)議[17]。本研究選擇建立FDM模型，觀察注射抗VEGF藥物后FDM中視網(wǎng)膜DA的變化以及豚鼠的屈光狀態(tài)。

DA是兒茶酚胺類物質(zhì)，其合成起自于酪氨酸，酪氨酸在TH的作用下轉(zhuǎn)化為左旋多巴，再經(jīng)左旋多巴脫氫酶的作用轉(zhuǎn)化為DA[18]，在視網(wǎng)膜中主要由無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞分泌，代謝產(chǎn)物為DOPAC，其中，TH為DA生成的主要限速酶，DOPAC反映了DA的釋放量[19]。本研究結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組的輕度遠(yuǎn)視狀態(tài)相比，F(xiàn)DM組豚鼠右眼變?yōu)榻暊顟B(tài)，眼軸長(zhǎng)度延長(zhǎng)，視網(wǎng)膜中DA和DOPAC的含量、TH的表達(dá)均下降，DA/DOPAC比值不變，這與Feldkaemper等[20]的研究結(jié)果一致。而與FDM組和FDM+生理鹽水組豚鼠相比，F(xiàn)DM+Conbercept組豚鼠右眼更為向近視方向偏移，視網(wǎng)膜中DA和DOPAC的含量進(jìn)一步下降，DA的合成限速酶TH的表達(dá)更弱，DA代謝率依然未變，這表明注射Conbercept后FDM+Conbercept組豚鼠DA水平降低，并可分析出其降低可能是因?yàn)镈A的合成減少而非代謝增多。

VEGF是一種促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，可增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有增殖和抗凋亡作用。VEGF家族主要成員有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F 、PIGF等[21-22]，其中，VEGF-A、VEGF-B、PIGF對(duì)各種類型的神經(jīng)元，包括多巴胺能神經(jīng)元有神經(jīng)保護(hù)、修復(fù)和營(yíng)養(yǎng)作用[9]，而當(dāng)VEGF水平降低時(shí)，患AD的風(fēng)險(xiǎn)隨之增高[23]。同時(shí)，內(nèi)源性視網(wǎng)膜VEGF-A在維持視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的存活和缺血預(yù)處理介導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)中發(fā)揮著重要的作用[24]，并可刺激神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)的多個(gè)信號(hào)因子，包括Akt、 ERK等[25-26]。Conbercept是一種相對(duì)分子質(zhì)量為143 000的抗VEGF人源化重組融合蛋白，作用靶點(diǎn)為VEGF-A、VEGF-B和PIGF[27]?？筕EGF藥物Conbercept玻璃體內(nèi)注射引起DA水平下降及近視度升高的機(jī)制可能是Conbercept阻斷了VEGF-A、VEGF-B、PIGF與受體結(jié)合，影響了視網(wǎng)膜DA神經(jīng)系統(tǒng)的活性，導(dǎo)致DA的合成減少，DA水平下降，視網(wǎng)膜缺乏DA信號(hào)，促使屈光狀態(tài)進(jìn)一步向近視方向偏移。

綜上所述，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了DA和近視之間的緊密聯(lián)系，也證實(shí)了玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物會(huì)使FDM豚鼠視網(wǎng)膜中的DA水平更低，并導(dǎo)致豚鼠眼軸延長(zhǎng)、近視度升高，其作用機(jī)制可能是抗VEGF藥物影響了視網(wǎng)膜多巴胺能神經(jīng)元的活性，導(dǎo)致TH水平下降，DA合成減少，DA水平下降，屈光狀態(tài)進(jìn)一步向近視方向偏移，但具體的信號(hào)通路尚不明確，且本實(shí)驗(yàn)僅能證明0.02 mg的Conbercept玻璃體內(nèi)注射對(duì)豚鼠視網(wǎng)膜DA水平及屈光狀態(tài)的影響，抗VEGF藥物對(duì)豚鼠的此種影響是否存在藥物劑量依賴關(guān)系以及VEGF或VEGF受體激動(dòng)劑是否可以抑制近視的發(fā)生發(fā)展，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。本研究為近視相關(guān)DA信號(hào)通路和近視防控研究提供了新的思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。