劉自強(qiáng) 接傳紅 王建偉 鄧 宇 李媛媛

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是我國工作年齡人群中排名第一位的可預(yù)防性致盲性疾病[1]。既往多數(shù)研究認(rèn)為，DR的病理過程主要包括周細(xì)胞喪失、內(nèi)皮細(xì)胞增生、基底膜增厚、管腔狹窄或閉塞、視網(wǎng)膜缺血缺氧、血管新生等[2]。近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)DR患者血清中存在多種自身抗體，如抗醛縮酶抗體和抗周細(xì)胞抗體等[3-4]，抗生素、免疫抑制劑和皮質(zhì)類固醇藥物治療DR的有效性表明[5]，免疫系統(tǒng)失調(diào)和炎癥是DR病理生理學(xué)的重要因素。因此，本文從血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)、小膠質(zhì)細(xì)胞、補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞因子等方面進(jìn)行綜述，探討免疫機(jī)制在DR血管病變和神經(jīng)變性中的作用。

1 BRB

視網(wǎng)膜受高度復(fù)雜免疫機(jī)制的保護(hù)，BRB作為視網(wǎng)膜與人體免疫系統(tǒng)間的一道天然物理屏障，是視網(wǎng)膜免疫防護(hù)的第一道防線。BRB由血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(iBRB)和血-視網(wǎng)膜外屏障(oBRB)組成。其中iBRB由視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成，oBRB由位于Bruch膜上的視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞之間的緊密連接構(gòu)成[6]。BRB將視網(wǎng)膜與外源性病原體隔離，使組織與全身免疫系統(tǒng)避免免疫監(jiān)視，為視網(wǎng)膜提供第一層免疫保護(hù)，一旦BRB被突破，則觸發(fā)視網(wǎng)膜免疫抑制，啟動(dòng)第二道、第三道免疫防護(hù)[7]。

在DR中，由于廣泛的BRB損傷，視網(wǎng)膜免疫特權(quán)被破壞，免疫耐受性大幅度降低，免疫偏離功能喪失，大量循環(huán)免疫細(xì)胞浸潤視網(wǎng)膜，激活先天性免疫或獲得性免疫，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)元的進(jìn)行性退化[8]。BRB可能通過以下途徑參與DR的免疫學(xué)發(fā)?。?1)BRB的損傷導(dǎo)致血漿成分外滲和脂蛋白修飾，引起自身抗體合成，進(jìn)而導(dǎo)致免疫復(fù)合物的形成。DR中免疫復(fù)合物形成與周細(xì)胞丟失、白細(xì)胞淤滯、巨噬細(xì)胞活化等有關(guān)[4]。(2)在DR的早期階段，視網(wǎng)膜周細(xì)胞抗體可能與周細(xì)胞表面抗原發(fā)生反應(yīng)，通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)誘導(dǎo)周細(xì)胞損傷，導(dǎo)致iBRB的破壞[9]。同時(shí)，iBRB的破壞使免疫球蛋白和補(bǔ)體因子進(jìn)入視網(wǎng)膜周細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性效應(yīng)，導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管和神經(jīng)的進(jìn)一步損傷。(3)高血糖下視網(wǎng)膜的BRB被破壞，周細(xì)胞表達(dá)II型膠原蛋白增加，II型膠原蛋白與免疫活性細(xì)胞直接接觸，激活自身免疫機(jī)制，誘發(fā)DR的發(fā)生發(fā)展[10]。Nakaizumi等[11]發(fā)現(xiàn)，DR患者血清中II型膠原蛋白IgG抗體水平顯著高于非炎癥性眼病患者。Balashova等[12]亦報(bào)道了DR患者的血清和淚液中II型膠原蛋白抗體和免疫復(fù)合物水平增高。

2 小膠質(zhì)細(xì)胞

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中先天免疫系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞，視網(wǎng)膜和視神經(jīng)作為CNS眼部的外延，小膠質(zhì)細(xì)胞在眼病的免疫學(xué)發(fā)病中扮演著重要角色[13]。小膠質(zhì)細(xì)胞主要位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGC)層、內(nèi)叢狀層、外叢狀層，作為免疫細(xì)胞參與免疫反應(yīng)，維持視網(wǎng)膜內(nèi)穩(wěn)態(tài)[14-15]。在高血糖、缺血、缺氧、血脂異常等環(huán)境下，小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活，由分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜖?，進(jìn)一步發(fā)生增殖、遷移和極化，發(fā)揮著保護(hù)和損傷視網(wǎng)膜組織的雙重作用[14]。

近年來，DR中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活已通過基礎(chǔ)和臨床研究得到證實(shí)。早期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠發(fā)病4個(gè)月后，視網(wǎng)膜各層小膠質(zhì)細(xì)胞密度明顯增加，且分枝狀突起變厚變短，小膠質(zhì)細(xì)胞呈激活狀態(tài)[16]；另一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，表明其增殖、遷移能力增強(qiáng)[17]； Arroba等[18]在5周齡DR小鼠模型視網(wǎng)膜內(nèi)核層中發(fā)現(xiàn)了活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，并檢測(cè)到雙免疫陽性細(xì)胞的增加，表明小膠質(zhì)細(xì)胞在DR的早期階段就表現(xiàn)出M2抗炎表型。在人類視網(wǎng)膜中，小膠質(zhì)細(xì)胞激活存在于DR的不同階段[19]。Zeng等[19]使用HLA-DR抗原、CD45或CD68抗體對(duì)不同階段DR患者視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)在DR的不同階段小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量均明顯增多，并呈肥大狀態(tài)，且在部分黃斑囊樣水腫患者的視網(wǎng)膜中，小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤到視網(wǎng)膜外部和視網(wǎng)膜下間隙中； Scott等[3]使用多西環(huán)素治療輕中度非增生型DR(NPDR)患者、Cukras等[20]使用米諾環(huán)素治療DR患者，均取得了較好的臨床療效。而多西環(huán)素、米諾環(huán)素均屬于抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化的藥物，亦從側(cè)面證明小膠質(zhì)細(xì)胞激活在DR發(fā)病中扮演著重要角色。

小膠質(zhì)細(xì)胞可能通過以下途徑參與DR的發(fā)生發(fā)展：(1)小膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬RGC，造成其丟失[14，21]。Anderson等[22]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞通過結(jié)合補(bǔ)體受體3，吞噬非凋亡新生RGC，來調(diào)節(jié)胚胎小鼠的RGC密度。Bai等[23]發(fā)現(xiàn)，醛酮還原酶1可通過激活核因子κB(NF-κB)通路誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而抑制RGC的活性并促進(jìn)其凋亡。(2)小膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞毒性物質(zhì)、炎癥因子介導(dǎo)RGC的凋亡和死亡。Altmann等[24]認(rèn)為，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過激活NF-κB和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶信號(hào)通路，釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)和炎癥介質(zhì)，介導(dǎo)RGC凋亡。(3)小膠質(zhì)細(xì)胞通過破壞BRB的結(jié)構(gòu)和功能，參與DR的發(fā)病。還有研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞通過改變視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞的丟失等途徑破壞iBRB，從而在DR發(fā)病中發(fā)揮作用[25]。Yun等[26]在小鼠視網(wǎng)膜上發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌白細(xì)胞介素(IL)-6誘導(dǎo)STAT3通路的激活，降低緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)來增加小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮通透性。目前關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞在oBRB中的作用尚不完全明確。Jo等[27]在不同類型的DR小鼠模型中觀察到小膠質(zhì)細(xì)胞在RPE層的聚集，提示激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可能以跨RPE細(xì)胞的方式向視網(wǎng)膜外遷移。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL-6處理的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)，進(jìn)而通過激活NF-κB通路降低RPE細(xì)胞中ZO-1的表達(dá)，從而破壞DR中的oBRB。(4)小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)視網(wǎng)膜新生血管形成[15]。Boeck等[28]在氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變 (OIR) 的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)具有增殖和遷移表型的小膠質(zhì)細(xì)胞在視網(wǎng)膜的缺血和新生血管區(qū)域聚集。Xu等[29]使用OIR小鼠視網(wǎng)膜冷凍切片進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，阿米巴狀小膠質(zhì)細(xì)胞存在于表層和神經(jīng)纖維層中，與新生血管形成密切相關(guān)。

3 補(bǔ)體系統(tǒng)

補(bǔ)體的發(fā)現(xiàn)可以追溯到19世紀(jì)末， Ling等[30]在血液中發(fā)現(xiàn)了一種未知的不耐熱的裂解物質(zhì)，它對(duì)各種細(xì)菌具有活性，后被命名為補(bǔ)體。補(bǔ)體系統(tǒng)由30多種血漿蛋白、膜結(jié)合受體和調(diào)節(jié)蛋白組成，是非特異性先天免疫反應(yīng)的重要組成部分。大多數(shù)血清中的補(bǔ)體是無活性的酶原狀態(tài)，通過經(jīng)典途徑、替代途徑和凝集素途徑被激活，激活后表現(xiàn)出明顯的生物活性。

研究表明，DR中的視網(wǎng)膜血管損傷與補(bǔ)體系統(tǒng)激活密切相關(guān)[8]。Gerl等[31]發(fā)現(xiàn)，DR患者的Bruch膜、脈絡(luò)膜毛細(xì)血管含有較高水平的C3d和C5b-9復(fù)合物，同時(shí)具有膜攻擊復(fù)合物的沉積；Laura等[32]發(fā)現(xiàn)高濃度的補(bǔ)體C3與DR的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)； Xu等[33]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C5基因多態(tài)性與PDR具有相關(guān)性。

補(bǔ)體系統(tǒng)激活可能通過以下途徑促進(jìn)DR的發(fā)生發(fā)展：(1)經(jīng)典途徑：目前缺乏對(duì)DR患者視網(wǎng)膜中經(jīng)典途徑蛋白的檢測(cè)，故對(duì)經(jīng)典途徑在DR發(fā)病機(jī)制中的作用研究相對(duì)較少。García-Ramírez等[34]研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體中C4b、C3、C9、因子B相關(guān)補(bǔ)體蛋白明顯高于非糖尿病患者，其中對(duì)C3、因子B進(jìn)一步行蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)，與RT-PCR定量定時(shí)測(cè)定mRNA表達(dá)結(jié)果一致，說明DR發(fā)病與經(jīng)典途徑補(bǔ)體激活有密切聯(lián)系。孫洪巖等[35]發(fā)現(xiàn)，C4在DR患者血清中呈高表達(dá)，推測(cè)DR病理進(jìn)程中有補(bǔ)體所誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和經(jīng)典途徑補(bǔ)體系統(tǒng)的激活； Huang等[36]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，糖尿病小鼠外泌體中缺乏IgG會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜血管損傷減少，并進(jìn)一步通過C1激活實(shí)驗(yàn)推測(cè)血漿中載有IgG的外泌體可能通過結(jié)合C1復(fù)合物，使C1復(fù)合物蛋白水解被激活，從而激活經(jīng)典補(bǔ)體途徑，導(dǎo)致下游視網(wǎng)膜血管損傷。(2)替代途徑：DR患者中存在補(bǔ)體替代途徑早期階段被過度激活，表明補(bǔ)體介導(dǎo)的炎癥可能有助于加速DR[37]。在人類和小鼠糖尿病研究中已經(jīng)證實(shí)，補(bǔ)體系統(tǒng)的兩種膜結(jié)合抑制劑CD55和CD59的水平降低，這些發(fā)現(xiàn)表明DR中存在補(bǔ)體替代途徑的激活[38]； Mandava等[39]研究發(fā)現(xiàn)，PDR患者玻璃體內(nèi)16種補(bǔ)體成分水平顯著高于非糖尿病患者，其中C3a/C3、C5a/C5和Ba/因子B的比率較對(duì)照組更高，C3、C5和因子B的局部和眼內(nèi)激活表明PDR患者補(bǔ)體替代途徑的激活。(3)凝集素途徑： Geng等[40]通過橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，DR患者血清甘露糖結(jié)合凝集素(MBL)水平高于健康受試者，且MBL水平隨著DR嚴(yán)重程度的增加而升高，提示補(bǔ)體凝集素激活途徑參與DR的發(fā)生； Holt等[41]發(fā)現(xiàn)，血清中凝集素途徑蛋白MAp44、MASP-2高水平與DR相關(guān)，同時(shí)高水平的H-ficolin與單純視網(wǎng)膜病變的發(fā)生相關(guān)，提示凝集素途徑補(bǔ)體激活在DR的早期階段可能起著更為突出的作用。

4 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由免疫原、絲裂原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細(xì)胞合成并分泌的具有廣泛生物學(xué)活性的低相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白或多肽[42]。眾多細(xì)胞因子在機(jī)體內(nèi)相互促進(jìn)或相互制約，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。高糖環(huán)境刺激局部和全身炎癥因子和趨化因子的表達(dá)增加，其導(dǎo)致的持續(xù)輕度炎癥被認(rèn)為促進(jìn)了DR血管和免疫系統(tǒng)的相關(guān)損傷，誘導(dǎo)BRB的破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致黃斑水腫和視網(wǎng)膜新生血管的形成[43]。

4.1 ILIL最初定義為傳遞免疫信號(hào)，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的增殖、活化，免疫信息的調(diào)節(jié)和傳遞，調(diào)控機(jī)體的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用，目前在DR的發(fā)病中IL-6和IL-1β研究相對(duì)較多。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠、DR患者中均有IL-6表達(dá)的升高[44-45]。且有研究表明IL-6是炎癥性血管滲漏的關(guān)鍵介質(zhì)，通過直接或間接影響血管內(nèi)皮細(xì)胞在DR的發(fā)病中發(fā)揮作用[46]。Valle等[47]發(fā)現(xiàn)，IL-6轉(zhuǎn)信號(hào)通路通過誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子-1表達(dá)的上調(diào)，導(dǎo)致iBRB的破壞； Yun等[48]通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，IL-6通過降低緊密連接蛋白ZO-1和occludin的表達(dá)，激活視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的STAT3信號(hào)通路，增加小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮的通透性和血管滲漏；此外，IL-6可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，并促進(jìn)新生血管的生成， Zhou等[49]亦發(fā)現(xiàn)IL-6水平與PDR患者的新生血管程度呈正相關(guān)。多項(xiàng)研究表明，IL-1β通過誘導(dǎo)血管滲漏、促使血管收縮和神經(jīng)變性，已成為DR發(fā)病早期的重要炎癥因子[50]。在2月齡嚙齒動(dòng)物的視網(wǎng)膜和早期DR患者體內(nèi)，IL-1β表達(dá)均上調(diào)[51]。同時(shí)，向非糖尿病大鼠玻璃體內(nèi)注射重組IL-1β，可促進(jìn)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡，而這正是DR的組織病理學(xué)特征[52]。另外，IL-1β可通過激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)IL-6等炎癥因子表達(dá)上調(diào)，引起一系列炎癥反應(yīng)[52]。除了其有效的促炎能力外，IL-1β 還可以通過誘導(dǎo)新生血管的形成促進(jìn)PDR的發(fā)展， Stahel等[53]在PDR患者中使用canakinumab (Ilaris) 抑制全身IL-1β，發(fā)現(xiàn)可適度消退新生血管，血管滲漏和黃斑水腫也持續(xù)減輕。

4.2 腫瘤壞死因子TNF-α是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞分泌的一類炎癥因子，在DR的發(fā)病中起著重要作用。DR患者玻璃體液、房水甚至淚液中TNF-α含量高于正常水平， Feng等[54]發(fā)現(xiàn)5年和10年DR組房水中TNF-α水平高于對(duì)照組，并與DR的病程和嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。Amil-Bangsa等[55]通過橫斷面研究發(fā)現(xiàn)淚液中TNF-α含量亦與DR嚴(yán)重程度相關(guān)。體外和體內(nèi)研究表明，TNF-α通過增加白細(xì)胞對(duì)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，增加BRB的通透性，從而在DR的發(fā)病中發(fā)揮作用。Aveleira等[56]發(fā)現(xiàn)TNF-α通過PKC/NF-κB途徑降低視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白claudin-5和ZO-1的表達(dá)并改變其分布，從而導(dǎo)致通透性增加；同時(shí)TNF-α的基因變異可能增加DR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)， Gao等[57]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，TNF-α基因中的-308 A和-238 A等位基因可能增加DR發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，并在不同種族中具有差異。

4.3 趨化因子趨化因子是一個(gè)小肝素結(jié)合蛋白家族，在機(jī)體中主要發(fā)揮免疫監(jiān)視和炎癥作用。研究表明，趨化因子通過介導(dǎo)炎癥、激活信號(hào)通路以及促進(jìn)新生血管的形成等方面發(fā)揮在DR發(fā)病機(jī)制中的作用[58]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)是CC趨化因子家族的重要成員，多項(xiàng)臨床研究表明MCP-1在DR患者房水、玻璃體液和血清中含量增高，且與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[59-60]。Dong等[61]在嚙齒動(dòng)物DR模型中發(fā)現(xiàn)，MCP-1表達(dá)上調(diào)發(fā)生于DR的早期階段，通過激活視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細(xì)胞，從而觸發(fā)免疫反應(yīng)和輕度炎癥反應(yīng)； Tonade等[62]發(fā)現(xiàn)野生型糖尿病小鼠通過釋放MCP-1，改變視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接，破壞iBRB；同時(shí)，MCP-1附著在受體CCR2上，通過募集和累積單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，使其聚集在視網(wǎng)膜血管內(nèi)，引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管阻塞，導(dǎo)致血管滲漏及無灌注[58]；此外，遺傳學(xué)研究表明，MCP-1基因多態(tài)性可能對(duì)DR的發(fā)病機(jī)制產(chǎn)生嚴(yán)重影響。Jiang等[59]發(fā)現(xiàn)MCP-1的-2518 GG基因型和G等位基因與中國漢族人群PDR風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。Wang等[63]通過薈萃分析進(jìn)一步證明了上述結(jié)果。

DR的發(fā)病還與CCL3、CCL5、CCL21、CX3CL1、CXCL16等多種趨化因子相關(guān)。 Zeng等[64]發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體液中多種趨化因子濃度高于對(duì)照組，其中趨化因子CCL3與DR早期視網(wǎng)膜損傷機(jī)制相關(guān)，CCL5和CCL21與PDR中纖維血管膜的形成有關(guān)； El-Asrar等[65]亦發(fā)現(xiàn)PDR患者玻璃體樣本中CXCL16、CX3CL1水平均顯著增加。

5 小結(jié)

綜上，免疫系統(tǒng)失調(diào)和炎癥是DR發(fā)生發(fā)展的重要因素，其中BRB是視網(wǎng)膜的第一道免疫防線，小膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)和傷害視網(wǎng)膜的雙重作用，補(bǔ)體系統(tǒng)的損傷程度與DR進(jìn)展呈正相關(guān)，多種細(xì)胞因子相互作用影響免疫調(diào)節(jié)。目前治療DR的主要方法有視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)、玻璃體內(nèi)注射抗VEGF藥物、皮質(zhì)類固醇類藥物、玻璃體切割術(shù)等，但均存在諸多局限性。因此，認(rèn)清DR發(fā)病的本質(zhì)才是解決DR的根本方式。近年來，免疫機(jī)制研究成為DR研究熱點(diǎn)，但是免疫機(jī)制在DR中發(fā)揮的具體作用還有待深入研究，進(jìn)而為臨床治療DR提供新的依據(jù)和策略。