劉曉暉 徐 靜 吳 京

目前，全世界有數(shù)百萬患有各類視網(wǎng)膜疾病患者，如糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)、老年性黃斑變性(SMD)等。視網(wǎng)膜作為眼球最內(nèi)部的感光結(jié)構(gòu)，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一部分。視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)特征和功能的多樣性決定了其易受內(nèi)外環(huán)境的影響，其調(diào)節(jié)自身狀態(tài)的機(jī)制也更為復(fù)雜。糖原合成酶激酶3β(GSK3β)是一種多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，存在于幾乎所有的真核生物中。越來越多的證據(jù)表明，GSK3β是影響視網(wǎng)膜疾病進(jìn)展的重要分子，并且GSK3β作為綜合多條信號(hào)通路的中心點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞功能障礙的多種病理事件[1-2]。然而，不同研究者之間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的矛盾性，這表明GSK3β調(diào)控視網(wǎng)膜疾病的復(fù)雜性[3-4]。為此，本研究回顧并整理了GSK3β在不同視網(wǎng)膜疾病中的調(diào)節(jié)作用的相關(guān)研究，并進(jìn)行綜述。

1 GSK3β的生物學(xué)特性

GSK3β是糖原合成酶激酶3的兩種經(jīng)典亞型之一，它在結(jié)構(gòu)上高度保守。最初的研究表明GSK3β是調(diào)節(jié)糖原代謝的關(guān)鍵酶，近來研究發(fā)現(xiàn)其可以參與許多其他細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)節(jié)，廣泛地影響多種生物功能。GSK3β在靜息細(xì)胞中的活性很高，其活性受到許多因素的影響。研究證實(shí)，GSK3β含有負(fù)調(diào)節(jié)的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域以及包括ATP結(jié)合位點(diǎn)和酶活性位點(diǎn)的激酶結(jié)構(gòu)域。GSK3β可以整合各種上游通路的信號(hào)刺激并通過多種調(diào)節(jié)方式調(diào)控自身的活性從而影響下游通路特異性底物來發(fā)揮不同的功能。磷酸化作為常見的翻譯后修飾之一，是GSK3β活性最重要的調(diào)節(jié)方法，主要依賴于GSK3β N端Ser9的快速和可逆的磷酸化，磷酸化的Ser9與位于啟動(dòng)磷酸鹽結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的3個(gè)高度保守的基本殘基相互作用，繼而阻斷底物結(jié)合和失活催化底物結(jié)構(gòu)域。除了翻譯后修飾，其他形式的調(diào)節(jié)如GSK3β-β-catenin蛋白復(fù)合體形成和亞細(xì)胞定位也對(duì)GSK3β的活性有重要的調(diào)節(jié)作用[5-6]。

2 GSK3β參與調(diào)控視網(wǎng)膜疾病

2.1 DRDR是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，血-視網(wǎng)膜屏障(BRB)的結(jié)構(gòu)破壞和通透性增加是DR的重要病理改變。BRB是由內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)和周細(xì)胞組成的內(nèi)屏障以及視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞組成的外屏障共同構(gòu)成。研究表明，ECs間黏附分子的完整性是BRB內(nèi)屏障功能完善的關(guān)鍵因素，GSK3β可以介導(dǎo)ECs過度增殖及黏附連接破壞最終導(dǎo)致血管滲漏從而參與調(diào)控DR的病程發(fā)展[7]。在高血糖刺激下，GSK3β被VEGF/p38α/MAPK通路磷酸化失活，失活的GSK3β不能泛素化降解β-catenin，使得β-catenin積聚在細(xì)胞質(zhì)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，這一方面使得ECs緊密連接和黏附連接蛋白復(fù)合物遭到破壞，另一方面促使β-catenin作為共轉(zhuǎn)錄因子激活與細(xì)胞遷移和增殖相關(guān)的各種基因，如uPA/uPAR，兩方面共同作用，引起ECs過度增殖和細(xì)胞連接松散，導(dǎo)致細(xì)胞旁通透性增加和血管滲漏，BRB功能受損[8-9]。

近年來有研究表明，在DR中，神經(jīng)變性先于視網(wǎng)膜微血管病變發(fā)生，而突觸功能障礙被認(rèn)為是神經(jīng)病變惡化的第一步[10]。GSK3β介導(dǎo)線粒體受損使得微管功能障礙，使得依賴于微管運(yùn)輸?shù)耐挥|傳遞不能完整有效地進(jìn)行，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙和丟失，介導(dǎo)DR神經(jīng)突觸損傷。Shu等[11]使用高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型揭示了在DR發(fā)病初期，異常GSK3β激活可導(dǎo)致β-catenin下調(diào)，通過抑制活性氧自由基(ROS)清除酶觸發(fā)氧化應(yīng)激，從而驅(qū)動(dòng)線粒體損傷，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)的突觸變性。而人參皂苷Rg1可通過IRS1/Akt信號(hào)通路抑制GSK3β活性，逆轉(zhuǎn)微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定和軸漿運(yùn)輸障礙，有效預(yù)防tau過度磷酸化介導(dǎo)的RGCs突觸變性[10-12]。相似的研究顯示，GSK3β活性可被GLP1R/Akt通路抑制，阻止過度磷酸化的tau觸發(fā)的視網(wǎng)膜神經(jīng)元突觸變性[13]。突觸變性進(jìn)一步繼發(fā)胞體功能障礙導(dǎo)致RGCs凋亡，而有研究證實(shí)，GSK3β可直接參與RGCs的凋亡調(diào)控。Szabadfi等[14]在糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，垂體腺苷酸環(huán)酶活化多肽通過增加GSK3β的磷酸化水平來降低RGCs凋亡。進(jìn)一步的研究提示，GSK3β通過激活下游的重要抗氧化應(yīng)激反應(yīng)元件轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)參與抵抗高糖小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，減少甚至逆轉(zhuǎn)氧化應(yīng)激介導(dǎo)的RGCs凋亡[15-16]。

2.2 SMDSMD包括非滲出性SMD和滲出性SMD兩種類型，是老年人視力損傷的主要原因。非滲出性SMD以RPE細(xì)胞的功能障礙和凋亡繼而形成玻璃膜疣為特征。GSK3β可以通過多種機(jī)制介導(dǎo)RPE細(xì)胞的功能障礙和凋亡，促進(jìn)非滲出性SMD發(fā)病。Ebrahimi等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在暴露于SMD的致病危險(xiǎn)因素后，其視網(wǎng)膜中GSK3β的組成性活性升高，使得Wnt和Nrf2在雙向反饋回路中同時(shí)下降，阻止細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，使得RPE細(xì)胞走向凋亡。而Baek等[18]的研究表明，GSK3β通過NK1R/Akt生存通路失活后，可促進(jìn)細(xì)胞增殖并激活細(xì)胞存活信號(hào)來抑制RPE細(xì)胞凋亡。另外一些研究報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可以通過激活SIRT1/Akt/GSK-3β/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)，阻斷RPE細(xì)胞凋亡途徑，治療腦室內(nèi)Aβ1-42注射誘導(dǎo)的大鼠SMD[19]。另一篇研究中也指出，GSK3β可以介導(dǎo)代謝信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子的激活來降低視網(wǎng)膜中過度磷酸化的tau毒性，從而阻止高磷酸化的tau從微管中解離，減少RPE細(xì)胞凋亡。此外，GSK3β是細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬的匯合點(diǎn)，通過持續(xù)的自噬減少細(xì)胞毒性以維持細(xì)胞存活，或者在自噬無法抑制細(xì)胞毒性的情況下啟動(dòng)凋亡以減少細(xì)胞毒性因子的釋放[20]。

綜上，動(dòng)物和細(xì)胞模型中的實(shí)驗(yàn)結(jié)論表明，干預(yù)GSK3β相關(guān)通路可以通過抑制RPE細(xì)胞凋亡保護(hù)視網(wǎng)膜功能，然而這并不能有效抵抗SMD的進(jìn)展，當(dāng)RPE細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少時(shí)，患者視力將發(fā)生嚴(yán)重下降，因此，尋求更有效的方法維持甚至重建RPE細(xì)胞的數(shù)目平衡將對(duì)SMD晚期患者視力恢復(fù)具有重大意義。自體RPE細(xì)胞移植是治療視網(wǎng)膜變性疾病的一種主要方法，但在SMD患者中，自體RPE細(xì)胞由于自身基因及環(huán)境導(dǎo)致衰老及功能失調(diào)，活力低下，難以逆轉(zhuǎn)視功能障礙。而研究表明，抑制GSK3β可以通過阻斷細(xì)胞分化的進(jìn)程，激活細(xì)胞增殖狀態(tài)，使得RPE細(xì)胞獲得“恢復(fù)活力”的潛力，同時(shí)不會(huì)損害RPE細(xì)胞的特異性表型及形態(tài)[21]。此外，干細(xì)胞來源的RPE細(xì)胞移植是SMD的一種新的治療方法，抑制GSK3β可以高效誘導(dǎo)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化為RPE細(xì)胞[22]。

滲出性SMD以脈絡(luò)膜新生血管(CNV)穿透RPE屏障生長(zhǎng)，破壞視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)為主要特征，另外，GSK3β參與介導(dǎo)病理性新生血管的形成并促進(jìn)發(fā)生滲出性SMD。Wang等[23]利用ARPE-19細(xì)胞和RF/6A恒河猴脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜ECs的共培養(yǎng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，ARPE-19細(xì)胞中的GSK3β受到組織因子的刺激后，可以通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，從而促進(jìn)脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜血管ECs的遷移，引發(fā)CNV。當(dāng)前的抗新生血管治療主要是以VEGF為靶標(biāo)，但是，單純抗VEGF的血管新生作用仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床需求。最近的研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)家族可能是抗血管生成治療的新靶標(biāo)，在多種視網(wǎng)膜細(xì)胞中均表達(dá)的PDGF家族可以激活A(yù)kt并增加GSK3β的Ser9磷酸化和Tyr216去磷酸化，促進(jìn)視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜新生血管的形成[24]。另一方面，血管生成是缺血組織恢復(fù)血流灌注的代償性表現(xiàn)，然而這些功能缺陷的新生血管無法從根本上緩解缺血缺氧對(duì)組織的損害，相反會(huì)導(dǎo)致更多的病理性新生血管形成和視網(wǎng)膜損傷。而有研究顯示，通過抑制GSK3β可促進(jìn)功能完善的新生血管形成，在不抑制新生血管形成的情況下減少血管功能缺陷，從根本上減少組織的缺氧損傷，為CNV提供了一種新的有前途的治療策略[25]。

2.3 青光眼青光眼是由于RGCs的進(jìn)行性死亡引起的一種神經(jīng)退行性疾病，最終導(dǎo)致不可逆的視力喪失。眼壓(IOP)升高是青光眼中RGCs損傷的主要危險(xiǎn)因素，正常IOP的維持取決于房水分泌及排出的速率，有研究使用非色素性睫狀上皮衍生的細(xì)胞外囊泡(EVs)作用下的正常小梁網(wǎng)細(xì)胞模擬人眼引流系統(tǒng)，顯示在高EVs劑量下，GSK3β的活性被激活的Wnt信號(hào)抑制，引起細(xì)胞質(zhì)中β-catenin的積累以及Pro-MMP9和MMP9活性的顯著增強(qiáng)，影響房水引流的阻力，從而調(diào)節(jié)房水分泌與吸收之間的平衡，以維持正常的IOP[26]。研究表明，IOP持續(xù)升高時(shí)，GSK3β誘導(dǎo)線粒體動(dòng)力相關(guān)蛋白表達(dá)，繼而誘導(dǎo)線粒體分裂，過度的線粒體裂變會(huì)導(dǎo)致電子傳輸鏈?zhǔn)軗p，從而引發(fā)RGCs和RPE細(xì)胞死亡[27]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，由高IOP引起的缺血使得視網(wǎng)膜中的PI3K/Akt途徑被阻斷，導(dǎo)致生存蛋白Akt的去磷酸化和促凋亡蛋白GSK3β的激活。當(dāng)IOP降低時(shí)，血管再灌注會(huì)通過磷酸化激活A(yù)kt，從而使GSK3β失活逆轉(zhuǎn)細(xì)胞損傷[28]。此外，對(duì)于無明顯IOP升高的正常IOP青光眼(NTG)，目前臨床治療主要是控制IOP，但是效果十分有限，單純降低IOP無法有效阻止RGCs的進(jìn)行性死亡。有研究表明，GSK3β可以通過被E-LPs去磷酸化來保護(hù)NTG小鼠視網(wǎng)膜及原代RGCs免受由谷氨酸誘導(dǎo)的Ca2+升高的損傷，從而抑制線粒體功能障礙并阻止RGCs凋亡[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，GSK3β還可以參與調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的干細(xì)胞特性，使得視網(wǎng)膜在遭受打擊后可以自我修復(fù)，從而逆轉(zhuǎn)RGCs進(jìn)行性丟失引起的視力損害。Yao等[30]的研究表明，成年哺乳動(dòng)物視網(wǎng)膜中的GSK3β活性被抑制后，可以促使β-catenin結(jié)構(gòu)維持穩(wěn)定并與下游的啟動(dòng)子結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄，刺激Müller細(xì)胞增殖以及獲得向神經(jīng)元分化的神經(jīng)源性潛力。因此，在視網(wǎng)膜損傷后，如何靶向GSK3β啟動(dòng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞向RGCs分化，將成為未來青光眼神經(jīng)保護(hù)研究的重要課題。

2.4 增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變?cè)錾圆Ａw視網(wǎng)膜病變(PVR)是一種復(fù)雜的纖維化疾病，常發(fā)生在視網(wǎng)膜脫離手術(shù)后，其特征在于視網(wǎng)膜上增殖膜的形成和牽拉。RPE細(xì)胞在受到多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子刺激后，通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的過程而去分化并轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞和成肌纖維，GSK3β被認(rèn)為是該過程的負(fù)調(diào)節(jié)劑。Zhang等[31]的研究顯示，在新西蘭兔的PVR模型中，RPE細(xì)胞中的GSK3β表達(dá)下調(diào)，Wnt/β-catenin和PI3K/Akt信號(hào)通路的激活導(dǎo)致進(jìn)一步的成纖維細(xì)胞增殖，膠原蛋白合成和EMT進(jìn)展。另有研究表明，GSK3β在受到PVR患者玻璃體中含量豐富的TGF-β2刺激后磷酸化水平下調(diào)，參與促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞的EMT進(jìn)程[32]。Huang等[33]的研究顯示，GSK3β的活性形式GSK3β-S9A和PI3K/Akt抑制劑處理ARPE-19細(xì)胞可中斷細(xì)胞轉(zhuǎn)化和遷移以及膠原蛋白的收縮，減緩PVR的進(jìn)程。

2.5 視網(wǎng)膜色素變性視網(wǎng)膜色素變性(RP)是一組遺傳性視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病，由于感光細(xì)胞的功能障礙和死亡，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的視力障礙。RP的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究提示，GSK3β可以通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激、興奮性毒性和炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與介導(dǎo)RP的病理過程。Lavoie等[34]在GSK3β+/-小鼠中觀察到視網(wǎng)膜電圖異常，證實(shí)感光細(xì)胞功能與GSK3β表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)。進(jìn)一步的研究表明，GSK3β受到IR/PI3K/Akt信號(hào)通路的調(diào)控而失去活性，從而維持感光細(xì)胞線粒體的完整性及促進(jìn)Müller細(xì)胞的糖原合成，以應(yīng)對(duì)正常程度下的氧化應(yīng)激損傷，有效保護(hù)RPE細(xì)胞功能[35-36]。Wyse等[37]的研究也發(fā)現(xiàn)，PKA依賴性的GSK3β失活通過激活CREB上調(diào)Bcl-2，提高感光細(xì)胞的抗氧化應(yīng)激能力。Wang等[38]和Carullo等[39]在RP10小鼠模型中發(fā)現(xiàn)GSK3β抑制劑可以通過減少變性視網(wǎng)膜中促炎性標(biāo)志物α2m、IL-1β和TNF-α的釋放以及減輕由N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)引起的興奮性毒性來抑制感光細(xì)胞的死亡。

2.6 外傷性視神經(jīng)病變外傷性視神經(jīng)病變通常是由于鈍性眼外傷和顱面損傷引起的視神經(jīng)(ON)的直接或間接損傷。ON由RGCs的軸突形成，具有單向軸突的特性。對(duì)ON的機(jī)械破壞會(huì)導(dǎo)致RGCs死亡，最終導(dǎo)致視力喪失。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠ON夾傷模型中，GSK3β可通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)錐動(dòng)力學(xué)來促進(jìn)軸突生長(zhǎng)和分支及神經(jīng)元極化[1,40-41]。進(jìn)一步的研究表明，RGCs通常由于軸突生長(zhǎng)錐的生長(zhǎng)環(huán)境抑制及其進(jìn)入軸突再生程序的內(nèi)在能力不足而無法再生受損的軸突。GSK3β促進(jìn)軸突再生的作用不是直接啟動(dòng)軸突再生以彌補(bǔ)丟失的軸突，而是通過消除影響軸突再生的抑制環(huán)境，從而使得軸突正常順暢地完成其再生進(jìn)程而不影響RGCs的存活機(jī)制[3]。Kondo等[42]的研究也發(fā)現(xiàn)，GSK3β-/-主要以去抑制方式起作用來促進(jìn)ON再生，活性GSK3β介導(dǎo)的CRMP2磷酸化可將CRMP2滅活，從而取消CRMP2對(duì)微管聚合的促進(jìn)作用和對(duì)軸突再生的去抑制作用，使得ON無法再生。研究已經(jīng)證實(shí)，神經(jīng)元極性是一個(gè)神經(jīng)突迅速長(zhǎng)成軸突，其余神經(jīng)突分化成樹突的過程，是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)定向信息流的先決條件，在視神經(jīng)再生中起著重要作用。Huang等[43]利用原代培養(yǎng)的RGCs發(fā)現(xiàn)，GSK3β在受到Sema3A/PKA通路的調(diào)控后其磷酸化水平下降，使得下游CRMP2的穩(wěn)定性受到破壞，從而抑制RGCs的軸突生長(zhǎng)，促進(jìn)樹突生長(zhǎng)，這不利于ON損傷的早期恢復(fù)。另有研究表明，磷酸化的GSK3β不僅可以通過激活MAP1B來減少微管蛋白的脫酪氨酸作用，調(diào)節(jié)軸突生長(zhǎng)錐中的微管動(dòng)力學(xué)，促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，還在一定程度上參與調(diào)節(jié)軸突的最終成熟及其末端向大腦皮層投射的準(zhǔn)確定位[3]。

3 總結(jié)與展望

近幾年來，GSK3β在介導(dǎo)視網(wǎng)膜疾病中的調(diào)控作用研究已有一定進(jìn)展。雖然基于細(xì)胞通路調(diào)控的治療方法已經(jīng)取得了一定的效果，但它未能逆轉(zhuǎn)退行性過程，因?yàn)榇蠖鄶?shù)治療措施只關(guān)注單一通路的變化，忽視了疾病的進(jìn)展是細(xì)胞狀態(tài)和組織環(huán)境綜合作用的結(jié)果。此外，單一途徑的干預(yù)也可能干擾與其相關(guān)的其他生命過程，由此產(chǎn)生的副作用不應(yīng)被低估。因此，未來的研究應(yīng)該聚焦于GSK3β在視網(wǎng)膜疾病進(jìn)展過程中的聯(lián)合作用，針對(duì)GSK3β的藥物研發(fā)應(yīng)該考慮到不同通路的綜合作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶點(diǎn)的精準(zhǔn)控制。