殷學(xué)偉 郭勵(lì)劼 周夢(mèng)賢 屈如意 畢宏生 郭大東

葡萄膜炎是眼科常見(jiàn)的一類可復(fù)發(fā)的嚴(yán)重危害視覺(jué)健康的自身免疫性疾病，多采用激素和免疫抑制劑治療，副作用較大。因此，深入探討葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)對(duì)臨床治療具有重要意義。MicroRNA(miRNA)是在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)的一類功能性小分子RNA。Notch 信號(hào)通路是調(diào)節(jié)自身免疫性疾病和炎癥反應(yīng)的重要通路[1]。miRNA的表達(dá)異常與葡萄膜炎的發(fā)病進(jìn)程關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，在急性前葡萄膜炎患者的外周血中，miR-146a、miR-143、miR-205和 miR-9-3表達(dá)水平均顯著降低，而miR-301a和miR-23a的表達(dá)水平明顯升高，這證實(shí)miRNA在葡萄膜炎發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[2]；而miR-155可通過(guò)靶向作用于Ets-1基因調(diào)控Th17細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制miR-155可減少致病性Th17細(xì)胞的數(shù)量，從而減輕葡萄膜炎患者的發(fā)病程度[3]；我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs的差異表達(dá)可能與葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[4-8]。本研究擬以實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠為模型，探討miR-30b-5p調(diào)控Notch信號(hào)通路在葡萄膜炎發(fā)病中的作用機(jī)制，為建立以 miRNA 為作用靶點(diǎn)的新型治療方法提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器光感受器間維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)(上海生工公司)；結(jié)核分枝桿菌(TB)(Difco公司，美國(guó))；完全弗式佐劑(CFA)(Sigma公司，美國(guó))；LV-rno-mir-30b(16507-1)病毒，陰性對(duì)照病毒CON238(上海吉?jiǎng)P基因)；RNA提取試劑盒(北京Aidlab公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒(QIAGEN 公司，德國(guó))；兔抗DLL4多克隆抗體(北京博奧森公司)，兔抗Notch1多克隆抗體(北京博奧森公司)，免疫組化SP試劑盒(北京博奧森公司)；封閉用山羊血清(Solarbio，SL038)；蘇木素(Thermo公司，美國(guó))；免疫組化筆(福州邁新公司)；LightCycler 480 qRT-PCR儀(Roche公司，美國(guó))；全自動(dòng)封片儀(Thermo公司，美國(guó));Revolve正置/倒置熒光顯微鏡(Echo公司，美國(guó))。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組處理健康雌性Lewis大鼠32只(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，6～8周齡，160～180 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、EAU組、miR-30b-5p組及miR-30b-5p空載體(miR-30b-5p-N)組，每組各8只。對(duì)EAU組、miR-30b-5p組及miR-30b-5p-N組大鼠的腹壁兩側(cè)、后肢兩足墊以及軀干上皮下各點(diǎn)分別注射200 μL含IRBP、TB、CFA和無(wú)菌PBS的乳糜液以誘導(dǎo)EAU模型，對(duì)照組大鼠于相同位置注射等體積的TB和CFA的乳糜液。在免疫后立即將攜帶miR-30b-5p的慢病毒和攜帶miR-30b-5p空載體的慢病毒分別相應(yīng)注射于miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組的EAU大鼠脾臟(每只注射病毒量均為5×107TU)，進(jìn)行干預(yù)治療處理。動(dòng)物的使用均符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析通過(guò)Target Scan(http://www.targetscan.org/)對(duì)Notch1和Dll4基因與 miR-30b 的關(guān)系進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，分析 miR-30b-5p 對(duì) Notch 信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的調(diào)控作用。

1.3 qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中Notch1和Dll4 mRNA的表達(dá)變化免疫后12 d，分別取4組大鼠的脾臟、淋巴結(jié)和眼組織，提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，引物序列為：GAPDH上游引物為5’-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3’，下游引物為5’-AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT-3’，分子長(zhǎng)度為222 bp；Notch1上游引物為5’-ATGGCCCCACCTGCAGACAAGATG-3’,下游引物為5’-GGCACGGCAGGCACAGCGATAG-3’，分子長(zhǎng)度為113 bp；DLL4上游引物為5’-CAAGAATAGCGGCAGTGGTCGTAA-3’,下游引物為5’-GTAGCGCAGTCTTGTGAGGGTGTT-3’，分子長(zhǎng)度為229 bp。反應(yīng)體系為每孔20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃、5 min，反應(yīng)循環(huán)1次；95 ℃、20 s，57 ℃、25 s，60 ℃、25 s，循環(huán)45次。qRT-PCR程序完成后，按 2-ΔΔCt計(jì)算Notch1和Dll4 mRNA的表達(dá)水平。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)免疫后12 d，取各組大鼠相同部位的脾臟、淋巴結(jié)和眼組織進(jìn)行切片，切片厚度約為10 μm。將切片置于室溫環(huán)境10～15 min后用冰乙酸固定10～20 min。每個(gè)切片經(jīng)PBS沖洗后均滴1.67 mol·L-1H2O2，置于室溫環(huán)境10 min。各切片經(jīng)PBS沖洗后一抗(Notch1 1400，Dll4 1500)4 ℃ 孵育過(guò)夜。將切片轉(zhuǎn)入室溫環(huán)境復(fù)溫30 min。各個(gè)切片經(jīng)PBS沖洗后，采用HRP標(biāo)記的二抗(1200)孵育于室溫中靜置20 min。顯微鏡下觀察DAB染色效果后用自來(lái)水沖洗以終止染色。蘇木素染色后用自來(lái)水沖洗1 min。每張切片均滴10 g·L-1鹽酸酒精，用清水沖洗1 min。碳酸鋰飽和溶液1 min，用清水沖洗1 min。用梯度酒精脫水2 min。 二甲苯透明5 min。采用中性樹(shù)膠封存，封存后于顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，Notch 信號(hào)通路上 Notch1和Dll4基因均為 miR-30b 調(diào)控的靶基因，提示Notch1和Dll4在葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。因此，深入研究 miR-30b-5p 調(diào)控 Notch 信號(hào)通路相關(guān)分子表達(dá)的作用機(jī)制，對(duì)于闡釋葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展的病理機(jī)制具有重要意義。

2.2 大鼠脾臟、淋巴結(jié)及眼組織中Notch1和Dll4 mRNA的表達(dá)變化qRT-PCR檢測(cè)顯示，免疫后12 d，相比于對(duì)照組，EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均明顯升高(均為P<0.05)；與EAU組大鼠相比，經(jīng)miR-30b-5p干預(yù)后，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均顯著降低(均為P<0.05)。然而，miR-30b-5p-N組大鼠各組織中Notch1和Dll4 mRNA表達(dá)水平與EAU組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表1)。

表1 各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平

2.3 大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中的Notch1和Dll4蛋白表達(dá)水平免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫后12 d，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4蛋白的表達(dá)均弱于EAU組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)，而miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4蛋白的表達(dá)與EAU組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖1，圖2)。

A：對(duì)照組、EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1蛋白表達(dá)情況。B：平均光密度值分析的直方圖，與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAU組比較，#P<0.05， ##P<0.01。圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1蛋白表達(dá)

A：對(duì)照組、EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Dll4蛋白表達(dá)情況。B：平均光密度值分析的直方圖，與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與EAU組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Dll4蛋白表達(dá)

3 討論

葡萄膜炎是嚴(yán)重危害人類健康的一類自身免疫性眼病，多發(fā)于青壯年。Notch信號(hào)通路是維持機(jī)體免疫平衡的重要信號(hào)通路，可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞的分化[9]。研究顯示，Notch信號(hào)通路經(jīng)Notch信號(hào)通路抑制劑DAPT阻斷后，通路中Jagged-1信號(hào)分子可顯著降低CD4+T細(xì)胞中ROR-γt的表達(dá)，并下調(diào)與Th17相關(guān)的炎性細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F、IL-23a和IL-12rb1的表達(dá)水平[10]；Notch信號(hào)通路阻斷劑可明顯抑制葡萄膜炎小鼠的發(fā)病進(jìn)程[11-12]。臨床研究結(jié)果顯示，在活動(dòng)性白塞氏病患者中阻斷Notch信號(hào)通路可抑制Notch信號(hào)分子的激活[13]。我們前期的研究結(jié)果也顯示，EAU大鼠淋巴結(jié)、脾臟和眼組織中的T淋巴細(xì)胞經(jīng)Notch信號(hào)抑制劑DAPT體外干預(yù)后，Notch1、DLL4、IL-17、ROR-γt的表達(dá)水平明顯下降，表明葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制伴隨著Notch1、DLL4、IL-10、IL-17、ROR-γt和Foxp3的表達(dá)升高，以及CD4+/CD8+和Th17/Treg比例失衡。DAPT抑制Notch信號(hào)可有效下調(diào)Notch1、DLL4、IL-17的表達(dá)和ROR-γt的轉(zhuǎn)錄，降低Th17水平，恢復(fù)CD4+/CD8+、Th17/Treg平衡[14]。在本研究中，免疫后12 d，相比于對(duì)照組，EAU組大鼠各組織中Notch1和Dll4 mRNA以及蛋白水平均升高(均為P<0.05)，在EAU中伴隨著Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的高表達(dá)，提示Notch信號(hào)通路的活化在葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。此外，有研究顯示，抗Dll4抗體治療可顯著降低EAU在誘導(dǎo)期和應(yīng)答期癥狀的嚴(yán)重程度，提示Dll4介導(dǎo)的Notch信號(hào)通路在EAU中發(fā)揮重要作用[15]。這與本研究結(jié)果一致，提示Notch 信號(hào)通路相關(guān)分子在葡萄膜炎的發(fā)病過(guò)程中具有重要作用。 抑制Notch信號(hào)可改善EAU的炎癥反應(yīng)，這可能為葡萄膜炎患者提供潛在的免疫治療策略。

miRNA是一類可調(diào)控靶基因表達(dá)的功能性小分子RNA，miRNA的表達(dá)異常可能與葡萄膜炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。Jadideslam等[16]發(fā)現(xiàn)，白塞氏病患者中miR-21、miR-146b的表達(dá)明顯降低，miR-326的表達(dá)升高。miR-223-3p可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄因子FOXO3的表達(dá)促進(jìn)EAU中Th17細(xì)胞的自身反應(yīng)[17]。Meira-Strejevitch等[18]研究表明，眼弓形體病引起的后葡萄膜炎患者中miR-155-5p和miR-29c-3p的表達(dá)均升高，而miR-21-5p和miR-125b-5p均呈下調(diào)表達(dá)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn) ，EAU大鼠的外周血淋巴細(xì)胞中的miRNA中，36條呈上調(diào)表達(dá)，31條呈下調(diào)表達(dá)[19]；后續(xù)研究顯示，在EAU大鼠脾臟和淋巴結(jié)中，miR-30b-5p調(diào)控Atg5、Atg12和Becn1自噬基因的表達(dá)，miR-30b-5p可通過(guò)影響自噬通路進(jìn)而影響葡萄膜炎的發(fā)生發(fā)展[5]，同時(shí)，我們前期研究也證明miR-30b-5p也可以通過(guò)調(diào)節(jié)IL-10和TLR4陽(yáng)性細(xì)胞的水平來(lái)影響葡萄膜炎的發(fā)生，進(jìn)而影響葡萄膜炎的發(fā)展[7]。

本研究成功建立了EAU大鼠模型，并且成功將攜帶miR-30b-5p慢病毒的EAU大鼠進(jìn)行體內(nèi)脾臟注射治療，干預(yù)治療后，各組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中的Notch1和Dll4的基因與蛋白水平變化結(jié)果基本一致。結(jié)果顯示，免疫后12 d，相比于對(duì)照組，EAU組、miR-30b-5p組和miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均明顯升高，提示在葡萄膜炎的發(fā)病過(guò)程中存在著Notch信號(hào)通路的激活；經(jīng)miR-30b-5p干預(yù)后，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中Notch1和Dll4 mRNA水平均顯著降低。然而，miR-30b-5p-N組大鼠各組織中Notch1和Dll4基因水平與EAU組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-30b-5p可抑制葡萄膜炎發(fā)病過(guò)程中Notch信號(hào)通路的激活，進(jìn)而發(fā)揮治療葡萄膜炎的作用。免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白水平結(jié)果趨勢(shì)與qRT-PCR檢測(cè)基因水平結(jié)果基本一致，即免疫后第12 d，相比于EAU組，miR-30b-5p組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中的Notch1和Dll4蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)；而miR-30b-5p-N組大鼠脾臟、淋巴結(jié)和眼組織中的Notch1和Dll4蛋白表達(dá)水平與EAU組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果進(jìn)一步表明，miR-30b-5p慢病毒可明顯降低Notch信號(hào)通路相關(guān)分子的表達(dá)。當(dāng)然，本研究結(jié)果是建立在采用攜帶miR-30b-5p的慢病毒通過(guò)脾臟注射EAU大鼠進(jìn)行治療的基礎(chǔ)上，還無(wú)法應(yīng)用于臨床，下一步我們擬通過(guò)采用攜帶miR-30b-5p的慢病毒通過(guò)玻璃體內(nèi)注射治療EAU大鼠，進(jìn)一步客觀地評(píng)價(jià)miR-30b-5p對(duì)葡萄膜炎的治療作用，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

綜上所述，本研究初步揭示了EAU的發(fā)病機(jī)制與Notch信號(hào)通路的活化有關(guān)，Notch信號(hào)通路的激活伴隨著Notch1和Dll4水平的升高，miR-30b-5p 可有效降低Notch信號(hào)通路相關(guān)分子Notch1和Dll4的高表達(dá)，抑制Notch信號(hào)通路的激活，減輕EAU的免疫炎癥狀態(tài)。通過(guò)攜帶miR-30b-5p的慢病毒感染技術(shù)可顯著抑制Notch信號(hào)通路的活化，平衡葡萄膜炎的免疫狀態(tài)，減輕EAU的發(fā)病程度，為臨床應(yīng)用miRNAs治療葡萄膜炎等免疫性疾病提供了一定的研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。