王新華許娜麗姚明明余慧霞王彥青邱國巖

劉鳳樓1,2,劉彩霞1,張曉崗1,李清峰1,2,王掌軍1,2

(1.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,銀川 750021;2.寧夏優(yōu)勢特色作物分子育種重點(diǎn)實驗室,銀川 750021)

小麥作為世界上重要的糧食作物之一為全球糧食安全作出了巨大貢獻(xiàn)[1-2]。由于馴化以及現(xiàn)代育種定向選擇造成栽培小麥的遺傳基礎(chǔ)狹窄成為制約小麥發(fā)展的主要瓶頸[3-4]。利用遠(yuǎn)緣雜交將小麥野生近緣種中的高產(chǎn)、抗病、抗逆等優(yōu)異基因?qū)胄←?是拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)的有效途徑[5-6]。如攜帶抗病、高產(chǎn)性狀的小麥-黑麥T1BL·1RS易位系以及攜帶Pm21基因的小麥-簇毛麥T6VS·6AL易位系在育種和生產(chǎn)上被廣泛應(yīng)用[7-8]。因此,開展小麥近緣屬優(yōu)異基因的挖掘與研究對小麥的遺傳改良具有重要意義。

長穗偃麥草(Thinopyrumelongatum)是禾本科小麥族偃麥草屬物種,其染色體包含3種倍性:二倍體(2n=2x=14,EE)、四倍體(2n=4x=28,EEEE)和十倍體(2n=10x=70,EEEEEESt-StStSt)[9]。具有抗逆(抗寒、抗旱、耐鹽)和抗病(枯萎病、銹病、白粉病)特性,是小麥外緣基因的重要來源之一[10-13]。為利用長穗偃麥草中優(yōu)異基因李振聲院士團(tuán)隊培育出‘小偃6號’‘小偃54’和‘小偃81’等一系列小麥新品種,其中‘小偃6號’已成為中國黃淮麥區(qū)的骨干親本[14-17]。盡管長穗偃麥草在小麥遺傳育種改良中得到成功應(yīng)用,但對其基因定位和克隆等方面的研究相對滯后。隨著二倍體長穗偃麥草基因組組裝的完成,從全基因組水平研究長穗偃麥草功能基因?qū)W成為可能[18]。

LBD(Lateral organ boundaries domain)基因家族,也稱AS2(Asymmetric leaves 2)基因家族,是一類植物中特有的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子,在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[19]。LBD 基因家族成員均包含LOB蛋白結(jié)構(gòu)域,包括一個由高度保守的C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C 半胱氨酸基序構(gòu)成結(jié)合DNA 必須的鋅指結(jié)構(gòu)域;一個由1個保守的脯氨酸殘基構(gòu)成地與DNA 結(jié)合活性密切相關(guān)的GAS區(qū)域;一個參與蛋白質(zhì)二聚化過程的由4個保守的亮氨酸殘基L-x(6)-L-x(3)-L-x(6)-L組成的類亮氨酸拉鏈樣基序[20-22]。LBD 基因家族可分為兩個亞家族:含有上述3個完整基序的為第一個亞家族Class Ⅰ,而其余含有殘留亮氨酸拉鏈基序的為第二個亞家族ClassⅡ[23-24]。截至目前,LBD 基因家族已在多個物種的全基因組水平上被鑒定,例如擬南芥43個[21]、小 麥75 個[25]、玉 米44 個[26]、水 稻35個[27]、大麥24 個[24]、二穗短柄草28 個[28]、煙草98個[29]等。已有的研究表明,LBD 基因家族在植物生長、發(fā)育和代謝等多個方面發(fā)揮了重要作用。如擬南芥LBD13和LBD16調(diào)控側(cè)根的生長[30-31]、LBD19在愈傷組織形成中起負(fù)調(diào)控作用[32]、LBD29參與生長素的調(diào)控抑制纖維素合成[33];水稻OsIG1基因調(diào)控水稻的小花數(shù)和配子體結(jié)構(gòu)[34];番茄SlLBD40基因參與茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是抗旱性的負(fù)調(diào)控因子[35];小立碗蘚PpLBD27基因在干旱脅迫下表達(dá)且響應(yīng)茉莉酸介導(dǎo)的對病原菌的抵抗[36];丹參LBD50基因調(diào)控茉莉酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和酚類生物合成[37];茶樹Cs-LBDs基因調(diào)控類黃酮的合成[38]。盡管LBD 基因家族已經(jīng)在多個物種中被鑒定和研究,但在長穗偃麥草中的鑒定和研究還未見報道。

本研究借助生物信息學(xué)方法,對長穗偃麥草LBD 基因家族進(jìn)行鑒定,并對其基本特征、保守結(jié)構(gòu)域、染色體分布、基因的進(jìn)化和啟動子的順式作用元件進(jìn)行系統(tǒng)的分析。同時,對長穗偃麥草LBD 基因家族與普通小麥、圓錐小麥、烏拉爾圖小麥、粗山羊草和大麥進(jìn)行共線性分析,揭示小麥及其近緣屬物種在進(jìn)化過程中染色體的重復(fù)、缺失、易位等事件的發(fā)生。本研究為長穗偃麥草LBD 基因家族中單個基因的功能分析奠定基礎(chǔ),同時為分析小麥及其近緣屬的進(jìn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

CNCB-NGDC數(shù)據(jù)庫(https://bigd.big.ac.cn/)中長穗偃麥草的全基因組數(shù)據(jù);擬南芥數(shù)據(jù)庫 (https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp)中LBD 基因家族的蛋白query 序列;Ensembl(https://plants.ensembl.org/index.html)數(shù)據(jù)庫中小麥[39]、圓錐小麥[40]、烏拉爾圖小麥[41]、山羊草[42]、大麥[43]的基因組數(shù)據(jù)。

1.2 方法

1.2.1 長穗偃麥草LBD 基因家族的鑒定 通過長穗偃麥草的全基因組數(shù)據(jù),利用TBtools[44]軟件以擬南芥的LBD 基因家族的蛋白序列作為query序列,進(jìn)行本地比對獲得長穗偃麥草LBD基因家族成員的可能序列;同時利用Uniprot數(shù)據(jù)庫 (https://www.uniprot.org/uniprot/?query=&sort=score)繼續(xù)篩選LBD 基因家族成員,去除冗余序列。利用Pfam(https://pfam.xfam.org/search#tabview=tab1)和NCBI-CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫對保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)一步篩選,去除保守結(jié)構(gòu)域中不完整的序列。利用ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)在線軟件對LBD 蛋白的基本特性進(jìn)行分析。

1.2.2 長穗偃麥草LBD 基因家族的系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用在線工具Clustal W(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)進(jìn)行長穗偃麥草、小麥、水稻和擬南芥LBD 蛋白的多序列比對,然后使用MEGA 7.0的最大似然法(ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并將bootstrap 參數(shù)設(shè)置為1 000。系統(tǒng)發(fā)育樹使用Fig Treev 1.4.4 軟件(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)進(jìn)行美化。

1.2.3 長穗偃麥草LBD 基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測和亞細(xì)胞定位 利用TBtools工具分析和可視化長穗偃麥草LBD 基因的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。使用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/)預(yù)測LBD 基因家族中蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域,重復(fù)設(shè)定為One Occurrence Per Sequence,寬度為6～50 個氨基酸,最大基序為10。利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=npsa_sopma.html)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析軟件對LBD 基因蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測和分析。利用基于同源建模法的在線軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對LBD 蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。使用在線工具 PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.4 長穗偃麥草LBD 基因的順式作用元件分析 利用TBtools截取長穗偃麥草全基因數(shù)據(jù)中LBD 基因上游2 kb 的基因組序列,利用Plant-CARE啟動子預(yù)測數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對順式作用元件預(yù)測并手工簡化和整理保留有一定查看目的元件,使用在線網(wǎng)站GSDS2.0(http://gsds.gao-lab.org/)對順式作用元件進(jìn)行可視化并繪制順式作用元件分布圖,并利用Origin 2017軟件對各順式作用元件在LBD 基因家族中分布的數(shù)目繪制熱圖。

1.2.5 長穗偃麥草LBD 基因家族的染色體定位及與小麥族物種的共線性分析 利用長穗偃麥草的基因注釋文件和LBD 基因家族的基因ID,通過TBtools工具實現(xiàn)染色體位置的可視化。使用MCScan X 來檢測串聯(lián)重復(fù)基因以及長穗偃麥草自身基因的同源關(guān)系及其進(jìn)化分析。通過自身的共線性分析以及長穗偃麥草與其他5個物種的共線性分析,分析長穗偃麥草LBD 基因家族自身的進(jìn)化以及與小麥族5 個物種的共線性比對分析LBD 基因在小麥及其近緣屬中的進(jìn)化,通過TBtools工具對共線性分析的結(jié)果可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 長穗偃麥草LBD基因家族的鑒定

在長穗偃麥草中共鑒定到32個LBD 基因,并根據(jù)該基因在染色體上的位置命名。長穗偃麥草LBD 基因的蛋白序列長度為124～383 aa;分子質(zhì)量為13.5～41.7 ku;等電點(diǎn)為5.05～9.75;不穩(wěn)定系數(shù)為29.53～74.45,其中只有Tel-1ELBD4和Tel-3E-LBD5兩個基因的不穩(wěn)定系數(shù)小于40,是穩(wěn)定蛋白;脂肪族氨基酸指數(shù)為56.79～88.21;親水指數(shù)為-0.621～0.11(表1)。

表1 長穗偃麥草LBD蛋白的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of LBD protein in Thinopyrum elongatum

2.2 長穗偃麥草LBD基因家族的系統(tǒng)發(fā)育分析和分類

2.2.1 長穗偃麥草LBD 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 根據(jù)LBD 基因家族蛋白多序列比對構(gòu)建的無根系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1),可將所有LBD 基因分為ClassⅠ和ClassⅡ兩個亞族7大類,在每大類中均包含有長穗偃麥草、小麥、水稻和擬南芥的LBD 基因,表明在雙子葉和單子葉植物分化之前LBD基因已經(jīng)完成了分化。在長穗偃麥草32個LBD 基因中,兩個亞家族都有明顯的特征。ClassⅠ亞家族包含25個成員,含有完整的高度保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)域C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C、GAS基序和類亮氨酸拉鏈基序L-x(6)-L-x(3)-L-x(6)-L;Class Ⅱ亞家族包含7個成員,只含有完整的、高度保守的半胱氨酸基序C-x(2)-C-x(6)-C-x(3)-C。根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和位置情況,Class Ⅰ可以進(jìn)一步細(xì)分為5 個亞類:ⅠA～ⅠE,ClassⅡ可分為ⅡA～ⅡB兩個亞類。

圖1 長穗偃麥草、小麥、水稻、擬南芥LBD蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Aphylogenetic tree of LBD proteins of Thinopyrum elongatum,Triticum aestivum,Oryza sativa Japonica and Arabidopsis

2.2.2 長穗偃麥草LBD 基因家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及亞細(xì)胞定位 在蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測和分析的結(jié)果中發(fā)現(xiàn),Tel-4E-LBD3和Tel-2ELBD2兩個基因二級結(jié)構(gòu)只含有α-螺旋和無規(guī)則卷曲兩種構(gòu)型,其余基因均含有3 種構(gòu)型。在LBD 基因中α-螺旋分布由24.75%到67.23%,無規(guī)則卷曲分布由2.12%至58.42%,這兩種構(gòu)型在蛋白序列中均有分布且占比相對較大;β-折疊構(gòu)型在含有的基因蛋白序列中分布由0.40%至11.81%占比相對較小(表2)。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明,長穗偃麥草的LBD 基因定位到線粒體12個,葉綠體5個,細(xì)胞質(zhì)10個,細(xì)胞核2個,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1個,其他2個(表2)。

表2長穗偃麥草LBD 蛋白亞細(xì)胞定位與二級結(jié)構(gòu)分析Table 2 Subcellular localization and analysis of protein secondary structure of LBD protein in Thinopyrum elongatum

（續(xù)表2 Continued table 2）

2.2.3 長穗偃麥草LBD 基因家族蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,長穗偃麥草LBD 基因蛋白保守性強(qiáng),各個蛋白存在一定的差異,但總體上LBD 基因蛋白的三級結(jié)構(gòu)相似(圖2)。其中Tel-3E-LBD8基因與比對到的模型蛋白一致度達(dá)到99.22%,總體上來說預(yù)測到的LBD 基因家族三級結(jié)構(gòu)與模型蛋白具有較好一致度。

圖2 長穗偃麥草LBD蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.2 Prediction of protein tertiary structure of LBD protein in Thinopyrum elongatum

2.3 長穗偃麥草LBD基因蛋白的結(jié)構(gòu)分析及保守結(jié)構(gòu)域分析

分析了長穗偃麥草LBD 基因的結(jié)構(gòu)(圖3)。結(jié)果表明長穗偃麥草LBD 基因家族的基因結(jié)構(gòu)相對簡單,其中3個基因Tel-5E-LBD2、Tel-4ELBD8、Tel-LBD3均有兩個內(nèi)含子,Tel-3ELBD7含有一個內(nèi)含子,其余LBD 基因均不包含內(nèi)含子。而外顯子數(shù)量分布為2至4個,其中大部分基因含有4個外顯子?？傮w來看,每個亞家族成員間基因結(jié)構(gòu)基本一致,但在兩個亞家族之間有所差異。

圖3 長穗偃麥草LBD保守基序(左)與基因結(jié)構(gòu)(右)Fig.3 Conservative motif(left)and gene structure(right)of LBD in Thinopyrum elongatum

對LBD 基因家族32個成員蛋白的特征區(qū)域其保守結(jié)構(gòu)域的數(shù)目及組成位置的分析,預(yù)測了10個保守的基序,并列出特征基序的具體氨基酸序列(motif 1、motif 3、motif 5)(圖4)。其中基序1和基序2在所有LBD 基因中均被鑒定到,表明基序1和基序2最為保守。在ClassⅠ亞家族中均鑒定到基序1、2、3和5,在ClassⅡ亞家族中均鑒定到基序1、2、4和6,這表明同一亞家族的成員大多具有相同的序列和共同位置的基序,在同一亞群中聚集的LBD 成員可能具有相似的生物學(xué)功能。

圖4 長穗偃麥草LBD基因家族特征結(jié)構(gòu)域Fig.4 Characteristic domain of Thinopyrum elongatum LBD gene family

2.4 長穗偃麥草LBD基因家族的順式作用元件分析

通過對長穗偃麥草LBD 基因上游2 kb基因組順式作用元件預(yù)測,去除啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域共鑒定到43 類順式作用元件,根據(jù)其功能分為12大類(圖5-A)。在所有LBD 基因上游區(qū)域中均含有多個光響應(yīng)元件和MeJA(茉莉酸甲酯)響應(yīng)元件,其中防御和應(yīng)激響應(yīng)元件分布最少,只在8個基因上游區(qū)域存在,此外還有MYB 結(jié)合位點(diǎn)、赤霉素響應(yīng)、脫落酸響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件和分生組織響應(yīng)元件9類不同的順式作用元件不均勻地分布在LBD 基因的上游區(qū)域(圖5-B)。

圖5 長穗偃麥草順式作用元件分布(A)與數(shù)量分布(B)Fig.5 Cis-acting elements distribution(A)and quantity distribution(B)in Thinopyrum elongatum

2.5 LBD 基因家族的染色體定位、進(jìn)化分析及與小麥及其近緣屬物種的共線性分析

2.5.1 長穗偃麥草LBD 基因家族的染色體定位及自身的進(jìn)化分析 染色體定位結(jié)果表明,LBD基因家族中的32個成員分布在7條染色體上,在3E和4E染色體上存在基因簇(圖6)。通過共線性分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在3E 染色體上Tel-3E-LBD4基因和Tel-3E-LBD7基因存在串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象,4E染色體上Tel-4E-LBD1基因和Tel-4E-LBD4基因存在串聯(lián)重復(fù)現(xiàn)象(圖6)。同時在32個LBD基因中發(fā)現(xiàn)了5對存在共線性的基因,其中在1E與3E染色體存在2對共線性基因、2E分別與4E和6E各存在1對共線性基因、4E與6E存在1對共線性基因。

圖6 長穗偃麥草LBD基因的共線性分析Fig.6 Collinearity analysis of LBD gene in Thinopyrum elongatum

2.5.2 基于長穗偃麥草LBD 基因家族與5個小麥族物種的共線性分析 長穗偃麥草與5個小麥族內(nèi)物種的共線性分析發(fā)現(xiàn)長穗偃麥草LBD 基因在小麥族中具有較好的保守性。同時,鑒定到長穗偃麥草特有的LBD 基因Tel-2E-LBD2、Tel-3E-LBD4、Tel-4E-LBD1、Tel-4E-LBD6(圖7)。在共線性分析過程中還發(fā)現(xiàn)LBD 基因家族中有染色體重復(fù)、易位和倒位等事件的發(fā)生。如Tel-1E-LBD4和Tel-3E-LBD5基因在A、B、D 和H 基因組中的第1、3同源群均存在1個共線性基因,表明A、B、D、H 基因組在進(jìn)化過程中發(fā)生了染色體重復(fù)現(xiàn)象;在普通小麥的4A 染色體上與長穗偃麥草Tel-4E-LBD3和Tel-4E-LBD10存在共線性的對應(yīng)的基因在4A 染色體上發(fā)生了易位現(xiàn)象;在長穗偃麥草中基因的排列順序為Tel-4E-LBD2、Tel-4E-LBD11、Tel-4E-LBD9,在 普通小麥和圓錐小麥4A 對應(yīng)的存在共線性的基因上發(fā)生了倒位現(xiàn)象,染色體位置變?yōu)門el-4ELBD9、Tel-4E-LBD11、Tel-4E-LBD2。此外在長穗偃麥草上LBD 基因與普通小麥的A、B、D 基因組存在共線性基因數(shù)均最多,說明在進(jìn)化的過程中普通小麥基因組染色體間發(fā)生了大量的易位與重復(fù),A 基因組和B基因組重排區(qū)塊明顯高于D 基因組,這與普通小麥形成過程中染色體組的加入相一致。

圖7 長穗偃麥草與5個物種間(A、B、D、H 基因組)的共線性分析Fig.7 Collinear analysis of Thinopyrum elongatum and five species(A、B、D、H genome)

3 討論

LBD 基因的表達(dá)與上游啟動子區(qū)域的順式作用元件有關(guān),LBD 基因上游順式作用元件涉及到植物生長發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫。如擬南芥DDA1基因在光形態(tài)建成中發(fā)揮作用[45],AtLBD40基因參與了植株的赤霉素響應(yīng)[46],ASL1、ASL16、ASL18、ASL20基因響應(yīng)生長素應(yīng)答 元 件 ARF7 和 ARF19 調(diào) 控 側(cè) 根 的 生長[20,47],AtLBD14參與ABA 的響應(yīng)調(diào)控側(cè)根的生長[48-49]。水稻Os-LBD37基因參與了氮代謝調(diào)節(jié)[50]。大豆GmLBD12基因參與了逆境響應(yīng)[51]。香蕉MaLBD5基因參與了茉莉酸甲酯介導(dǎo)的耐寒性的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[52]。長穗偃麥草LBD 基因的啟動子區(qū)域分布著43類與生長發(fā)育調(diào)控和逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件,如Tel-1ELBD4、Tel-3E-LBD1和Tel-6E-LBD1基因存在豐富的茉莉酸甲酯響應(yīng)元件;Tel-3E-LBD3基因含有豐富的光響應(yīng)元件;Tel-3E-LBD2含有生長素響應(yīng)元件等。表明長穗偃麥草中的LBD基因參與了光、激素、逆境等的表達(dá)和調(diào)控,為深入研究長穗偃麥草中LBD 基因家族中具體成員的功能奠定基礎(chǔ)。

基因重復(fù)產(chǎn)生功能差異,促進(jìn)了新基因的生成、對環(huán)境適應(yīng)以及在新物種形成中具有重要的作用[53]。不同的物種中均存在串聯(lián)重復(fù)事件,這表明基因重復(fù)在進(jìn)化中起著重要的推動作用[54]。例如AP2/ERF和WRKY 基因家族的擴(kuò)展主要是全基因組倍增、片段復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)[55-56]。長穗偃麥草LBD 基因家族內(nèi)共檢測到5對共線性基因和2對串聯(lián)重復(fù)基因,說明長穗偃麥草在長期的進(jìn)化過程中出現(xiàn)了基因重復(fù),而基因重復(fù)事件的出現(xiàn)促進(jìn)了基因新功能產(chǎn)生。

盡管小麥近緣種屬的優(yōu)異性狀已經(jīng)在小麥生產(chǎn)中得到了大量的應(yīng)用,但由于外源染色體片段和小麥染色體片段在減數(shù)分裂過程中不進(jìn)行聯(lián)會,以至于通過正向遺傳學(xué)的方法很難對外源基因進(jìn)行定位和克隆。因此,近緣種中絕大多數(shù)基因的克隆及作用機(jī)理的研究相對滯后。本研究從基因組水平完成了對長穗偃麥草LBD 基因家族的鑒定與生物信息學(xué)分析,與傳統(tǒng)的基因鑒定方法相比,可以快速完成對單個基因的初步鑒定,為后期對這些基因的深入研究和利用奠定基礎(chǔ)。