于海躍 續(xù)文婕 周 旸 戴賢君 潘家榮,*

(1 中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018；2 中國絲綢博物館，浙江 杭州 310002)

隨著當(dāng)今社會人民物質(zhì)水平的逐漸提高和日益豐富，每個國家都越來越注重文化保護(hù)研究和文化傳承發(fā)展。絲綢作為我國古代勞動人民智慧的一項偉大瑰寶，被賦予了特殊的藝術(shù)和文化價值，而絲綢的起源問題也被世人聚焦和關(guān)注。事實表明，絲綢發(fā)源于中國，但當(dāng)今國際社會仍有一些對這一事實提出的不同看法和反對意見，有些研究學(xué)者甚至發(fā)表印度絲綢起源論和中亞國家絲綢起源論，并提出所謂新證據(jù)[1-2]。因此建立一種蠶絲及相關(guān)絲織品的原產(chǎn)地溯源方法體系迫在眉睫。

穩(wěn)定同位素技術(shù)是進(jìn)行產(chǎn)地溯源較為有效的方法之一。在自然界中，外部環(huán)境和生物體不斷交換物質(zhì)組成，由于地理位置、環(huán)境、大氣條件和生物代謝類型等因素，生物體的同位素組成自然分餾將導(dǎo)致不同環(huán)境下不同生物的同位素組成具有差異性，即生物的同位素“指紋”將攜帶有關(guān)生物代謝類型和生物環(huán)境因素的信息，從而反映出生物本身的地理環(huán)境條件[3-4]。因此，根據(jù)生物體這種“自然指紋”，可以利用穩(wěn)定同位素分析技術(shù)測定代謝物質(zhì)的轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)變并進(jìn)行定性定量分析，從而對其產(chǎn)地進(jìn)行追溯。

在環(huán)境分析、水文變遷、食品及藥品科學(xué)等技術(shù)領(lǐng)域中，穩(wěn)定同位素技術(shù)應(yīng)用廣泛，如用于果汁摻假分析[5]、大米產(chǎn)地溯源[6]、蜂蜜摻假鑒別[7]等。近年紡織品產(chǎn)地研究也有應(yīng)用穩(wěn)定同位素技術(shù)的先例，如Frei等[8-9]測量分析了不同現(xiàn)代產(chǎn)地羊毛中的鍶同位素比值，對羊毛紡織物進(jìn)行了初步產(chǎn)地溯源方法的探究。

自古以來絲綢及相關(guān)絲織品主要原材料為養(yǎng)殖桑蠶形成的蠶繭，而喂養(yǎng)桑蠶的食物單一，即只以桑葉為喂食材料，因此桑葉中的同位素會直接傳遞到蠶，并最終存在于形成的蠶繭中[10]，即在蠶繭上或由蠶繭制成的蠶絲及對應(yīng)的絲織品中可能會留下特定的同位素特征，形成長久的地理環(huán)境標(biāo)識。因此，在蠶繭產(chǎn)地溯源研究中，最首要的任務(wù)是判別和確定不同來源或產(chǎn)地蠶繭中的穩(wěn)定同位素比值是否有差異，并分析可能產(chǎn)生比值差異的原因。本研究利用穩(wěn)定同位素技術(shù)對4個地區(qū)蠶繭中的13C、18O、15N和2H同位素比值進(jìn)行測定和分析，旨在初步探究利用穩(wěn)定同位素特征區(qū)分不同蠶繭產(chǎn)地的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶繭樣品分別取自湖北、山東、四川、浙江4個地區(qū)，共64份樣本，每份樣本至少包含10個蠶繭，由中國絲綢博物館于2019年提供，均已烘干保存。IAEA-CH7、IAEA-600、IAEA-601、IAEA-NO3、V-SMOW、V-PPB都采購自北京瑞利君利科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MAT-253同位素比質(zhì)譜儀、Flash HT 2000元素分析儀，美國Thermo Scientific公司；DUG-9 240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品前處理 每份蠶繭樣本選取較為完整無污染的個體5個，放入烘干機(jī)設(shè)定溫度110℃進(jìn)行烘干干燥，再將每份樣本單獨剪碎成2 mm×2 mm顆粒，利用研缽持續(xù)加入液氮研磨后過篩收集，分類裝入2 mL離心管，準(zhǔn)備連續(xù)測樣。

1.3.2 穩(wěn)定碳氮同位素比值檢測方法 稱取約0.2 mg待測樣品，在超凈臺用錫杯(4 mm×4 mm×6 mm)包裹后，放置于Flash HT 2000元素分析儀樣品盤中，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)氣體為CO2和N2。氦氣吹掃流量設(shè)定為200 mL·min-1，燃燒爐溫度設(shè)定送樣溫度為恒溫960℃，氣相色譜柱設(shè)定經(jīng)過溫度為恒溫50℃，此溫度條件下樣品中的碳氮元素轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2，通過氦載氣流經(jīng)水阱，經(jīng)過恒溫50℃的氣相色譜柱使其分離，最后進(jìn)入MAT-253同位素比質(zhì)譜儀。

1.3.3 穩(wěn)定氫氧同位素比值檢測方法 稱取約0.2 mg待測樣品，在超凈臺用銀杯(4 mm×4 mm×6 mm)包好后放置于Flash HT 2000元素分析儀樣品盤中，設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)氣體為H2和CO。氦氣吹掃流量設(shè)定為100 mL·min-1，燃燒爐溫度設(shè)定送樣溫度為恒溫1 380℃，氣相色譜柱設(shè)定經(jīng)過溫度為恒溫50℃，此溫度條件下，銀杯包裹樣品中的氫氧元素在玻璃碳管中經(jīng)高溫裂解反應(yīng)形成H2和CO，經(jīng)過恒溫50℃的氣相色譜柱使其分離，最后進(jìn)入MAT-253同位素比質(zhì)譜儀中進(jìn)行檢測。

1.3.4 同位素測量標(biāo)準(zhǔn) 在分析過程中，標(biāo)樣采用國際標(biāo)樣IAEA-CH7、IAEA-600、IAEA-601和IAEA-NO3進(jìn)行對照和標(biāo)定，采用兩點校正法對樣品的測試結(jié)果進(jìn)行校正。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，待測蠶繭樣品在每種同位素測定時都進(jìn)行3次重復(fù)測樣，測量結(jié)果取最后的平均值。穩(wěn)定同位素比率測定公式如下：

δX=(R樣品-R標(biāo)準(zhǔn))/R標(biāo)準(zhǔn)×1 000‰[11]

式中，X分別代表13C、15N、2H、18O等；R相應(yīng)為13C/12C、15N/14N、2H/H、18O/16O，即測定蠶繭樣品的重同位素與輕同位素豐度比。δ2H和δ18O的國際標(biāo)準(zhǔn)參考樣品為V-SMOW，δ13C和δ15N的國際標(biāo)準(zhǔn)參考樣品為V-PDB[12]。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析與模型建立 利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、單指標(biāo)判別分析、多指標(biāo)判別分析，利用Fisher線性判別分析建立溯源模型，并驗證初始判別率和交叉判別率，采用Origin 2018(IBM)進(jìn)行相關(guān)圖像繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地蠶繭的穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N差異

在湖北、山東、四川、浙江4個省份共采集64份樣品，其中山東的緯度與其他3個地區(qū)相比最高[13]，經(jīng)度上四川位于最西[14]。

圖1 不同產(chǎn)地蠶繭中δ13C和δ15N的值Fig.1 Values of δ13C and δ15N in silkworm cocoons from producing areas

穩(wěn)定同位素δ13C、δ15N的測定結(jié)果如圖1所示，4個省份蠶繭的δ13C、δ15N變化范圍不同，δ13C的平均值范圍為-27.55‰至-24.24‰，δ15N的平均值范圍為2.45‰至7.98‰，上述結(jié)果顯示出了一定的地區(qū)差異性。由表2可知，山東蠶繭樣品δ13C平均值為-24.91‰， 顯著高于其他3個省份，湖北樣品δ13C值最低，為-26.57‰；山東樣品δ15N值為6.17‰，顯著高于其他地區(qū)，初步表明基于穩(wěn)定同位素值(δ13C、δ15N) 判別蠶繭產(chǎn)地具有一定的可行性。

表2 不同產(chǎn)地樣品中δ13C、δ15N的顯著性差異Table 2 Significant difference of δ13C, δ15N in samples from different producing areas /‰

圖2 不同產(chǎn)地蠶繭中δ18O和δ2H的值Fig.2 Values of δ18O and δ2H in silkworm cocoons from different producing areas

2.2 不同產(chǎn)地蠶繭的穩(wěn)定同位素δ18O、δ2H差異

穩(wěn)定同位素δ18O、δ2H測定結(jié)果如圖2所示，4個省份蠶繭的δ18O、δ2H變化范圍不同，δ2H的平均值范圍為-87.98‰至-54.03‰，δ18O的平均值范圍為16.81‰至23.90‰。結(jié)果顯示出一定的地區(qū)差異性，初步表明基于蠶繭的穩(wěn)定同位素值判別蠶繭產(chǎn)地具有一定可行性。

由表3可知，四川蠶繭樣品的δ2H值顯著高于湖北和山東，但與浙江蠶繭樣品相比不具有顯著差異性；湖北、四川、浙江蠶繭樣品之間的δ18O具有顯著差異性，其中四川蠶繭樣品的δ18O值最高，為23.23‰。結(jié)果表明不同產(chǎn)地蠶繭樣品之間的δ18O、δ2H值具有一定的顯著差異性，但不足以完全區(qū)分不同原產(chǎn)地蠶繭，需結(jié)合多種指標(biāo)進(jìn)行原產(chǎn)地溯源研究。

表3 不同產(chǎn)地樣品中δ2H和δ18O的顯著性差異Table 3 Significant difference of δ2H and δ18O in samples from different producing areas /‰

2.3 基于多同位素指標(biāo)的蠶繭產(chǎn)地判別分析和溯源模型建立

線性判別分析是一種有監(jiān)督的模式識別方法[15]，F(xiàn)isher最早提出線性判別分析等相關(guān)概念[16]，這種識別方法通過建立樣品的判別函數(shù)對判定樣本進(jìn)行分類[17]。將蠶繭樣本的同位素測量結(jié)果作為原始數(shù)據(jù)，對產(chǎn)地進(jìn)行判別分析，采用Fisher函數(shù)線性判別并利用逐步判別法將樣本按地區(qū)分組建模，并利用留一法進(jìn)行交叉檢驗驗證。由表4可知，隨著同位素指標(biāo)的逐漸加入，初始判別率和交叉判別正確率得到了明顯提升。

表4 多個同位素指標(biāo)組合對蠶繭產(chǎn)地判別的準(zhǔn)確率Table 4 Accuracy of multiple isotope index combinations to distinguish the origin of silkworm cocoons /%

表5 判別分類得分表Table 5 Discriminant classification score table

最后選擇采用δ13C、δ18O、δ15N、δ2H建立蠶繭產(chǎn)地溯源模型，表5是溯源模型的判別得分表，最后溯源模型的初始判別率和交叉判別正確率分別為84.5%和77.6%。判別函數(shù)分別為：Y(湖北)=-1 746.21-115.79δ13C+13.33δ15N+0.17δ2H+18.05δ18O，Y(山東)=-1 589.42-108.99δ13C+13.69δ15N-0.03δ2H+18.16δ18O，Y(四川)=-1 762.93-115.36δ13C+12.51δ15N+0.31δ2H+19.95δ18O，Y(浙江)=-1 748.46-115.44δ13C+13.22δ15N+0.217δ2H+18.79δ18O，在蠶繭產(chǎn)地溯源的實際應(yīng)用中，根據(jù)所建立的溯源判別模型可對上述4個地區(qū)的盲樣進(jìn)行判別分類。將儀器測定的4種穩(wěn)定同位素值即δ13C、δ18O、δ15N和δ2H對應(yīng)代入溯源模型中，盲樣歸屬于對應(yīng)的Y值最大的地區(qū)[18]。

3 討論

近年來，同位素技術(shù)逐漸應(yīng)用于產(chǎn)地溯源和追蹤研究等領(lǐng)域，如水果產(chǎn)地溯源中采用穩(wěn)定同位素技術(shù)鑒別庫爾勒香梨產(chǎn)地[19]；糧油產(chǎn)地溯源中基于穩(wěn)定氫氧同位素鑒別花生油摻假[20]；中草藥產(chǎn)地溯源中采用穩(wěn)定同位素技術(shù)對竹節(jié)參進(jìn)行產(chǎn)地溯源[21]和環(huán)境污染追蹤中利用氮氧同位素解析水體中硝酸鹽污染來源[22]等。在溯源研究中，4種穩(wěn)定同位素測定值受外界人為因素的干擾較小，其豐度主要與當(dāng)?shù)氐牡乩憝h(huán)境、大氣狀態(tài)、溫度和水文等密切相關(guān)[23-25]，進(jìn)而穩(wěn)定同位素特征能夠體現(xiàn)出當(dāng)?shù)氐牡乩憝h(huán)境特征。因此，本試驗通過測定不同地區(qū)的蠶繭中δ13C、δ18O、δ15N和δ2H 4種同位素豐度，利用單因素方差分析、多重比較分析、Fisher線性判別分析留一法交叉驗證，最后建立蠶繭產(chǎn)地溯源模型來區(qū)分試驗地區(qū)的蠶繭。

蠶繭中穩(wěn)定同位素比率的測定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地蠶繭中的δ13C、δ18O、δ15N和δ2H同位素豐度均存在一定的顯著性差異。這與前人判定四川和浙江桑葉同位素δ13C、δ18O、和δ2H值存在差異[26]的結(jié)果一致。蠶繭中的碳元素主要來源于蠶食用的桑葉，而桑葉中的碳元素主要由光合作用合成，其受到大氣狀態(tài)、光照時間、溫度情況等外部地理環(huán)境因素的影響。各產(chǎn)區(qū)的溫度情況不同導(dǎo)致桑葉生長中碳同位素分餾，在進(jìn)行蠶的喂食之后，進(jìn)而影響蠶繭樣品的重同位素與輕同位素比值，因此導(dǎo)致各地區(qū)蠶繭樣本中δ13C的平均值具有一定差異。

隨著外界環(huán)境變化，植物本身的物候期也發(fā)生相應(yīng)變化，在利用水分來源上存在著較大的時空差異，大氣降水、溫度、空氣濕度、土壤水分等環(huán)境因子影響著植物穩(wěn)定同位素組成[26-27]。研究表明，植物樣品的δ18O、δ2H值隨緯度變化而變化，隨著海拔上升而降低，存在一定的緯度效應(yīng)和海拔效應(yīng)[28]。本研究中，山東的緯度與其他3個地區(qū)相比具有較大差異，為最高緯度的采樣區(qū)域，從同位素測量結(jié)果可以看出，山東產(chǎn)區(qū)樣品的δ18O處于較低水平、δ2H低于其他3個產(chǎn)區(qū)，這在一定程度驗證了海拔效應(yīng)和緯度效應(yīng)對重同位素與輕同位素比值的影響。

動物中的δ15N值主要受土壤狀況、氣候變化及農(nóng)業(yè)施肥活動等地理環(huán)境因素的影響[29]。研究表明，施用有機(jī)肥可提高土壤和植物中氮含量，而施用化肥則降低土壤與植物中氮含量[30]。本研究中，山東產(chǎn)區(qū)蠶繭樣品的δ15N值顯著高于其他3個地區(qū)，這一現(xiàn)象可能與當(dāng)?shù)剡^去的農(nóng)業(yè)活動和土壤施肥情況有關(guān)。

從氣候角度分析，低緯度到高緯度的變化會導(dǎo)致溫度降低，降水中的重同位素也逐漸貧化[31]。從地理環(huán)境角度分析，四川盆地的地形作用使得盆地區(qū)域內(nèi)高溫、高濕，近地面層貼地逆溫加強(qiáng)[32]，一定程度上導(dǎo)致四川蠶繭樣品的δ2H值相對較高。因此，在分析同位素含量差異時要充分考慮地形與氣候所造成的影響。

同位素特征可能會從桑葉傳遞到蠶繭，在蠶繭中留下特定的同位素特征。因此從目前的研究結(jié)果來看，用不同產(chǎn)地桑蠶繭制成的絲綢中，其穩(wěn)定同位素特征信息也可能不同。而本研究中，逐步線性模型的總體判別準(zhǔn)確率為84.5%，說明此模型比較適于蠶繭產(chǎn)地溯源。

4 結(jié)論

本研究采用穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀測定浙江、湖北、四川、山東4個產(chǎn)地蠶繭中的穩(wěn)定同位素δ13C、δ18O、δ15N和δ2H值。結(jié)合單因素方差分析、逐步判別分析和Fisher線性判別分析等統(tǒng)計學(xué)判別分析手段，結(jié)果表明通過δ13C、δ18O、δ15N和δ2H這4個指標(biāo)進(jìn)行判別分析并建立蠶繭產(chǎn)地溯源模型，判別模型的初始判別準(zhǔn)確率達(dá)到84.5%，交叉驗證判別率達(dá)到77.6%，可對4個產(chǎn)地的蠶繭樣品進(jìn)行比較有效地判別區(qū)分，適于進(jìn)行蠶繭產(chǎn)地溯源。