梁冬怡 劉麗紅 陳珊珊 苗慧瑩 劉浩然 孟凡亮 邵志勇 汪俏梅

(浙江大學園藝系/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝植物生長發(fā)育與品質(zhì)控制重點開放實驗室，浙江 杭州 310058)

油菜素甾醇(brassinosteroid，BR)是調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和逆境適應性的一類重要的植物激素，可以調(diào)控植物的微管分化、衰老、應激反應和光形態(tài)建成等[1-2]。BR生物合成或信號轉(zhuǎn)導受阻會導致植物生長遲緩，從而使BR相關的突變體有矮化表型[2-3]。目前，在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，BR信號的轉(zhuǎn)導途徑相關研究已經(jīng)比較透徹，已知BR信號主要由膜定位的BRI1-BAK1受體復合物感知，通過關鍵信號轉(zhuǎn)導組分BZR1/BES1調(diào)控目標基因表達[4]。通過甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)誘變處理擬南芥BR受體突變體bri1-119，篩選到對BR超敏感的功能獲得性突變體bes1-D，該突變體中BES1基因第698位胞嘧啶(C)替換為胸腺嘧啶(T)，導致去磷酸化狀態(tài)的活性BES1蛋白積累，從而產(chǎn)生葉柄長而彎曲和葉片窄而卷曲的表型[5]。與螺旋和卷曲生長相關的突變往往與微管功能相關，這些卷曲生長突變體通常有α微管蛋白或β微管蛋白基因的顯性負突變[6]。微管(microtubules)是α微管和β微管聚合而成的高度保守的極性聚合物，是真核細胞骨架的關鍵成分，在調(diào)節(jié)細胞內(nèi)運輸、細胞分裂，特別是細胞形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用[7-10]。微管的固有極性為其提供了一個動態(tài)較弱的負端和一個動態(tài)較強的正端。在聚合過程中，微管蛋白分子被定位在微管內(nèi)，使得α微管蛋白的微管面向緩慢增長的負端，而β微管蛋白面向快速增長的正端，細胞骨架的動態(tài)變化在植物的生長和發(fā)育過程中有重要作用。

BR信號轉(zhuǎn)導的一些上游組分，如BSKs和BSU1，可以通過改變BZR1/BES1的磷酸化或去磷酸化調(diào)節(jié)下胚軸細胞的伸長。BR信號轉(zhuǎn)導途徑中的負向組分——BIN2激酶通過磷酸化微管調(diào)節(jié)鋪板細胞形態(tài)和植物生長發(fā)育[11]。擬南芥中BZR1可以通過微管去穩(wěn)定蛋白MDP40(microtubule destablizing protein 40)調(diào)控微管介導的下胚軸細胞伸長[11-12]。番茄(Solanumlycopersicum)作為世界范圍內(nèi)廣泛栽培的蔬菜作物和發(fā)育研究的模式植物，探究番茄中BR通過微管影響其生長發(fā)育具有較大創(chuàng)新性，并有重要的經(jīng)濟價值和科學意義。本研究通過構(gòu)建番茄mSlBES1基因過表達植株(mSlBES1-OX)，并進行表型分析和功能研究；與SlTub6-eGFP轉(zhuǎn)基因材料雜交，生成熒光標記微管的mBES1過表達植株(mSlBES1-OX×SlTub6-eGFP，B×T)，探究mBES1過表達對微管蛋白量和穩(wěn)定性的影響，旨在揭示BR通過信號轉(zhuǎn)導組分BES1調(diào)節(jié)微管進而影響葉片形態(tài)的分子機制。

1 材料與方法

1.1 mSlBES1-OX與SlTub6-eGFP載體構(gòu)建與番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

將番茄SlBES1(Solyc04g079980)的核苷酸序列第695位胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T)，使SlBES1第232位氨基酸由脯氨酸(Proline)突變?yōu)榱涟彼?Leucine)，形成BR超敏響應基因mSlBES1。取種植在浙江大學紫金港校區(qū)溫室的野生型番茄(wildtype，WT，ACu)葉片cDNA為模版，利用SlBES1-F和SlBES1-R引物通過PCR反應獲得編碼序列(coding sequence, CDS)全長，將膠回收后獲得產(chǎn)物連接到pQB-V3載體上。以構(gòu)建的pQB-V3-SlBES1為模版，利用重疊聚合酶鏈式反應(overlapping PCR)方法獲得mBES1全長。具體如下：以SlBES1-F和mSlBES1-R及mSlBES1-F和SlBES1-R的引物組合方式使用PrimerSTAR高保真酶(TaKaRa，日本)分別擴增出兩段PCR產(chǎn)物。再以這兩段PCR產(chǎn)物為模板，以SlBES1-F和SlBES1-R為引物，擴增出mBES1全長。利用LR反應將mBES1的全長從pQB-V3初始載體中重組到帶有pGWB17表達載體上，獲得35S:mSlBES1-Myc質(zhì)粒。將過表達載體35S:mSlBES1-Myc轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，并侵染番茄子葉最終獲得潮霉素抗性植株利用PCR和實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測目的基因及其表達水平，最終獲得過表達株系。pSlTUB6:SlTub6-eGFP以及SlTub6-eGFP轉(zhuǎn)基因材料由浙江大學蔬菜生理實驗室構(gòu)建。番茄轉(zhuǎn)基因方法參考Shao等[13]的研究。

表1 mSlBES1-OX載體構(gòu)建引物Table 1 Primers for mSlBES1-OX construction

1.2 形態(tài)學和組織細胞學觀察

取生長30 d的WT與mSlBES1-OX同一位置葉片，做成石蠟切片，置于光學顯微鏡下觀察組織細胞學變化。該步驟由杭州浩克生物公司完成。

1.3 mSlBES1-OX 和SlTub6-eGFP雜交材料的構(gòu)建

將mSlBES1-OX 和SlTub6-eGFP進行雜交得到F1代植株，F(xiàn)1代自交獲得F2代植株。取F2代適量番茄幼嫩葉片研磨至粉末，加入1 mL按體積比9∶1混合的現(xiàn)配Tris-EDTA緩沖液(10 mmol·L-1Tris HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH值8)和提取緩沖液(200 mmol·L-1Tris HCl，pH值7.5)，250 mmol·L-1NaCl，25 mmol·L-1EDTA，0.5% SDS按9∶1的體積比混合，10 000 r·min-1離心2 min，取2 μL混合液進行PCR鑒定。以構(gòu)建完成的載體作為陽性對照，野生型DNA作為陰性對照。

表2 雜交材料鑒定引物Table 2 Primers for hybrid material identification

1.4 鋪板細胞形態(tài)觀察

選取生長5周的B×T和SlTub6-eGFP同一葉位平整的幼嫩葉片制作裝片。在激光共聚焦顯微鏡下(Nikon A1，日本)觀察，激發(fā)波長488 nm，檢測的發(fā)射波長為480～520 nm。使用Image J軟件測量鋪板細胞的周長和面積、圓度值、突起數(shù)。樣本量≥70，用SPSS軟件進行One-way ANOVA顯著性分析。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)試驗

取生長6周的WT，mSlBES1-OX、SlTub6-eGFP 和PCR鑒定呈陽性的B×T同一葉位的葉片材料進行試驗。葉片經(jīng)液氮磨成細粉，溶解于RIPA緩沖液[25 mmol·L-1Tris-HCl，pH值7.4，140 mmol·L-1NaCl，1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，0.1%脫氧膽酸鈉(sodium deoxycholate)，0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5 mmol·L-1乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)，2 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)現(xiàn)配現(xiàn)用]中。取上清進行Western Blot試驗，然后用相應的兔源微管蛋白多克隆一抗(Tubulin4，友科生物，上海)和羊抗兔標記二抗(康為世紀，泰州)進行檢測。蛋白條帶灰度值分析參考Fu等[14]的研究。

1.6 微管解聚劑外源處理

取生長6周的生長狀態(tài)較一致的SlTub6-eGFP和B×T材料同樣葉位的葉片置于裝有80 μmol·L-1氨磺樂靈(Oryzalin，美國)溶液注射器中，抽真空處理，暗培養(yǎng)30 min，每10 min用激光掃描共聚焦顯微鏡拍照記錄1次。

2 結(jié)果與分析

2.1 mSlBES1-OX 和SlTub6-eGFP雜交材料的鑒定和表型分析

2.1.1 雜交材料鑒定及表型分析 提取mSlBES1-OX和SlTub6-eGFP雜交材料F2代番茄植株葉片的基因組DNA，進行PCR擴增，如圖1所示。mSlBES1-OX的擴增條帶為454 bp，SlTub6-eGFP的擴增條帶為850 bp。雜交成功(mSlBES1-OX×SlTub6-eGFP,B×T)的株系如圖2所示，mSlBES1-OX的葉片沿主脈卷曲，葉色變淺；與mSlBES1-OX相比，B×T雜交材料葉片的卷曲程度降低，且葉片顏色加深，部分恢復到野生型的表型。

注：M：DL 2000 DNA Marker；C：陽性對照mSlBES1-OX植株；T: 陽性對照 SlTub6-eGFP；WT：背景型，wild type；1～22：番茄雜交植株編號。Note: M: DL 2000 DNA Marker. C: Positive control (mSlBES1-OX). T: Positive control (SlTub6-eGFP). WT: Negetive control, wild type. 1 to 22: Number of the obtained mSlBES1-OX×SlTub6-eGFP.圖1 雜交材料鑒定Fig.1 Identification of the hybrid plants

圖2 B×T雜交材料及父母本植株表型Fig.2 Phenotypic characterization of B×T tomato hybrid and parent plants

2.1.2mSlBES1-OX轉(zhuǎn)基因材料的顯微觀察 取生長30 d的mSlBES1-OX轉(zhuǎn)基因材料番茄葉片進行橫切，做成石蠟切片，在光學顯微鏡下拍照，結(jié)果如圖3所示。mSlBES1-OX與WT維管束形態(tài)相似，較完整；WT中柵欄組織與海綿組織排列整齊，mSlBES1-OX葉邊緣彎曲，且柵欄組織與海綿組織細胞形狀不規(guī)則。

注：*表示在P<0.05水平差異顯著。Note:* indicates significant difference at 0.05 level.圖5 SlTub6-eGFP和B×T鋪板細胞的表面積、圓度值和突起數(shù)Fig.5 The area, circularity and lobe number of SlTub6-eGFP and B×T pavement cells

2.2 過表達mBES1對番茄植株葉片鋪板細胞的影響

通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察雜交材料鋪板細胞，如圖4所示。與SlTub6-eGFP相比，mSlBES1-OX雜交材料(B×T)鋪板細胞的鋸齒狀形態(tài)更加明顯。用Image J比較表皮鋪板細胞的突起數(shù)量、表面積、周長及圓度值，mSlBES1-OX雜交材料的突起數(shù)顯著高于SlTub6-eGFP，而表面積和圓度值均顯著小于SlTub6-eGFP(圖5)。

2.3 mSlBES1-OX卷葉分子生物學機制探究

2.3.1mSlBES1-OX調(diào)控微管蛋白表達水平 為探究mBES1過表達改變?nèi)~形和鋪板細胞形態(tài)與微管蛋白的表達關系，本研究用Western Blot方法檢測WT、mSlBES1-OX、SlTub6-eGFP和B×T株系中微管蛋白表達水平，如圖6所示。mSlBES1-OX的微管蛋白表達量低于WT，表明mSlBES1-OX過表達降低了微管蛋白的水平。與之對應的，雜交材料B×T的微管蛋白表達水平少于SlTub6-eGFP。上述結(jié)果表明BES1可能通過減少微管蛋白的表達量來調(diào)控葉片的形態(tài)。

注：R值表示微管蛋白相對于內(nèi)參Rubisco水平的積累，WT中的微管蛋白的相對含量記作為標準1。Note: The R value represents the tubulin protein accumulation relative to the Rubisco level, and the protein accumulation in WT normalized to rubisco as standard 1.圖6 WT、mSlBES1-OX、 SlTub6-eGFP 和B×T的微管蛋白水平Fig.6 The tubulin protein levels in WT, mSlBES1-OX, SlTub6-eGFP and B×T

2.3.2mSlBES1-OX調(diào)控微管蛋白的穩(wěn)定性 為探究mSlBES1對微管蛋白穩(wěn)定性的影響，使用80 μmol·L-1氨磺樂靈外源處理B×T并觀察其微管排列情況。如圖7所示。在微管解聚劑處理之前，SlTub6-eGFP和B×T鋪板細胞中的微管排列清晰可見，用80 μmol·L-1氨磺樂靈處理10 min后，雜交材料細胞中的微管幾乎全部消失；而SlTub6-eGFP鋪板細胞中的微管部分消失，20 min以后，SlTub6-eGFP和雜交材料鋪板細胞中的微管全部被解聚劑破壞(圖7-B)。結(jié)果表明，BES1介導的BR信號增強破壞了微管的穩(wěn)定性，使微管對解聚劑更加敏感。

3 討論

葉片在感知光質(zhì)、光量和日照時間方面起著重要作用，是植物進行光合作用的主要器官。葉片形態(tài)的變化會影響光合能力，扁平的葉片光合作用效率較高，而在干旱條件下，適當?shù)木砣~可以最大限度地捕捉光線，減少葉片輻射和蒸騰作用[14-16]。如卷葉是水稻理想株型的重要指標，在水稻育種中中度卷葉有利于葉片直立和緊湊的植株結(jié)構(gòu)，在高密度種植下具有重要農(nóng)業(yè)生產(chǎn)價值[17]。除光合作用外，葉片作為源組織調(diào)控糖向庫的運輸，不同葉形通過對糖分布的調(diào)節(jié)實現(xiàn)對產(chǎn)量和含糖量的平衡控制。

植物的極性生長對植物激素的響應和細胞分裂之間的協(xié)調(diào)是葉片形態(tài)建成和發(fā)育所必不可少的，這種協(xié)調(diào)性如失去平衡則會導致葉片形狀的改變，導致葉片卷曲、皺縮、扭曲、呈放射狀或萎縮等[18-21]。本研究構(gòu)建的番茄BR信號轉(zhuǎn)導關鍵組分BESl過表達材料葉肉細胞形態(tài)呈多邊形(圖3)，鋪板細胞突起變多且表面積顯著低于野生型(圖5)，與擬南芥bes1-D突變體表型相似[11]，表明BES1對細胞形態(tài)的調(diào)控功能在不同物種中具有保守性。擬南芥微管蛋白突變體和番茄微管結(jié)合蛋白IQ67的亞型SUN的過表達株系，其葉形均受到影響[22]，預示可能存在通過微管蛋白調(diào)控番茄葉片形態(tài)的途徑。本研究發(fā)現(xiàn)mBES1基因的過表達減少了微管蛋白表達量，這與擬南芥中的研究結(jié)果一致[11]。本研究中mSlBES1-OX和SlTub6-eGFP雜交材料與mSlBES1-OX相比卷曲程度減弱，部分恢復到野生型的表型，原因可能是雜交材料部分補充了微管蛋白的表達量，這也與Western Blot結(jié)果中雜交材料的微管蛋白表達量多于mSlBES1-OX相對應(圖2、6)。破壞微管結(jié)合蛋白(microtubules associated proteins，MAPs)造成的微管排列缺陷會生成卷曲螺旋狀的葉片，該蛋白包括SPR1(SPIRAL1)、SPR2(SPIRAL2)、EB1(ENDBINDING1)、MOR1(MICROTUBULE ORGANIZATION1)、ARK2(ARMADILLO REPEAT KINESIN2)[23-28]。皮質(zhì)微管動態(tài)變化與螺旋卷曲生長之間存在很強的相關性，本研究采用微管解聚劑處理雜交材料發(fā)現(xiàn)，mBESl基因的過表達降低了微管的穩(wěn)定性，所以BES1介導的BR信號通路既影響微管蛋白的表達量又影響其穩(wěn)定性，并以此調(diào)控細胞形態(tài)建成并生成卷葉表型。

除本研究發(fā)現(xiàn)的BR對葉片卷曲的調(diào)控，生長素與葉片平坦度之間也存在一定的關系。例如，番茄生長素響應因子4(AUXIN RESPONSE FACTOR 4)的RNA干擾(SlARF4-RNAi)株系會產(chǎn)生向上卷曲的葉片[29]，番茄生長素轉(zhuǎn)運蛋白4(PIN-FORMED)的RNA干擾(SlPIN4-RNAi)株系葉片不平整從而改變了植物結(jié)構(gòu)[30]，生長素流入載體基因SlLAX1(LIKE AUXIN RESISTANT 1)通過平衡葉片上下鋪板細胞的生長控制葉片平整度，該基因突變導致番茄卷曲葉片的生成[31]。BR和生長素作為不同植物激素種類，很可能通過不同的機制調(diào)控植物的生長；同時，植物激素的信號轉(zhuǎn)導途徑存在著復雜的互作網(wǎng)絡，不同激素間相互協(xié)調(diào)從而共同調(diào)控植物葉片形態(tài)建成的具體原理仍有待進一步研究。

注：A: DMSO對照處理0～30 min后鋪板細胞中微管的觀察情況；B: 80 μmol·L-1 氨磺樂靈處理0～30 min后鋪板細胞中微管的觀察情況。Note: A: Microtubules were observed in the cotyledon pavement cells after treatment with DMSO as control for 0～30 min. B: Microtubules were observed in the cotyledon pavement cells after treatment with 80 μmol·L-1 oryzalin for 0～30 min.圖7 微管解聚劑處理后鋪板細胞的微管動態(tài)平衡(標尺=25 μm)Fig.7 The dynamic balance of microtubule in the pavement cells under oryzalin treatment(bar=25 μm)

4 結(jié)論

本研究首先構(gòu)建了番茄mSlBES1-OX過表達材料，與野生型相比，mSlBES1-OX轉(zhuǎn)基因植株具有明顯的卷葉表型。為探究其調(diào)控機制，本研究將mSlBES1-OX轉(zhuǎn)基因材料和熒光標記微管材料進行雜交，得到番茄熒光標記微管的mSlBES1-OX過表達材料B×T。在細胞層面，mSlBES1基因過表達改變了細胞形態(tài)從而調(diào)控葉片形態(tài)；在分子機制層面，mBES1基因的過表達減少了微管蛋白表達量并降低了微管的穩(wěn)定性，從而改變?nèi)~片的形態(tài)，使葉片卷曲。這些結(jié)果表明BESl可以調(diào)控微管蛋白介導的細胞形態(tài)進而影響葉片形態(tài)建成。