鄭家瑞 李云洲

(1 貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院， 北京 100193)

番茄斑萎病毒(Tomato Spotted Wilt Orthotospovirus, TSWV)屬布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)，嚴(yán)重威脅我國番茄的安全生產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟損失[1-2]。TSWV病毒粒子近球形，基因組包含3條單鏈RNA(single strand RNA，ssRNA)，分別為ssRNA-L(8 897 nt)、ssRNA-M(4 821 nt)、ssRNA-S(2 316 nt)[3]。其中，ssRNA-L編碼RNA依賴型RNA聚合酶，該酶參與病毒的復(fù)制過程；ssRNA-M編碼病毒在細胞間移動所需的非結(jié)構(gòu)蛋白NSm，此外，其編碼的糖蛋白Gn-Gc能夠與TSWV的傳播介體細胞相互識別，促進病毒粒子與傳播介體細胞的融合，從而提高傳毒效率；ssRNA-S編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NSs以及N蛋白，NSs可抑制基因沉默，N蛋白與3條基因組緊密交聯(lián)，組成核糖體核蛋白(ribosomal protein, RNPs)[4-6]。

TSWV侵染番茄植株后，可引起葉柄或莖部出現(xiàn)黑色條紋、葉片產(chǎn)生壞死斑、番茄果實果面出現(xiàn)環(huán)斑等癥狀，最終影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)[7]。該病毒主要通過西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)傳毒，且西花薊馬(F.occidentalis)獲毒后終身傳毒[8], 因此TSWV的防治較為困難。目前，防治TSWV的特異性農(nóng)藥尚未被研制開發(fā)，生產(chǎn)上主要通過常規(guī)雜交育種方式將抗性基因Sw-5、Sw-7滲透到栽培品種中以防治TSWV，這種方法的人工和時間成本較高，且提供的病毒抗性不穩(wěn)定。雖然通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以快速獲得抗病毒材料，但是目前消費者對轉(zhuǎn)基因食品接受度低。因此通過外界因子前處理誘導(dǎo)抗性，為番茄TSWV治理提供了新思路。

誘導(dǎo)抗性(induced resistance，IR)指植物經(jīng)過外界生物因子、化學(xué)物質(zhì)或物理因子等前處理所激發(fā)的植物自身免疫系統(tǒng)，當(dāng)病原物再次侵染植株所表現(xiàn)出的更加強烈的防御抗性[9]。利用植物誘導(dǎo)抗性提高農(nóng)作物產(chǎn)量性狀具有省時、省力、效果顯著等優(yōu)點[10]。植物誘導(dǎo)抗性屬于自身免疫反應(yīng)，具有非?；浴⑾到y(tǒng)廣譜性、持效性、安全性等特點[11]。另外，植物誘導(dǎo)抗性還可以促進植物體內(nèi)一系列生理代謝活動，有助于植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量提高，因此利用植物誘導(dǎo)抗性提高農(nóng)作物抗性的相關(guān)研究備受科研工作者關(guān)注[12]。

苯并噻二唑(benzothiadiazole, BTH)是最常用的植物誘抗劑之一，具有廣譜性強、安全性高等特點[13]，目前已在多種農(nóng)作物上進行研究報道[14-16]。Lopez-Gresa 等[17]研究發(fā)現(xiàn)BTH處理可以提高番茄植株對灰霉菌的抗性；Trejo-Saavedra等[18]研究發(fā)現(xiàn)BTH處理可以提高辣椒對辣椒金色花葉病毒(pepper golden mosaic virus，PepGMV)的抗性，然而關(guān)于BTH是否可以誘導(dǎo)番茄植株抗TSWV的研究甚少。因此，本試驗以矮番茄為研究對象，通過檢測BTH前處理后，接種TSWV對番茄植株在生理水平和分子水平上的影響，探究BTH前處理誘導(dǎo)植株對TSWV抗性的影響，以期為誘導(dǎo)番茄以及其他蔬菜的抗TSWV病毒研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用番茄材料為矮番茄[19-20]，源自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)創(chuàng)新實驗室，保存于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室。TSWV毒源來自西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院番茄種質(zhì)創(chuàng)新實驗室，于-80℃保存?zhèn)溆?。苯并噻二?BTH)購自上海源葉生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗場所 試驗地點為貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物特色重點實驗室和植物病理教研室植物生長氣候室。

1.2.2 BTH處理及TSWV接種方法 對5片真葉期的番茄幼苗設(shè)置4個處理，分別為：(1)對照(Control)；(2)BTH；(3)Control +TSWV；(4)BTH+TSWV。Control 為清水處理；BTH處理濃度為0.1 mmol·L-1， 用BTH溶液進行葉面噴霧，直至液珠均勻分布于葉面上。TSWV接種的時間為BTH處理48 h后，接種方法參考石巖等[21]的方法，每個處理15株，3次重復(fù)。

1.2.4 TSWV含量檢測方法 在接種TSWV 21 d后，采集第3片真葉提取RNA，每個處理15株，重復(fù)3次，同一處理隨機選擇3～5株等量混合提取總RNA?？俁NA提取通過TRIzol法，DNAase祛除DNA后，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于定量檢測的模板。通過實時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)技術(shù)檢測TSWV的含量，引物如表1所示。反應(yīng)體系20.0 μL：SYBR Master Mix(2×)10.0 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA模板4.0 μL，焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbo-nate, DEPC)H2O 4.4 μL。擴增程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火15 s，40個循環(huán)；95℃變性10 s，65℃退火10 s，95℃延伸5 s。每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。

1.2.5SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3表達量測定方法 另選取30株5片真葉期的矮番茄幼苗，分為2組，每組15株，重復(fù)3次(采集樣品是隨機取3～5株等量混合，3次技術(shù)重復(fù))。其中一組用0.1 mmol·L-1BTH進行葉面噴霧，另一組用清水處理作為對照。分別于BTH處理后0、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0 h取第3片真葉，使用qRT-PCR技術(shù)測定SlMAPK1、SlMAPK2和SlMAPK3的表達量，具體方法與檢測TSWV含量的方法一致。以SlEF1α為內(nèi)參基因，引物如表1所示，每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)。

表1 所用引物Table 1 Primers in this study

1.2.6 石蠟切片方法 在接種TSWV 21 d后，采集第3片真葉中間包含葉脈的部分(1.0 cm×1.0 cm)，在卡諾固定液中進行固定，送往賽維爾生物公司(武漢)進行包埋、切片、制片，使用體式顯微鏡(M205 FA，德國Leica)進行拍照。

1.2.7 發(fā)病嚴(yán)重度檢測 在接種21 d后，檢測4個處理中各番茄植株的發(fā)病情況，發(fā)病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)如表2所示[21]。

表2 番茄斑萎病毒病發(fā)病嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Grading standard for severity of tomato spotted wilt disease

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2017統(tǒng)計數(shù)據(jù)，SPSS 22.0軟件分析顯著性差異(P<0.05，Tukey’s test)，Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 BTH前處理對番茄植株發(fā)病嚴(yán)重度的影響

如表1所示，在未接種病毒時，番茄植株表現(xiàn)為無癥狀。在0.1 mmol·L-1BTH前處理的番茄植株上接種TSWV，其發(fā)病嚴(yán)重度低于直接接種TSWV的植株，表明BTH前處理能夠提高番茄植株對TSWV的抗病性。

表3 番茄植株發(fā)病嚴(yán)重度Table 3 The disease severity in tomato plant

2.2 BTH前處理對番茄植株TSWV拷貝數(shù)的影響

在接種病毒21 d后，通過qRT-PCR檢測TSWV的拷貝數(shù)，如圖1所示。0.1 mmol·L-1BTH+TSWV處理中TSWV的拷貝數(shù)顯著低于Control+TSWV處理。表明BTH前處理能夠抑制TSWV在番茄植株內(nèi)的復(fù)制，從而提高番茄植株對TSWV的抗性。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: * indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 番茄葉片TSWV相對含量Fig.1 TSWV relative content in tomato leaves

2.3 抗氧化能力

注：不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level. The same as following.圖2 番茄葉片抗氧化活性Fig.2 Antioxidant activity in leaves of tomato plants

2.4 質(zhì)膜穩(wěn)定性

接種TSWV當(dāng)天(0 d)，各處理組植株的離子滲透率與MDA含量無顯著差異(圖3)。在接種6 d后，BTH+TSWV處理組離子滲透率和MDA含量均顯著低于Control+TSWV處理，并保持到接種12 d。接種12 d時BTH+TSWV處理的離子滲透率(32.91%)和MDA含量(8.09 μmol·g-1FW)比Control+TSWV處理的離子滲透率(37.17%)和MDA含量(9.77 μmol·g-1FW)分別低12.90個百分點、20.8%。證明0.1 μmol·g-1BTH前處理能夠提高質(zhì)膜的穩(wěn)定性，減輕TSWV對質(zhì)膜的破壞，從而提高番茄對TSWV的抗性。

圖3 番茄葉片質(zhì)膜穩(wěn)定性Fig.3 The stability of plasma membrane in tomato leaves

2.5 BTH抑制TSWV對細胞的解離

在Control+TSWV處理中，觀察莖的橫向切面可知(圖4-B)，細胞高度解離，細胞粘液化程度高，大部分細胞解體；觀察葉片徑向切面可知(圖4-F)，葉片的柵欄組織與海綿組織分界不明顯，細胞解離程度明顯高于對照。經(jīng)BTH+TSWV處理(圖4-D、H)的細胞解離程度明顯低于Control+TSWV處理。同時BTH處理與Control處理的葉肉細胞的狀態(tài)無明顯差異。上述結(jié)果表明，BTH前處理能夠明顯減輕TSWV對番茄細胞的傷害。

注：A：Control處理組的莖橫切面；B：Control+TSWV處理組的莖橫切面；C：BTH處理組的莖橫切面；D：BTH+TSWV處理組的莖橫切面；Control 處理組的葉片縱切面；F：Control+TSWV處理組的葉片縱切面；G：BTH處理組的葉片縱切面；H：BTH+TSWV處理組的葉片縱切面。Note: A: Cross section of stem in Control treatment group. B: Cross section of stem in Control+TSWV treatment group. C: Cross section of stem in BTH treatment group. D: Cross section of stem in BTH+TSWV treatment group. E: Longitudinal section of leaf in Control treatment group. F: Longitudinal section of leaf in Control+TSWV treatment group. G: Longitudinal section of leaf in BTH Treatment group. H: Longitudinal section of leaf in BTH+ TSWV treatment group.圖4 TSWV對番茄葉片細胞的破壞程度Fig.4 The damage of TSWV to cells in tomato plant

2.6 BTH前處理誘導(dǎo)的SlMAPK1/2/3表達

如圖5所示，0.1 mmol·L-1BTH處理0.5 h后，SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3的表達量均顯著高于對照。在BTH處理后的0.5～12.0 h之內(nèi)，SlMAPK3的表達量均顯著高于對照，而SlMAPK1、SlMAPK2的表達量變化趨勢大致相同，均為先升后降，表達量僅在個別時間段顯著高于對照。上述結(jié)果證明0.1 mmol·L-1BTH處理能夠激發(fā)絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)通路。

圖5 BTH前處理誘導(dǎo)的SlMAPK1/2/3的表達Fig.5 Expression of SlMAPK1/2/3 induced by BTH pretreatment

3 討論

本研究通過施用誘抗物質(zhì)BTH提高了番茄植株的抗氧化能力、降低了病毒含量，從而降低病毒對葉片細胞的破壞、提高植株對TSWV的耐性，表明誘導(dǎo)植物抗性可以用于防治植物病毒，這與于力等[25]報道發(fā)現(xiàn)BTH可以提高番茄植株對番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)的抗性表現(xiàn)一致。但是TSWV屬于RNA病毒，而TYLCV屬于DNA病毒，因此推斷BTH誘導(dǎo)的植物抗性不僅可以耐DNA病毒而且可以耐RNA病毒。另外，BTH誘導(dǎo)的植物抗性可以防御植原體，如Damelio等[26]研究發(fā)現(xiàn)BTH可以減輕黃化植原體(chrysanthemum yellows phytoplasma, CYP)對菊花的損傷、提高菊花對CYP的抗性。因此推斷BTH誘導(dǎo)的植物抗性屬于廣譜性抗性。

本研究還發(fā)現(xiàn)BTH可以提高植物體內(nèi)抗氧化防御酶活性，這與李江文等[27]的研究一致。隨后也有研究發(fā)現(xiàn)誘抗劑，如BTH和殼聚糖，可以提高植株葉片POD、PPO與PAL活性和植株的抗病性，從而推斷防御酶主要參與調(diào)控木質(zhì)素與抗菌物質(zhì)的合成。另外，防御酶可以清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)，降低ROS對細胞膜的損害，從而降低細胞的解離和破壞[28-30]。而Jiang等[31]與馬暉玲等[32]報道BTH可以誘導(dǎo)馬鈴薯采后傷口ROS累積，有助于傷口愈合，這一結(jié)果與本試驗相反，可能原因是病毒侵染和薯塊傷口愈合的生理調(diào)節(jié)過程有所不同，更重要的是前者理樣品為薯塊，而本試驗為植株的葉片，導(dǎo)致不同植株部位對BTH處理反應(yīng)有所不同。MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，能夠改變質(zhì)膜透性，破壞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能[33]。本試驗通過檢測MDA含量反應(yīng)細胞膜的完整性，表明BTH可以緩減病毒對細胞的裂解與破壞，這與國淑梅等[34]研究結(jié)果一致。另外，本研究在實驗室環(huán)境中進行，而田間環(huán)境相對復(fù)雜、不可控因素較多，因此植物誘導(dǎo)抗性抗病毒的效果有待進一步研究。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)信號在植物誘導(dǎo)抗性中發(fā)揮重要作用，在MAPK級聯(lián)通路中，MAPKKK最先被胞外信號磷酸化激活，并通過磷酸化作用，將信號逐級傳遞到MAPKK和MAPK[35]。本試驗發(fā)現(xiàn)BTH可以誘導(dǎo)番茄MAPK級聯(lián)相關(guān)基因SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3的表達，而前人研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中AtMAPK3和AtMAPK6對于誘導(dǎo)抗性至關(guān)重要，且SlMAPK3和AtMAPK3同源，SlMAPK1/2和AtMAPK6同源[20]，因此推測番茄MAPK級聯(lián)信號系統(tǒng)可能同樣參與BTH誘導(dǎo)的番茄抗病毒防御。MAPK級聯(lián)信號不僅在植物抗病方面發(fā)揮重要作用，在植物抗逆方面同樣重要[36]。Lv等[37]研究發(fā)現(xiàn)，SlMAPK1/2與一氧化氮(nitric oxide，NO)在番茄抗低溫信號系統(tǒng)中存在聯(lián)系。此外在番茄抗低溫研究中SlMAPK1/2和活性氧H2O2信號之間也存在交叉[38]，至于在番茄抗TSWV中SlMAPK1/2與H2O2之間的交叉關(guān)系，仍需進一步研究。

BTH前處理能夠誘導(dǎo)MAPK級聯(lián)通路和水楊酸(salicylic acid, SA)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)通路相關(guān)基因的表達[20,39-41]，MAPK被激活后，能夠磷酸化不同的效應(yīng)蛋白以表現(xiàn)出不同的功能，并且可以進入細胞核，作用于轉(zhuǎn)錄因子從而調(diào)控基因的表達[36]，番茄SlMAPK1/2/3下游磷酸化靶標(biāo)底物是什么，以及BTH誘導(dǎo)的番茄耐TSWV是否是由MAPK級聯(lián)信號介導(dǎo)的SA信號通路等，仍需進一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，0.1 mmol·L-1BTH前處理能夠激發(fā)番茄MAPK級聯(lián)通路關(guān)鍵基因SlMAPK1、SlMAPK2、SlMAPK3的表達，降低TSWV對番茄葉片質(zhì)膜穩(wěn)定性和抗氧化能力的破壞程度，降低病毒對番茄葉片細胞的解離與破壞程度，降低病毒在番茄葉片內(nèi)的含量，增強番茄植株對TSWV的耐性，誘導(dǎo)植物抗病性以抵御植物病毒侵染。