余源嬋 楊茂發(fā),,* 商勝華 劉健鋒 于曉飛 狄雪塬

(1 貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州大學(xué)昆蟲研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025；2 貴州大學(xué)煙草學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025；3 貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽(yáng) 550081)

植物在與昆蟲長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中形成了多種可遺傳抵制昆蟲侵害的防御機(jī)制及策略[1]。植物對(duì)植食性昆蟲的防御機(jī)制體系可分為組成型防御和誘導(dǎo)型防御[2]，兩者均存在物理和化學(xué)上的防御作用。其中組成型防御主要指植物利用本身固有且不依賴于外界脅迫存在的外部結(jié)構(gòu)和內(nèi)部原有組成化合物來(lái)阻礙昆蟲附著取食，如植物角質(zhì)層上的光滑蠟質(zhì)、表皮上的刺和毛狀體等[3-4]。植物體內(nèi)的自然組分如芥子油苷、煙堿等對(duì)為害昆蟲具有致死作用[5-6]。誘導(dǎo)型防御即植物受到蟲害等外界脅迫時(shí)誘導(dǎo)作物啟動(dòng)一系列化學(xué)防御和物理防御，如次生代謝物、防御蛋白以及部分營(yíng)養(yǎng)成分的改變等，可對(duì)昆蟲的取食產(chǎn)生忌避或抑制，進(jìn)而殺死害蟲或延緩害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，擾亂昆蟲的正常生理代謝[7]；經(jīng)誘導(dǎo)改變?nèi)~脈結(jié)構(gòu)、葉片厚度、葉面茸毛和刺，增加木質(zhì)化程度等來(lái)提高植物的蟲食耐受性[7-8]。此外，蟲害誘導(dǎo)的植物揮發(fā)物還可吸引寄生和捕食性天敵控制害蟲，或趨避植食性昆蟲成蟲產(chǎn)卵等[9]。相關(guān)研究表明，植物為抵御植食性昆蟲侵害所進(jìn)化出的蟲害誘導(dǎo)抗性可明顯提高植物的適生性[10-11]，且這種植物誘導(dǎo)抗性具有一定遺傳性[12]。

煙草(NicotianatabacumL.)是我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位[13]。為滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，多種人為培育的產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)良的煙草品種的部分抗性機(jī)制與野生型煙草相比被極大削弱[14-15]，導(dǎo)致實(shí)際生產(chǎn)中大部分煙草的農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)較為脆弱，極易感染病蟲草害。斜紋夜蛾(SpodopteralituraFabricius)，隸屬鱗翅目夜蛾科，取食的寄主達(dá)300多種，可直接導(dǎo)致作物嚴(yán)重減產(chǎn)26%～100%[16]，同時(shí)也是煙草栽培的主要害蟲之一，其幼蟲啃食煙株的煙葉、花蕾和果實(shí)等，嚴(yán)重影響到煙葉的生產(chǎn)和煙草育種工作的開(kāi)展[17]。目前大田中仍以化學(xué)農(nóng)藥滅殺為主、其他防治為輔的方式來(lái)防治斜紋夜蛾，但化學(xué)防控嚴(yán)重污染環(huán)境且會(huì)增加煙草的農(nóng)殘量。通過(guò)探究蟲害誘導(dǎo)植物抗性對(duì)后取食昆蟲的影響，有助于尋找合適方法使植物產(chǎn)生抗蟲防御警備，從而減少殺蟲劑的使用[18]。本研究以雄性不育品系K326煙草品種為材料，研究在煙蚜[Myzuspersicae(Sulzer)]、斜紋夜蛾和棉鈴蟲[Helicoverpaarmigera(Hübner)]等蟲害脅迫下，煙草誘導(dǎo)抗性對(duì)斜紋夜蛾取食和解毒酶系的影響，以機(jī)械損傷誘導(dǎo)和未作任何處理的煙草為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，探究不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性對(duì)斜紋夜蛾的抵御水平，以期為培育優(yōu)化煙草抗性品種和斜紋夜蛾的田間綜合防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年9—11月在貴州大學(xué)昆蟲研究所的實(shí)驗(yàn)溫棚及人工氣候室內(nèi)完成。供試煙草為雄性不育K326(male sterility K326，MS K326)，由遵義市進(jìn)化鎮(zhèn)煙草天敵繁育中心提供。在溫室大棚中進(jìn)行漂浮育苗，正常管理，待煙苗長(zhǎng)至4片真葉時(shí)，用營(yíng)養(yǎng)腐殖土進(jìn)行單株培育，將盆栽煙苗移入無(wú)蟲紗網(wǎng)籠中長(zhǎng)至6片真葉時(shí)供試。

供試?yán)ハx煙蚜采自貴州省遵義市鳳岡縣進(jìn)化鎮(zhèn)煙田，隨后在自然環(huán)境下的MS K326煙株上繼代籠罩飼養(yǎng)，挑取無(wú)翅成蚜饑餓3 h后供試。斜紋夜蛾種群為貴州大學(xué)昆蟲研究所實(shí)驗(yàn)室(L∶D=14∶10；溫度27±1℃；濕度70%±5%)長(zhǎng)期建立的穩(wěn)定飼料種群，飼料配方參照文獻(xiàn)[19]。將近孵化的斜紋夜蛾卵塊放在幼嫩煙苗上，用防蟲網(wǎng)籠隔離飼養(yǎng)至3齡幼蟲時(shí)，選取大小一致的3齡幼蟲饑餓12 h后供試。棉鈴蟲購(gòu)于河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司，飼養(yǎng)及試驗(yàn)處理?xiàng)l件同斜紋夜蛾。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取長(zhǎng)勢(shì)相同的煙株，抗性誘導(dǎo)處理位置為煙株上部從上至下數(shù)第一片完全展開(kāi)葉(除心葉外)。共設(shè)6種處理：CK，未作任何處理的煙株；斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理，參考Zong等[20]的方法并略作修改，將1頭饑餓處理12 h的斜紋夜蛾3齡幼蟲投放到指定誘導(dǎo)葉片并套上透明紗網(wǎng)袋，當(dāng)其取食時(shí)開(kāi)始正常計(jì)時(shí)，24 h后移除蟲體及套袋；棉鈴蟲誘導(dǎo)處理，與斜紋夜蛾取食誘導(dǎo)處理相似；機(jī)械(打孔)處理，利用自制打孔器(d=0.5 cm)對(duì)指定誘導(dǎo)葉片進(jìn)行輪流打孔處理，分別在0、6、12、18 h各進(jìn)行一輪打孔；煙蚜誘導(dǎo)處理，用濕潤(rùn)小毛筆挑取15頭無(wú)翅成蚜至煙草指定誘導(dǎo)葉背面并套袋，待煙蚜穩(wěn)定取食10 min后開(kāi)始計(jì)時(shí)，24 h后用軟毛筆輕輕刷去煙蚜；機(jī)械(針刺)處理，利用顯微注射針5根一束，分別在5、10 min時(shí)對(duì)指定誘導(dǎo)葉片進(jìn)行針刺，針刺3次為一組，之后開(kāi)始正式處理計(jì)時(shí)。全部植株處理24 h后備用。每處理重復(fù)3次以上。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 斜紋夜蛾幼蟲取食選擇試驗(yàn) 參照王洪濤等[21]方法，略作修改。將采集的6種處理植株葉片(煙株上部第二片完全展開(kāi)葉)制作成直徑為2 cm的葉碟，放置在底部有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿(直徑14 cm)中，每皿接入10頭初孵幼蟲(孵化12 h內(nèi))或饑餓處理后的1頭3齡幼蟲，2種處理分別重復(fù)20和40次。移入人工氣候箱(L∶D=14∶10；溫度27±1℃；濕度70%±5%)中，取食24 h后檢查培養(yǎng)皿內(nèi)不同處理葉碟片上取食的幼蟲數(shù)，計(jì)算初孵幼蟲取食選擇率。

利用激光多功能打印一體機(jī)對(duì)3齡蟲體取食后的剩余葉碟片面積進(jìn)行掃描，之后用特定的處理軟件Image J計(jì)算剩余葉片面積，從而計(jì)算蟲體取食面積。

1.3.2 斜紋夜蛾幼蟲解毒酶活性測(cè)定 3齡斜紋夜蛾幼蟲饑餓處理12 h后，分別轉(zhuǎn)移至各處理煙葉上飼養(yǎng)，每個(gè)飼養(yǎng)盒轉(zhuǎn)接5頭斜紋夜蛾幼蟲作為1個(gè)重復(fù)，每種煙葉處理共設(shè)8個(gè)重復(fù)，即每個(gè)處理共有40頭幼蟲，分8個(gè)飼養(yǎng)盒飼喂。分別在飼養(yǎng)4、12、24、48 h時(shí)取各處理時(shí)段后的斜紋夜蛾試蟲液氮速凍后凍存至-80℃冰箱，用于后續(xù)酶活性測(cè)定。將凍存蟲體樣品取出加液氮研磨后分別稱取0.1 g加入1 mL各測(cè)定指標(biāo)提取液，快速震蕩搖勻后按照對(duì)應(yīng)的說(shuō)明書要求進(jìn)行低溫離心，取上清液置于冰上待測(cè)。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AchE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)、羧酸酯酶(carboxylesterase，CarE)、多功能氧化酶(mixed-functional oxidase，MFO)等酶活性和酶原蛋白含量測(cè)定分別按照試劑盒(蘇州科銘生物科技有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行。每個(gè)處理設(shè)生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理統(tǒng)計(jì)，利用DPS V7.05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行5%的差異顯著性檢驗(yàn)，所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用GraphPad Prism 7.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蟲害誘導(dǎo)煙株煙葉對(duì)斜紋夜蛾取食的影響

如圖1-A所示，各種蟲害處理煙株中，斜紋夜蛾的初孵幼蟲對(duì)斜紋夜蛾(DS)處理株煙葉的選擇取食率與CK(14.45%)相比差異顯著，僅有8.96%，初孵幼蟲對(duì)棉鈴蟲(DH)和煙蚜(DM)處理株煙葉的取食選擇率與CK接近，分別為11.00%和14.67%。此外，初孵幼蟲對(duì)2種機(jī)械損傷(MP和MN)處理的煙株煙葉選擇取食率均與CK無(wú)顯著差異。可見(jiàn)，3種蟲害煙株中，斜紋夜蛾的初孵幼蟲偏愛(ài)取食煙蚜處理株煙葉，而相對(duì)拒食斜紋夜蛾處理株煙葉。由圖1-B可知，3種蟲害誘導(dǎo)抗性對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲的取食量無(wú)顯著影響，與CK相比，斜紋夜蛾幼蟲顯著偏好取食機(jī)械打孔處理誘導(dǎo)的煙株。

注：CK：健康未接蟲植株；MP：機(jī)械打孔；DH：棉鈴蟲取食；DS：斜紋夜蛾取食；DM：煙蚜取食； MN：機(jī)械針刺。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: CK: Healthy plant. MP: Mechanical pricks. DH: Damaged by H. armigera. DS: Damaged by S. litura. DM: Damaged by M. persicae. MN: Mechanical needles. Different lowercase letters show significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性對(duì)斜紋夜蛾初孵幼蟲取食選擇率(A)和3齡幼蟲取食面積(B)的影響Fig.1 Effects of tobacco resistance induced by different pests on the feeding selection rate (A) of the newly hatched larvAAnd feedinGArea of 3rd instar larvae (B) of S. litura

2.2 不同蟲害葉對(duì)斜紋夜蛾解毒酶活性的影響

2.2.1 對(duì)斜紋夜蛾AchE活性的影響 由表1可知，斜紋夜蛾3齡幼蟲取食不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性的煙葉后，體內(nèi)AchE活性均被誘導(dǎo)升高，且各蟲害誘導(dǎo)后的AchE活性變化趨勢(shì)具有特異性，其中取食煙蚜蟲害處理組煙葉的斜紋夜蛾幼蟲AchE活性在48 h內(nèi)被激活的幅度最大；取食棉鈴蟲蟲害處理組煙葉的斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)AchE活性在24 h時(shí)較CK顯著提高29.56%，取食斜紋夜蛾蟲害組煙葉的幼蟲活性在48 h時(shí)較CK顯著提高21.35%，煙蚜蟲害組煙葉處理的蟲體酶活性則分別在12和48 h時(shí)較CK顯著提高36.45%和65.17%；取食機(jī)械打孔和針刺處理組煙葉后斜紋夜蛾幼蟲體內(nèi)的AchE活性分別在12和24 h時(shí)較CK顯著提高了37.38%和33.04%。

2.2.2 對(duì)斜紋夜蛾CarE活性的影響 由表2可知，斜紋夜蛾3齡幼蟲取食各蟲害誘導(dǎo)的煙葉后體內(nèi)CarE活性變化不同。斜紋夜蛾取食各蟲害誘導(dǎo)處理的煙葉后體內(nèi)CarE活性在24 h內(nèi)均呈逐漸上升趨勢(shì)；48 h時(shí)，取食棉鈴蟲和斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理煙葉的斜紋夜蛾蟲體CarE活性持續(xù)升高，其中棉鈴蟲誘導(dǎo)處理組較CK顯著提高了14.38%，斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理組升高至與CK接近，煙蚜誘導(dǎo)處理組則呈下降趨勢(shì)。取食機(jī)械打孔誘導(dǎo)煙葉的斜紋夜蛾CarE活性在48 h內(nèi)較CK無(wú)明顯升高，取食針刺誘導(dǎo)的煙葉后斜紋夜蛾的CarE活性則分別在4和24 h時(shí)較CK顯著提高了22.61%和39.82%。

表1 不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲AchE活性的影響Table 1 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on AchE activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

表2 不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲CarE活性的影響Table 2 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on CarE activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

2.2.3 對(duì)斜紋夜蛾GST活性的影響 由表3可知，斜紋夜蛾3齡幼蟲取食不同蟲害誘導(dǎo)煙葉后體內(nèi)GST活性變化有所差異，其中取食棉鈴蟲和斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理的煙葉后活性在48 h內(nèi)整體受到抑制或升高后與CK接近，取食煙蚜誘導(dǎo)處理組的GST活性則在4 h時(shí)較CK顯著提高了47.47%，之后活性較CK顯著降低。取食打孔處理煙葉的斜紋夜蛾幼蟲GST活性在12 h時(shí)抑制明顯；針刺處理組除24 h時(shí)GST活性與CK接近，其余時(shí)間段GST活性均被顯著抑制。

2.2.4 對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲MFO活性的影響 由表4可知，斜紋夜蛾3齡幼蟲取食各蟲害誘導(dǎo)的煙葉后體內(nèi)MFO活性變化存在差異。其中棉鈴蟲誘導(dǎo)處理組的MFO活性在48 h內(nèi)變化不明顯，24 h時(shí)活性僅為CK的70.00%，顯著受到抑制；取食斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理的煙葉后，斜紋夜蛾幼蟲的MFO活性呈先降低后升高再趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)，48 h時(shí)活性較CK顯著提高了72.22%。取食機(jī)械打孔誘導(dǎo)處理煙葉后斜紋夜蛾幼蟲MFO活性在48 h時(shí)升高至接近對(duì)照；針刺處理的MFO活性4 h時(shí)與對(duì)照接受后呈逐漸下降趨勢(shì)。

表3 不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲GST活性的影響Table 3 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on GST activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

表4 不同蟲害誘導(dǎo)煙草抗性對(duì)斜紋夜蛾3齡幼蟲MFO活性的影響Table 4 Effects of tobacco resistance induced by different insect pests on MFO activities of 3rd instar larvae of S. litura /(nmol·min-1·mg-1 prot)

3 討論

蟲害誘導(dǎo)的植物防御反應(yīng)會(huì)改變后取食昆蟲的食物質(zhì)量[22-24]，影響昆蟲的正常取食，破壞昆蟲機(jī)體正常的生理代謝[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，面對(duì)6種處理株煙葉，斜紋夜蛾初孵幼蟲偏好取食煙蚜和打孔誘導(dǎo)株煙葉，而相對(duì)避免取食斜紋夜蛾誘導(dǎo)株煙葉；3齡幼蟲則偏好大量取食打孔誘導(dǎo)株煙葉。Serteyn等[26]研究發(fā)現(xiàn)茶翅蝽(Halyomorphahalys)誘導(dǎo)的蠶豆(ViciafabaL.)植株會(huì)延遲后取食茶翅蝽的針刺,同時(shí)縮短持續(xù)取食時(shí)間；胡海燕[27]研究表明，B型煙粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]誘導(dǎo)的煙草防御反應(yīng)提高了后取食B型煙粉虱對(duì)溫室白粉虱[Trialeurodesvaporariorum(Westwood)]的種間競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。不同蟲害誘導(dǎo)煙草防御生理存在顯著差異[6]，推測(cè)后取食者對(duì)不同誘導(dǎo)煙草的取食選擇不同，可能與寄主植物誘導(dǎo)的防御生理及揮發(fā)物成分差異有關(guān)[28-29]，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

昆蟲在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成了解毒、避毒、藏毒等適應(yīng)機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)植物體內(nèi)各種防御蛋白脅迫[30]，如調(diào)整體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和多功能氧化酶(MFO)等解毒酶活性變化[31-32]，可對(duì)攝入體內(nèi)的外源毒素和植物次生物質(zhì)進(jìn)行解毒和排毒。其中，AchE可快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿從而終止神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞增加蟲體耐受性；CarE可與外源毒素結(jié)合催化水解抑制其活性減輕機(jī)體損傷；MFO可通過(guò)過(guò)氧烷基、羥基化環(huán)氧化和硫醚氫化等方式參與多種殺蟲劑和自然毒素的代謝；GST可增加蟲體對(duì)有毒物質(zhì)的可溶性并將其排出體外[33-34]。前人研究表明，蟲害誘導(dǎo)植物防御對(duì)后繼的植食性昆蟲既有誘導(dǎo)作用也有抑制作用，如胡海燕[27]研究發(fā)現(xiàn)B型煙粉虱取食其自身為害的煙草葉，其成蟲體內(nèi)CarE、GST活性均明顯升高；而溫室白粉虱成蟲取食B型煙粉虱為害后的煙草葉后體內(nèi)的CarE和GST活性均被顯著抑制。牟峰等[35]研究表明西花薊馬[Frankliniellaoccidentalis(Pergande)]危害菜豆[PhaseolusvulgarisLinn.]后對(duì)西花薊馬解毒酶、保護(hù)酶和消化酶均起到抑制作用，削弱了蟲體對(duì)有毒次生物質(zhì)的解毒代謝功能。在本研究中，取食棉鈴蟲、斜紋夜蛾和煙蚜誘導(dǎo)處理煙草葉片的斜紋夜蛾體內(nèi)AchE活性分別在24、48、12和48 h時(shí)活性顯著升高，而各處理對(duì)應(yīng)的另外3種酶(CarE、EMFO和GST)活性則在處理48 h內(nèi)被不同程度地激活或抑制。取食針刺煙葉可激活斜紋夜蛾體內(nèi)AchE和CarE活性，而取食打孔煙葉僅激活斜紋夜蛾體內(nèi)AchE活性。表明不同誘導(dǎo)株煙葉均可激活斜紋夜蛾AchE活性，其他解毒酶活性響應(yīng)存在明顯的處理特異性。昆蟲啃食植物除了造成明顯的機(jī)械損傷外，還會(huì)使創(chuàng)面沾上口腔中分泌的唾液[36]；唾液分泌物中含有能引起并觸發(fā)植物特異性防御反應(yīng)的昆蟲特異性激發(fā)子，昆蟲口腔分泌物激發(fā)子種類繁多，所誘導(dǎo)的植物蟲害誘導(dǎo)抗性也存在物種差異性[37-38]。因而推測(cè)以上結(jié)果可能與不同昆蟲取食和機(jī)械誘導(dǎo)的煙草防御反應(yīng)差異[19]及不同齡期蟲體的解毒能力[39]有關(guān)。而有關(guān)以上不同處理下蟲體解毒酶活性變化差異所涉及的分子生物學(xué)機(jī)制還需深入研究。

4 結(jié)論

不同蟲害誘導(dǎo)處理煙株在一定程度上影響了后取食者斜紋夜蛾的取食及解毒酶系代謝機(jī)制，其中煙蚜取食和機(jī)械打孔誘導(dǎo)處理的煙葉對(duì)斜紋夜蛾幼蟲具有明顯的吸引取食作用，初孵幼蟲則避免選擇取食斜紋夜蛾誘導(dǎo)處理的煙葉；喂食各誘導(dǎo)抗性處理煙葉均可誘導(dǎo)激活斜紋夜蛾體內(nèi)AchE活性升高，而對(duì)CarE、GST和MFO等3種酶活性則存在不同程度地激活或抑制作用，說(shuō)明蟲害誘導(dǎo)煙草抗性能改變斜紋夜蛾的取食選擇，面對(duì)不同誘導(dǎo)抗性煙草，斜紋夜蛾體內(nèi)的各解毒酶活性變化具有特異性。