張 虹 路國棟 袁春春 郎思睿 陳 任

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/ 寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 寧夏 銀川 750021)

甜葉菊(SteviarebaudianaBertoni)屬菊科多年生草本植物，葉片中富含甜菊醇糖苷(steviol glycosids，SGs)，甜度為蔗糖的150～350倍[1-3]，熱量幾乎為零，是目前已知最甜且安全有效的天然糖料[4]，可作為兒童、成年人及老年人嗜糖群體理想的天然甜味劑。研究發(fā)現(xiàn)甜菊醇糖苷不僅能明顯降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平[5-6]，抑制高血糖素分泌，而且具有促進(jìn)肥胖癥患者減肥的作用，同時(shí)還具有降低血壓、降低尿酸值、抗氧化、抗病毒、清除皮膚炎癥等功效[7-8]。隨著人們對健康的崇尚，聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織聯(lián)合食品添加劑專家委員會(huì)第 73 次會(huì)議批準(zhǔn)純度不低于95%的甜菊醇糖苷可作為甜味劑使用[9]。歐盟食品安全局于2011年批準(zhǔn)純度不低于95%的甜菊醇糖苷為食品添加劑[10]，因此，甜菊醇糖苷在食品、醫(yī)藥、飲料、釀造、化妝品、飼料等生產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛。

甜葉菊中的主要甜菊醇糖苷成分有甜菊糖苷(stevioside, ST)、萊寶迪苷A(rebaudioside A, RA)、萊寶迪苷B(rebaudioside B, RB)、萊寶迪苷C(rebaudioside C, RC)、萊寶迪苷D(rebaudioside D, RD)、萊寶迪苷E(rebaudioside E, RE)、萊寶迪苷F(rebaudioside F, RF)、甜茶糖苷(rubusoside, RBS)和杜爾可苷A(dulcoside A, DA)9種。其中，ST的甜度是蔗糖的250～300倍，帶有后苦味；RA的甜度是蔗糖的350～450倍，無后苦味，味質(zhì)上與蔗糖較為接近，口感和品質(zhì)優(yōu)于ST，近幾年被廣泛應(yīng)用到低熱量食品及飲料開發(fā)中；RD在甜葉菊葉中的含量僅次于RA，其甜度是蔗糖的250倍[11-12]；RC、DA的甜度僅有蔗糖的40～60倍，伴有較強(qiáng)苦澀味。目前，RA、RD被簡稱為甜味糖苷， ST、RC、DA為苦味糖苷，其在總糖苷中的比例將影響到甜菊醇糖苷的品質(zhì)及市場應(yīng)用范圍。為提高甜菊醇糖苷的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開發(fā)不含苦味糖苷的高純度RA、RD產(chǎn)品，及對9種主要甜菊醇糖苷成分分離提純后復(fù)配使用是今后甜葉菊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向，因此，篩選及培育甜味糖苷高含量的甜葉菊新品系勢在必行。

在9種甜菊醇糖苷的生物合成途徑中，糖苷配基甜菊醇在不同的植物UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate-glycosyltransferases, UGTs)作用下，在C-19和C-13位上分別連接不同數(shù)目的葡萄糖基、木質(zhì)糖基和鼠李糖基，形成不同甜度和甜味的甜菊醇糖苷單品[13]。目前對甜葉菊UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因的研究多關(guān)注于SrUGT91D2e、SrUGT74G1和SrUGT76G1，其中SrUGT76G1是調(diào)控ST向RA轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵基因[14-15]，SrUGT74G1的表達(dá)調(diào)控ST合成，SrUGT91D2e的表達(dá)可催化甜菊醇單糖苷轉(zhuǎn)化為甜菊醇雙糖苷[16]。SrUGT91D2e的表達(dá)還參與RD的合成，而SrUGT76G1和SrUGT74G1的表達(dá)參與RC、DA的合成[17-18]。

甜菊醇糖苷的積累是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)力學(xué)過程[19]，即使同一品種在不同的生長條件下，糖苷的積累量也不同；同一生長條件下的同一品種，在不同發(fā)育時(shí)期，糖苷含量也不同，已有研究表明在花芽形成末期到開花初期，糖苷含量達(dá)到最大值[20]，且不同葉位的葉片糖苷含量不同，植株上位葉片的糖苷含量高于中間和下位葉。雖然已有一些研究表明糖苷的積累量受其生物合成途徑關(guān)鍵基因表達(dá)量的影響，但僅限于總糖苷及RA、ST的積累研究[21]，以及RA的積累與其主控基因表達(dá)量的關(guān)系，鮮有對9種甜菊醇糖苷的積累與已報(bào)道的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)量的相關(guān)性在甜葉菊中無相關(guān)研究。本研究對3個(gè)甜葉菊品種3個(gè)生長時(shí)期的9種主要甜菊醇糖苷含量進(jìn)行測定分析，同時(shí)對相關(guān)關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測，并進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在探究甜菊醇糖苷積累與基因表達(dá)之間的關(guān)系，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)甜葉菊品種的選育提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普賽科3號、同心、中山2號3個(gè)甜葉菊品種種植于寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)用地，試驗(yàn)地肥水常規(guī)處理。在3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期(幼苗期、營養(yǎng)生長期、花蕾期)采取每個(gè)品種隨機(jī)植株的上位3對葉片作為樣本，每個(gè)品種每個(gè)時(shí)期進(jìn)行3次重復(fù)。

ST、RA、RB、RC、RD、RE、RF、RBS、DA(純度≥97%)購自上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司。甲醇購自上海廣諾科技有限公司，乙腈(色譜純)購自美國MredATechnology公司，RE-05021植物總RNA提取試劑盒購自成都福際生物技術(shù)有限公司，AT311-03反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物。

1.2 儀器與設(shè)備

離子阱質(zhì)譜儀(QTRAP 6500)，美國AB SCIEX；色譜柱(T3 i.d.2.1, HSS T3 1.8.2)，美國WATERS；超微量分光光度計(jì)(NaroDrop 2000)，美國Thermo Fisher Scientific；熒光定量PCR儀(qTOWER3)，德國Analytik Jena。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜菊醇糖苷提取及含量測定 試驗(yàn)材料經(jīng)冷凍干燥后，取25 mg樣本，加入500 μL 70%甲醇水溶液，超聲10 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清，往沉淀中加入500 μL 70%甲醇水溶液重復(fù)提取1次，12 000 r·min-1離心10 min后合并上清液，上清液過濾膜后采用離子阱質(zhì)譜儀(流動(dòng)相0.04%乙酸超純水/5%～95%乙睛梯度洗脫)對RA、RB、RC、RD、RE、RF、ST、RBS、DA 9種甜菊醇糖苷成分進(jìn)行絕對定量檢測。

1.3.2 基因表達(dá)量檢測 甜葉菊葉總RNA提取采用植物總RNA提取試劑盒的方法；各RNA濃度及質(zhì)量用超微量分光光度計(jì)檢測，用RNase-Free雙蒸水稀釋至40 ng·μL-1作為樣本RNA。

每個(gè)樣品分別取出部分RNA混合，用RNase-Free雙蒸水調(diào)整成400 ng·μL-1的RNA溶液100 μL，然后稀釋4倍，配制6份作為繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用的RNA溶液、濃度分別為1/2、1/4、1/16、1/64、1/256、1/1 024。

反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法，每份待測樣品以及6份作為標(biāo)準(zhǔn)曲線用的樣品總RNA，分別加入到每份反應(yīng)液中反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)及基因表達(dá)檢測 采用Primer Express 3.0軟件(美國Applied Biosystems)設(shè)計(jì)各個(gè)基因的qRT-PCR擴(kuò)增引物，包括SrUGT76G1、SrUGT74G1、SrUGT91D2e以及作為內(nèi)參的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)基因(表1)，采用熒光定量PCR儀檢測每個(gè)樣本的基因表達(dá)情況。每次反應(yīng)(即每個(gè)96孔PCR板)分析一個(gè)基因，包括18份樣本cDNA，6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)線cDNA和2個(gè)空白對照、3次生物學(xué)重復(fù)。

qRT-PCR結(jié)束后，根據(jù)程序給定的本底基準(zhǔn)線PCR Baseline Subtracted(PCR增殖達(dá)對數(shù)階段)，從擴(kuò)增曲線上讀取每個(gè)基因在各個(gè)樣本的循環(huán)閾值Ct(threshold cycle)，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)線，獲得每個(gè)基因在各個(gè)樣本的起始質(zhì)量SQ值(starting quantity)。通過每個(gè)基因與內(nèi)參基因SQ的比值，計(jì)算每個(gè)基因在各個(gè)樣本的相對表達(dá)量和標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for fluorescent qRT-PCR

表2 不同品種不同生長發(fā)育時(shí)期9種甜菊醇糖苷含量Table 2 The contents of 9 steviol glycosides in differenTGrowth cultivars and different stages

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Microsoft Excel 2016及SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Duncan法進(jìn)行顯著性差異分析，采用Cytoscape 3.7.0進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種甜菊醇糖苷在3個(gè)品種3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期中的含量變化

甜菊醇糖苷含量的檢測結(jié)果表明，RB、RE、RF、ST、RBS、DA在普塞科3號中的3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期無顯著差異，其中苦味糖苷ST的平均含量為0.49 mg·g-1(干重，下同)，DA含量為0.01 mg·g-1；RA、RC、RD在不同生長發(fā)育時(shí)期其含量有顯著變化，其中甜味糖苷RA在營養(yǎng)生長期含量最高為1.60 mg·g-1，RD在花蕾期含量最高為1.58 mg·g-1，苦味糖苷RC在營養(yǎng)生長期的含量顯著高于花蕾期和幼苗期，為0.41 mg·g-1(表2)。

RA在中山二號的3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期無顯著差異，在營養(yǎng)生長期含量最高為1.26 mg·g-1；RB、RC、RD、RE、RF、ST、RBS、DA在不同生長發(fā)育時(shí)期含量有顯著變化，其中甜味糖苷RD在營養(yǎng)生長期和花蕾期含量顯著高于幼苗期，最高為0.85 mg·g-1；苦味糖苷RC在花蕾期的含量最高，為0.70 mg·g-1，且花蕾期和營養(yǎng)生長期的含量顯著高于幼苗期；ST在花蕾期的含量最高，為0.91 mg·g-1，且幼苗期和花蕾期的含量顯著高于營養(yǎng)生長期。

RA、ST在同心的3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期無顯著差異，其中甜味糖苷RA在幼苗期的含量為1.20 mg·g-1，苦味糖苷ST在營養(yǎng)生長期的含量為1.05 mg·g-1；RC、RD、RE、RF、RBS、DA在不同生長發(fā)育時(shí)期其含量有顯著變化，其中甜味糖苷RD、RF在營養(yǎng)生長期的含量顯著高于幼苗期，分別為0.70 mg·g-1和1.25 mg·g-1，苦味糖苷RC在營養(yǎng)生長期的含量最高，為0.71 mg·g-1，且營養(yǎng)生長期的含量顯著高于幼苗期和花蕾期；DA在花蕾期的含量最高，為0.63 mg·g-1，且花蕾期和營養(yǎng)生長期的含量顯著高于幼苗期。

對3個(gè)品種在3個(gè)時(shí)期的9種甜菊醇糖苷含量變化進(jìn)行柱形圖分析，結(jié)果表明，在幼苗期和營養(yǎng)生長期，甜味糖苷RA、RD在普塞科3號中的含量顯著高于中山2號和同心，RA在營養(yǎng)生長期含量最高，為1.60 mg·g-1；苦味類糖苷RC、ST、DA在普塞科3號中的含量顯著低于中山2號和同心，其中DA在普塞科3號的3個(gè)發(fā)育時(shí)期中的含量都為0.01 mg·g-1；在營養(yǎng)生長期和花蕾期，RE、RF、ST、DA在同心中的含量顯著高于中山2號和普塞科3號(圖1)。

注：A：幼苗期；B: 營養(yǎng)生長期；C：花蕾期。不同小寫字母表示同一時(shí)期不同品種間差異顯著(P<0.05)。下同。Note: A: Young seedling stage. B: Vegetative stage. C: Flower budding stage. Different lowercase letters indicates significance difference at 0.05 level among differenTCultivars in same growth stages. The same as following.圖1 同一時(shí)期不同品種間糖苷含量的差異性Fig.1 The content differences of 9 SGs in differenTCultivars at same growth stages

2.2 3個(gè)品種3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期甜菊醇糖苷合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)變化

對甜菊醇糖苷生物合成途徑相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR檢測分析，在同一生長發(fā)育時(shí)期，SrUGT91D2e和SrUGT76G1在普塞科3號中的表達(dá)最高，這與甜味糖苷RA、RD在3個(gè)品種的含量特點(diǎn)一致；而SrUGT74G1在普賽科3號中的表達(dá)量最低，這與苦味糖苷RC、ST、DA在3個(gè)品種中的含量特點(diǎn)一致，且與RE、RF在3個(gè)品種中的含量特點(diǎn)一致(圖2)。

表3 甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)量與9種糖苷含量的相關(guān)關(guān)系Table 3 The correlation between the expression levels of the key genes in SGs biosynthesis and the contents of 9 SGs

圖2 甜菊醇生物合成關(guān)鍵基因在不同品種 不同生長發(fā)育時(shí)期表達(dá)變化Fig.2 Expression level changess of the key genes in SGs biosynthesis in differenTCultivars and growth stages

2.3 不同甜菊醇糖苷含量與其合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)量的相關(guān)分析

將不同品種不同生長發(fā)育時(shí)期的各種甜菊醇糖苷含量與其合成關(guān)鍵酶基因的相對表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果表明，SrUGT76G1表達(dá)水平與RA含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與ST含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；SrUGT91D2e表達(dá)水平與RD含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與RBS含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；SrUGT74G1表達(dá)水平與RC、RF、ST、DA含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與RA、RD含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)(表3)。通過基因表達(dá)量與糖苷含量之間的相關(guān)系數(shù)，利用Cytoscape 3.7.0進(jìn)行可視化分析，基因與所調(diào)控的甜菊醇糖苷之間均存在0.80(紅色連線)以上相互關(guān)系，其中SrUGT76G1主要影響甜味糖苷RA的含量，SrUGT91D2e影響甜味糖苷RD的含量，SrUGT74G1的影響苦味糖苷ST和DA的含量(圖3)。

注: 基因表達(dá)量與甜菊醇糖苷含量的關(guān)聯(lián)系數(shù)用直線表示, 正、負(fù) 相關(guān)分別為紅色、綠色, 相關(guān)系數(shù)越大顏色越深。Note: The relationship between the expression levels of the key genes in SGs biosynthesis and the contents of 9 SGs are expressed in straight lines, positive and negative correlation are shown in red and green, and the darker color means the higher coefficient.圖3 甜菊醇糖苷生物合成關(guān)鍵基因表達(dá)量與9種甜菊醇 糖苷含量之間相互關(guān)系Fig.3 Relationship of between the expression levels of the key genes in SGs biosynthesis and the contents of 9 SGs

3 討論

3.1 甜菊醇糖苷在不同甜葉菊品種積累差異

各種甜菊醇糖苷在不同甜葉菊品種中的積累量不同，趙永平等[22]對引種的7個(gè)甜葉菊品種的RA進(jìn)行了檢測，ZS-3的RA含量為7.69%，極顯著高于其他品種，HY-1的RC含量極顯著高于其他品種。郭志龍等[23]對12個(gè)扦插培育的甜葉菊品系進(jìn)行了5種甜菊醇糖苷含量的測定，分析出了2個(gè)RA和RD含量占比較高的品系。朱靜雯等[24]對守田3號、江甜3號、譜星1號3個(gè)品種收獲期RA和ST的含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明RA在江甜3號中最高，ST在守田3號中最高。本研究對9種甜菊醇糖苷在3個(gè)品種中的積累量進(jìn)行了檢測，同前人分析結(jié)果相似，不同甜菊醇糖苷在不同品種中的積累量不同，普塞科3號中的甜味糖苷RA、RD的含量最高，2種甜味糖苷總量占9種糖苷總量的71%(中山2號40%，同心31%)，而苦味糖苷ST、RC、DA的含量最低，3種苦味糖苷總量占9種糖苷總量的20%(中山2號38%，同心40%)，可能是不同的品種具有不同的生理特性，導(dǎo)致糖苷的累積量不同。此外，不同生長發(fā)育時(shí)期，甜葉菊葉片接受的光照時(shí)長不同，其甜菊醇糖苷積累量也不同。Ceunen等[25-26]研究表明，糖苷的積累量受光周期的影響，在長日照條件下，甜葉菊葉生物量和總糖苷含量明顯上升，且RA與ST的含量比顯著增加。本試驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果，甜味糖苷RA在普塞科3號的營養(yǎng)生長時(shí)期(長日照)含量最高為1.60 mg·g-1，而ST在3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期的積累量無顯著變化，從而導(dǎo)致在長日照的營養(yǎng)生長期RA與ST的含量比顯著增加。因此，在品種選育上，普塞科3號是較好的甜味糖苷高含量可選品種，可選擇在營養(yǎng)生長期或花蕾期進(jìn)行收獲，以獲得較高純度的甜味成分甜菊醇糖苷。

3.2 生物合成途徑相關(guān)基因表達(dá)量對甜菊醇糖苷積累的影響

不同甜菊醇糖苷單品的積累量受其生物合成相關(guān)UGTs基因的表達(dá)調(diào)控，SrUGT76G1是RA合成的主要調(diào)控基因，在過表達(dá)SrUGT76G1的轉(zhuǎn)基因植株中，相比對照，RA與ST的含量比由0.3上升為1.55[17]。Mandal等[27]對甜葉菊3個(gè)生長發(fā)育時(shí)期的11個(gè)關(guān)鍵基因表達(dá)水平和單糖苷含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明，SrUGT76G1的高水平表達(dá)能夠提高RA與ST的含量比，從而提高甜菊醇糖苷混合物的甜度。Yang等[28]研究了甜葉菊不同生長發(fā)育時(shí)期甜菊醇糖苷的含量及合成途徑相關(guān)的15個(gè)基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在整個(gè)生長發(fā)育時(shí)期，甜菊醇糖苷的含量變化明顯，在花芽期RA和ST的含量都顯著高于快速生長發(fā)育期和盛花期，SrUGT74G1和SrUGT76G1在花芽期和盛花期的表達(dá)量顯著增加，SrUGT74G1在花芽期的表達(dá)量最高，ST在花芽期的含量最高。本試驗(yàn)中，在甜味糖苷RA含量較高的植株中檢測到了SrUGT76G1的高水平表達(dá)，在ST含量較低的植株中檢測到了SrUGT74G1的低水平表達(dá)，與前人結(jié)果一致。但不同的是，本試驗(yàn)檢測到RA含量較高的時(shí)期是營養(yǎng)生長期，而非花蕾期，這可能是同一基因在不同品種中的表達(dá)時(shí)期不同。此外，本試驗(yàn)結(jié)果表明甜味糖苷RD含量與SrUGT91D2e的表達(dá)水平呈極顯著正相關(guān)，而苦味糖苷ST、RC和DA含量與SrUGT74G1的表達(dá)水平呈極顯著正相關(guān)，說明不同甜菊醇糖苷的含量受其主控基因表達(dá)量的影響。因此，可利用基因的表達(dá)來調(diào)控不同甜菊醇糖苷的含量，提高甜味糖苷和苦味糖苷的比例，以獲得高質(zhì)量的甜菊醇糖苷。

4 結(jié)論

通過利用液相色譜-質(zhì)譜法(liquid chromatography mass spectrometry, HPLC-MS)對3個(gè)品種甜葉菊在不同生長發(fā)育時(shí)期上位3對葉片中的9種甜菊醇糖苷含量進(jìn)行檢測分析，普塞科3號中甜味糖苷RA和RD的含量顯著高于中山2號和同心，普塞科3號中苦味糖苷ST、RC和DA的含量顯著低于中山2號和同心，普塞科3號可作為理想的高甜味糖苷選育品種。對甜菊醇糖苷合成相關(guān)基因表達(dá)量及糖苷含量進(jìn)行相關(guān)性分析及可視化構(gòu)圖分析，進(jìn)一步證實(shí)SrUGT76G1是影響甜味糖苷RA含量的關(guān)鍵基因，推測SrUGT91D2e是影響甜味糖苷RD含量的關(guān)鍵基因，SrUGT74G1是影響苦味糖苷ST和DA含量的關(guān)鍵基因，其在9種甜菊醇糖苷合成中的具體功能需進(jìn)一步利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證。