楊珊珊 何翃閎 劉敏清 趙 凌 王靖雷 余四九 蔡得琪 潘陽陽,*

(1甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2甘肅省金昌市金川區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 甘肅 金昌 737100)

牦牛(Bosgrunniens)是生活在高寒低氧地區(qū)的珍稀高原物種，與藏民的生產(chǎn)生活密切相關(guān)[1-2]。它以極強的生命力和適應(yīng)性豐富著青藏高原地區(qū)的物質(zhì)和文化生活[3-4]。但牦牛是一種季節(jié)性繁殖動物，其繁殖能力低下，因此了解雌性牦牛生殖器官的分子生物學(xué)特性，可進一步提高牦牛的繁殖率。在哺乳動物中，輸卵管可發(fā)揮卵子攝取、精子儲存和獲能、受精以及受精卵發(fā)育和運輸?shù)纫幌盗杏幸?guī)律的生物學(xué)功能，從而保證妊娠正常進行[5-6]。輸卵管可根據(jù)其形態(tài)特征分為傘部、壺腹部和峽部，其中每一部分都參與特定的生理活動。輸卵管傘部的主要功能是拾卵，壺腹部和峽部則有利于卵子、精子在輸卵管中順利轉(zhuǎn)運及融合。卵子通過纖毛細(xì)胞的擺動和管壁的收縮運行至壺腹部，最終與獲能的精子相遇并發(fā)生結(jié)合[7-8]。因此，輸卵管整體為受精和胚胎早期的正常發(fā)育提供了良好的環(huán)境[9]。在哺乳動物輸卵管中精子和卵子的運送與結(jié)合依賴于母體分泌的蛋白和調(diào)節(jié)因子，因此鑒定與精卵相互作用有關(guān)的蛋白質(zhì)可幫助了解受精的分子基礎(chǔ)，從而有助于提高牦牛的繁殖性能[10]。

上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)為Ca2+依賴性單鏈跨膜糖蛋白，包含5個由110個氨基酸組成的胞外結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個高度保守的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過適配器蛋白(如β-連環(huán)蛋白)與肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用，可介導(dǎo)鈣依賴性細(xì)胞間粘附[11]。E-cadherin主要分布在上皮細(xì)胞表面，介導(dǎo)同種或異種細(xì)胞間的粘附，參與形成和維護正常細(xì)胞間的連接，其在胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長、細(xì)胞分化以及成體組織結(jié)構(gòu)的維持中起著關(guān)鍵作用[12-13]。早期有研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在人[14-15]和奶牛[16]的卵母細(xì)胞、精子、輸卵管上皮和子宮上皮中均有表達。另外，E-cadherin在大鼠配子中也有表達[17]。對與輸卵管上皮細(xì)胞共培養(yǎng)的精子中E-cadherin進行重新定位后發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在輸卵管-精子庫的組裝或拆卸中發(fā)揮作用[18]。通過敲除E-cadherin的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，缺失E-cadherin的突變胚胎不能形成滋養(yǎng)層上皮[19]。Ideta等[20]研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin可參與配子的交互作用，也可促進上皮細(xì)胞之間的選擇性粘附，并參與早期胚胎與子宮內(nèi)膜上皮的初步粘附。同時，針對功能的研究指出E-cadherin參與精卵的相互作用及精卵與女性生殖上皮細(xì)胞之間的粘附，從而促進輸卵管受精[21-22]。此外，有研究證實E-cadherin可能與其他蛋白質(zhì)結(jié)合，在發(fā)情周期調(diào)節(jié)配子或囊胚與輸卵管或子宮上皮之間的相互作用，提高細(xì)胞間粘附力，從而有助于配子在輸卵管中正常發(fā)育[23]。

綜上所述，E-cadherin對精卵的相互作用及早期的胚胎發(fā)育具有重要作用。然而，該蛋白在牦牛不同繁殖周期輸卵管不同部位的表達研究在國內(nèi)外尚鮮見報道。因此，本試驗以牦牛輸卵管為研究對象，采用實時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法對E-cadherin基因及蛋白在牦牛不同繁殖周期輸卵管中不同部位的表達和定位進行研究，為E-cadherin在牦牛不同繁殖周期輸卵管中的作用研究提供先決條件，從而為進一步探討E-cadherin在牦牛生殖過程中發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取無臨床病理表現(xiàn)的卵泡期、黃體期和妊娠期母牦牛(3～6歲)各6頭(樣品采于青海省西寧市百德屠宰場)，頸動脈放血處死，并分別采取卵泡期后期(有優(yōu)勢卵泡>6 mm)、黃體期后期(可見多個黃體)同側(cè)以及妊娠期早期(胚胎約長2～3 cm)妊娠側(cè)[24]的輸卵管傘部、壺腹部和峽部樣品，并用0.9%生理鹽水沖洗數(shù)次，一部分用錫箔紙包裹作為組織樣品放進有標(biāo)記的布袋中，置于液氮中4 h內(nèi)運回實驗室，-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?；另一部分置?%多聚甲醛溶液中固定，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑和儀器

E-cadherin(4A2)mouse mAb(#14472)抗體購自美國Cell SignalinGTechnology公司；二抗(Goat Anti-Mouse IgG/HRP)、Mo a beta-Actin(bsm-33 036M)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TransZol試劑盒購自北京全式金公司；兩步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Go ScriptTMReverse Transcription System)購自美國Promega公司；蛋白裂解液購自北京索萊寶公司；GoTaq?Green Master Mix 2×購自美國Promega公司；BeyoEcl曝光液購自中國Beyotime公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本寶生物公司；陽離子防脫片購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；T100TMThermal Cycler PCR儀購自美國BioRad公司；LighTCycler 96實時熒光定量PCR儀購自瑞士Roche公司；DP71顯微照相裝置購自日本Olympus公司。

1.3 E-cadherin基因的表達檢測

參照GeneBank數(shù)據(jù)庫中檢索牛E-cadherin基因(NM_001002763.1)和牦牛β-actin基因(DQ838049.1)的mRNA序列，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計E-cadherin和β-actin的引物(引物信息見表1)(E-cadherin引物濃度為10 μmol·L-1；β-actin引物濃度為10 μmol·L-1)，引物序列均在上海生工基因科技有限公司合成。將保存于-80℃的卵泡期、黃體期和妊娠期的牦牛輸卵管不同部位的組織研成粉末狀并稱量0.1 g后裝入標(biāo)記好的無RNA酶的EP管中，用TransZol試劑盒法提取總RNA，用分光光度計測定RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟于PCR儀中將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并保存于-20℃?zhèn)溆?。將卵泡期、黃體期和妊娠期輸卵管分別按照傘部、壺腹部和峽部分為9組，每組3個復(fù)孔，分別為待測孔、內(nèi)參對照孔和空白對照孔，以cDNA為模板，E-cadherin基因和β-actin基因為引物進行qRT-PCR的擴增。反應(yīng)總體系為20 μL：cDNA 1 μL、上下游引物各0.8 μL、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、無菌去離子水7.4 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)4次，根據(jù)每個樣品的循環(huán)定量值(Cq)，經(jīng)2-ΔΔCt法計算E-cadherin基因在牦牛不同繁殖時期輸卵管不同部位中的相對表達量。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列Table 1 Primer sequences of targeTGene and housekeepinGGene

1.4 E-cadherin蛋白表達檢測

將-80℃保存的卵泡期、黃體期和妊娠期牦牛輸卵管傘部、壺腹部和峽部的組織樣品低溫研磨成粉末，并稱取0.1 g并加入裂解液[1 mL高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(radio immunoprecipitation assay, RIPA)]+[10 μL苯甲基磺酰氟(phenylm methane sulfonyl fluoride, PMSF)]，渦旋后在冰上裂解2 h、4℃，1 500 r·min-1離心5 min后吸取上清，提取總蛋白于-80℃保存。將卵泡期、黃體期和妊娠期牦牛輸卵管傘部、壺腹部和峽部的蛋白樣品與4×蛋白上樣緩沖液按照3∶1的比例配置蛋白工作液，金屬浴變性(100℃，10 min)，冰上靜置5 min。制備好聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)并進行電泳分離；將依次按照濾紙、膠、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜、濾紙從下到上的順序?qū)⑵涔潭ㄓ谵D(zhuǎn)膜夾上，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h；一抗[E-cadherin(4A2)mouse mAb∶PBST=1∶1 000；Mo a beta-Actin∶PBST=1∶1 000]孵育在4℃環(huán)境中過夜，PBST清洗3次，每次5 min；二抗(Goat Anti-Mouse IgG/HRP∶PBST=1∶1 000)孵育2 h，PBST清洗5次，每次5 min；在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光液(electro-chemi-luminescence, ECL)進行條帶曝光顯影，試驗重復(fù)3次，并用ImageJ軟件掃描蛋白印跡條帶進行圖像分析，計算相對表達量。

1.5 免疫組織化學(xué)法對E-cadherin蛋白進行定位

取多聚甲醛中充分固定好的不同繁殖周期輸卵管傘部、壺腹部和峽部組織塊樣品，根據(jù)常規(guī)方法制作4 μm石蠟切片貼附于包被過的切片上，下行酒精脫蠟至水，蒸餾水清洗5 min，PBS浸泡5 min。將切片置于0.1 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液中抗原修復(fù)，高溫加熱8 min至沸騰后轉(zhuǎn)中高溫加熱12 min，待其冷卻至室溫。滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(3% H2O2溶液)于組織上進行阻斷，37℃烘箱中孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。滴加正常山羊血清工作液(SP試劑盒A液)于組織上進行封閉，室溫作用15 min。添加一抗[E-cadherin(4A2)mouse mAb∶PBS=1∶100]孵育，陰性對照組用PBS代替一抗工作液，在4℃環(huán)境中過夜，陽性反應(yīng)與陰性對照組分開清洗，PBS清洗3次，每次3 min。添加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(SP試劑盒B液)孵育，37℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。添加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(SP試劑盒C液)孵育，37℃烘箱孵育15 min，PBS清洗3次，每次3 min。DAB顯色液適度顯色，自來水沖洗10 min終止顯色，蒸餾水浸泡5 min。蘇木精復(fù)染2 min并通過鹽酸酒精分化10 s。上行酒精脫水透明，樹脂封片，待晾干用顯微鏡照相。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.0軟件對試驗所得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，分析不同繁殖周期輸卵管不同部位中E-cadherin基因及蛋白的表達差異，相對表達水平為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SE)表示，每組至少3個重復(fù)。P>0.05為差異不顯著，0.01≤P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 E-cadherin基因的表達情況

普通PCR試驗結(jié)果表明，E-cadherin基因和β-actin基因產(chǎn)物條帶單一并無二聚體，驗證了引物E-cadherin基因和β-actin基因的特異性良好(圖1)。通過對qRT-PCR的Cq值進行分析發(fā)現(xiàn)，在卵泡期和妊娠期，E-cadherin基因在輸卵管壺腹部的表達量最高，顯著高于傘部；而在黃體期，E-cadherin基因在輸卵管峽部的表達量最高，顯著高于傘部和壺腹部。在輸卵管傘部，E-cadherin基因在黃體期的表達量最高，顯著高于卵泡期和妊娠期；在輸卵管壺腹部，E-cadherin基因在妊娠期的表達量最高，顯著高于卵泡期和黃體期；在輸卵管峽部，E-cadherin基因在黃體期的表達量最高，顯著高于卵泡期和妊娠期(圖2)。

注：M：DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：卵泡期輸卵管傘部；2：卵泡期輸卵管壺腹部；3：卵泡期輸卵管峽部；4：黃體期輸卵管傘部； 5：黃體期輸卵管壺腹部；6：黃體期輸卵管峽部；7：妊娠期輸卵管傘部；8：妊娠期輸卵管壺腹部；9：妊娠期輸卵管峽部。Note: M: D2000 DNA marker. 1: Oviduct umbrella durinGThe follicular phase. 2: Oviduct ampulla durinGThe follicular phase. 3: Oviduct isthmus durinGThe follicular phase. 4: Oviduct umbrella durinGThe luteal phase. 5: Oviduct ampulla durinGThe luteal phase. 6: Oviduct isthmus durinGThe luteal phase. 7: Oviduct umbrella durinGThe pregnant phase. 8: Oviduct ampulla durinGThe pregnant phase. 9: Oviduct isthmus durinGThe pregnant phase.圖1 E-cadherin和β-actin基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results for E-cadherin and β-actin genes

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as following.圖2 牦牛E-cadherin基因在不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達差異Fig.2 Differential expression of E-cadherin gene in different parts of the oviduct at different reproduction cycles of yak

2.2 E-cadherin蛋白的表達情況

Western-blotting試驗分析結(jié)果顯示，E-cadherin蛋白在不同時期輸卵管的不同部位均有表達且存在差異(圖3)。在卵泡期和妊娠期，E-cadherin蛋白在輸卵管壺腹部的表達量最高，顯著高于傘部和峽部；在黃體期，E-cadherin蛋白在輸卵管峽部的表達量最高，顯著高于傘部和壺腹部。在輸卵管傘部，E-cadherin 蛋白在卵泡期的表達量最高，顯著高于黃體期和妊娠期；在輸卵管壺腹部，E-cadherin蛋白在妊娠期的表達量最高，顯著高于卵泡期和黃體期；在輸卵管峽部，E-cadherin蛋白在黃體期的表達量最高，顯著高于卵泡期和妊娠期(圖4)。

注：1：卵泡期輸卵管傘部；2：卵泡期輸卵管壺腹部；3：卵泡期輸卵管峽部；4：黃體期輸卵管傘部；5：黃體期輸卵管壺腹部；6：黃體期輸卵管峽部；7：妊娠期輸卵管傘部；8：妊娠期輸卵管壺腹 部；9：妊娠期輸卵管峽部。Note: 1: Oviduct umbrella durinGThe follicular phase. 2: Oviduct ampulla durinGThe follicular phase. 3: Oviduct isthmus durinGThe follicular phase. 4: Oviduct umbrella durinGThe luteal phase. 5: Oviduct ampulla durinGThe luteal phase. 6: Oviduct isthmus durinGThe luteal phase. 7: Oviduct umbrella durinGThe pregnant phase. 8: Oviduct ampulla durinGThe pregnant phase. 9: Oviduct isthmus durinGThe pregnant phase.圖3 E-cadherin和β-actin蛋白的免疫蛋白印跡條帶Fig.3 The Western-blotting bands of E-cadherin and β-actin proteins

2.3 E-cadherin蛋白的定位

免疫組織化學(xué)試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-cadherin在輸卵管中均有分布，在卵泡期、黃體期和妊娠期，E-cadherin主要在輸卵管傘部、壺腹部和峽部的纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞、基細(xì)胞、肌層和漿液腺中有表達(圖5-a～i)；陰性對照試驗未見棕褐色陽性表達(圖5-j～l)。

3 討論

圖4 牦牛E-cadherin蛋白在不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達差異Fig.4 Differential expression of E-cadherin protein in different parts of the oviduct at different reproduction cycles of yak

注：a：卵泡期輸卵管傘部；b：卵泡期輸卵管壺腹部；c：卵泡期輸卵管峽部；d：黃體期輸卵管傘部；e：黃體期輸卵管壺腹部；f：黃體期輸卵管峽部；g：妊娠期輸卵管傘部；h：妊娠期輸卵管壺腹部；i：妊娠期輸卵管峽部；j：輸卵管傘部陰性對照；k：輸卵管壺腹部陰性對照；l：輸卵管峽部陰性對照。LP：固有層；TM：肌層；EP：黏膜上皮；P：初級皺襞；S：次級皺襞；C：纖毛細(xì)胞。黑色五角星：分泌細(xì)胞；黑色 細(xì)箭頭：基細(xì)胞；黑色三角形：漿液腺。Note: a: Tubal umbrella durinGThe follicular phase. b: Tubal ampulla durinGThe follicular phase. c: Tubal isthmus durinGThe follicular phase. d: Tubal umbrella durinGThe luteal phase. e: Tubal ampulla durinGThe luteal phase. f: Tubal isthmus durinGThe luteal phase. g: Tubal umbrella durinGThe pregnant phase. h: Tubal ampulla durinGThe pregnant phase. i: Tubal isthmus durinGThe pregnant phase. j: Tubal umbrella negative control. k: Tubal ampulla negative control. l: Tubal isthmus negative control. LP: Lamina propria. TM: Muscular layer. EP: Mucosal epithelium. P: Primary wrinkles. S: Secondary wrinkles. C: Ciliated cell. Black five-pointed star: Secretory cell. Black thin arrow: Basal cell. Black triangle: Serous gland.圖5 牦牛E-cadherin蛋白在不同繁殖周期輸卵管不同部位中的免疫組織化學(xué)染色Fig.5 Immunohistochemical staining of E-cadherin protein in different parts of the oviduct at different reproductive cycles of yak

在細(xì)胞粘附分子超家族成員中，E-cadherin是鈣依賴性細(xì)胞間粘附相關(guān)的跨膜糖蛋白，在維持上皮結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長增殖和細(xì)胞間粘附等方面起著重要作用[25-26]。有研究表明，在人的精子、卵母細(xì)胞、卵丘細(xì)胞以及輸卵管上皮細(xì)胞中檢測到E-cadherin[27]。本研究發(fā)現(xiàn)其主要在牦牛輸卵管的纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞、基細(xì)胞、肌層和漿液腺中表達。研究結(jié)果顯示，E-cadherin主要參與多種鈣依賴嗜同性細(xì)胞之間粘附事件，銜接蛋白β-catenin可與E-cadherin胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，將粘附蛋白連接到細(xì)胞骨架上[28]，從而發(fā)揮信號傳遞和細(xì)胞穩(wěn)定的作用。本研究在牦牛輸卵管的相應(yīng)部位發(fā)現(xiàn)了E-cadherin的表達，這與在人體中的報道相一致[27]，由此可推測，E-cadherin在牦牛輸卵管中也發(fā)揮著重要的作用。

為了進一步探究E-cadherin在牦牛輸卵管中的表達情況，本試驗分別在卵泡期、黃體期和妊娠期檢測了E-cadherin基因及蛋白在輸卵管傘部、壺腹部及峽部的表達情況。結(jié)果顯示，在卵泡期，E-cadherin基因及蛋白在輸卵管壺腹部的表達量最高，峽部表達量最低。在輸卵管傘部，E-cadherin蛋白在卵泡期的表達量最高，在妊娠期的表達量最低。然而，E-cadherin基因在黃體期的表達量最高，妊娠期的表達量最低。有研究報道，基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的翻譯存在時空差異[29]，這可能是造成E-cadherin基因及蛋白存在表達差異的主要原因。有報道稱E-cadherin主要參與同型細(xì)胞與細(xì)胞間粘附進而完成細(xì)胞間的相互作用[30]。同時，在繁殖周期母體中，E-cadherin也會協(xié)同某些激素和細(xì)胞因子，使輸卵管微環(huán)境發(fā)生變化[31]。因此，卵泡期E-cadherin在輸卵管傘部表達高可能是因為卵母細(xì)胞被輸卵管傘部細(xì)胞的表面受體粘附并接收，從而通過傘部粘膜的擺動將卵子運輸至輸卵管中，在相關(guān)細(xì)胞因子的作用下，卵母細(xì)胞在輸卵管中成熟并與獲能精子相遇并融合。

黃體作為卵泡破裂后形成的臨時器官，可分泌大量孕酮以維持雌性動物正常的生殖機能。本研究發(fā)現(xiàn)在黃體期，E-cadherin基因及蛋白在輸卵管峽部的表達量最高，壺腹部表達量最低。同時對于輸卵管峽部來說，E-cadherin基因及蛋白在黃體期表達量最高，卵泡期表達量最低。精子在尾端峽部和子宮輸卵管連接部儲存且獲能啟動，并被準(zhǔn)確釋放到受精部位[32]，E-cadherin作為復(fù)雜膜蛋白的一部分，在精子獲能事件中發(fā)揮著重要作用。在精子通過女性生殖道的過程中，E-cadherin可確保精子與輸卵管上皮進行結(jié)合和釋放[33]。同時，E-cadherin還能夠誘導(dǎo)與輸卵管上皮細(xì)胞結(jié)合的精子中某些蛋白激酶的酪氨酸磷酸化及細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的增加，使其能夠被釋放并繼續(xù)轉(zhuǎn)運到壺腹部與卵子結(jié)合。這證明了E-cadherin在精卵相互作用過程參與粘附事件[34-35]。另外，有研究采用DECMA-1抗E-cadherin單克隆抗體后發(fā)現(xiàn)，精子與卵母細(xì)胞的相互作用明顯受損[36]。綜上可以推測E-cadherin參與了輸卵管峽部發(fā)揮精子儲存庫的功能，從而有助于精卵結(jié)合，但其輸卵管峽部精子“儲存器”的形成及精子釋放并與卵子結(jié)合的具體機制仍有待深入研究。

精卵在輸卵管壺腹部結(jié)合后被運送至子宮著床，動物進入妊娠期。在妊娠期，E-cadherin在輸卵管壺腹部的表達量最高，在輸卵管傘部的表達量最少。同時對于輸卵管壺腹部而言，E-cadherin基因及蛋白在妊娠期的表達量相對較高，在黃體期的表達量最少。在附植前的人胚胎表面可檢測到E-cadherin的表達，胚胎表面的E-cadherin能與子宮內(nèi)膜細(xì)胞表面的同類分子互為配體，形成細(xì)胞間分子連接，使胚胎能夠粘附于內(nèi)膜，為進一步植入提供前提條件[20]。子宮內(nèi)膜“植入窗”的形成，除了受卵巢激素控制外，胚胎在其中也有著主要作用，二者發(fā)育相互影響、相互調(diào)節(jié)以達到同步，同時具有容受性和粘附性，胚胎著床才能夠進行。胚胎上的E-cadherin可能影響內(nèi)膜上皮E-cadherin的表達，相互調(diào)節(jié)以達到理想的植入窗狀態(tài),最終目的是利于胚胎著床[37-38]。另外有數(shù)據(jù)也顯示在犬中，輸卵管細(xì)胞可支持胚胎通過關(guān)鍵的細(xì)胞分裂M期[39]。與單獨培養(yǎng)相比，犬胚胎與輸卵管組織或輸卵管細(xì)胞共培養(yǎng)可增強其早期發(fā)育。因此，本研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin在輸卵管壺腹部表達量高，推測其參與妊娠早期的胚胎發(fā)育與運輸過程，以待更好地完成整個繁殖周期的發(fā)展過程。

本研究發(fā)現(xiàn)，E-cadherin基因和蛋白在牦牛不同繁殖周期輸卵管不同部位中的表達存在顯著差異，推測E-cadherin在牦牛接收卵子、儲存精子、受精及早期胚胎發(fā)育方面可能發(fā)揮著重要作用。本研究為牦牛的繁殖性能研究提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

在牦牛不同繁殖周期中E-cadherin在輸卵管傘部、壺腹部和峽部中均有表達且存在表達差異，其主要在不同繁殖周期輸卵管傘部、壺腹部和峽部的纖毛細(xì)胞、分泌細(xì)胞、基細(xì)胞、肌層和漿液腺等中有分布。由此推測E-cadherin可能參與了輸卵管受精及早期胚胎發(fā)育等生殖過程。