雷娟利 岳智臣 陶 鵬 趙彥婷 李必元

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所, 浙江 杭州 310021)

大白菜菌核病是由核盤(pán)菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的真菌性病害，是危害大白菜的主要病害之一，在我國(guó)各地均有發(fā)生[1]。大白菜菌核病在大白菜各生育期及儲(chǔ)藏期均可為害，但尤其以種株開(kāi)花、抽薹、結(jié)莢期為害最為嚴(yán)重[2]。近年來(lái)，隨著保護(hù)地的發(fā)展，大白菜菌核病發(fā)生越來(lái)越普遍。

在作物病蟲(chóng)害防治方面，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中化學(xué)農(nóng)藥的過(guò)量使用不僅會(huì)增加生產(chǎn)成本，還會(huì)造成農(nóng)作物農(nóng)藥殘留，導(dǎo)致作物病蟲(chóng)害產(chǎn)生抗藥性，并對(duì)土壤、水體及生態(tài)環(huán)境造成污染。隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們生活水平的提高，對(duì)食品安全及環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng)，應(yīng)用高效、廣譜、安全、無(wú)毒的有益微生物進(jìn)行植物病蟲(chóng)害防治越來(lái)越受到重視[3-6]。土壤放射桿菌K84菌株是目前應(yīng)用最廣泛的一類(lèi)拮抗菌，能夠有效預(yù)防植物冠癭病[3]。

在分離大白菜菌核病菌的過(guò)程中，本研究前期篩選到一株核盤(pán)菌的拮抗菌DG1，通過(guò)菌落形態(tài)、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列鑒定其類(lèi)別，并研究其對(duì)大白菜菌核病菌的抑制作用，以期為大白菜菌核病及其他作物病害的生物防治提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

拮抗菌DG1在分離大白菜菌核病菌時(shí)得到，現(xiàn)保存于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為M2018236。大白菜菌核病菌(S.sclerotiorum)由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所大白菜甘藍(lán)研究室分離保藏。番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、番茄黑斑病菌(Alternariaalternate)和花椰菜黑斑病菌(A.alternate)分別由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所番茄辣椒育種研究室和花椰菜青花菜研究室提供。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA)制做方法：將馬鈴薯去皮，稱(chēng)取200 g切塊，加1 L水煮30 min后，四層紗布過(guò)濾，濾液加葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g攪拌均勻，加蒸餾水定容至1 000 mL，分裝后高溫滅菌待用；馬鈴薯葡萄糖(potato dextrose, PD)液體培養(yǎng)基制作方法同PDA固體培養(yǎng)基，但不添加瓊脂粉。

1.2 菌株DG1的形態(tài)觀察、生理生化指標(biāo)鑒定及16S rDNA擴(kuò)增

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中的方法對(duì)菌株DG1進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化指標(biāo)鑒定，按照常規(guī)細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行鑒定[7]。

拮抗菌DG1的16S rDNA擴(kuò)增采用菌種鑒定通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，拮抗菌DG1基因組DNA的提取采用上海生工的微生物基因組提取試劑盒,具體PCR擴(kuò)增步驟和體系參照雷娟利等[8]的方法。16S rRNA基因PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列，測(cè)定序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù),序列的相似性比對(duì)采用NCBI的Blast軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行比對(duì)，DG1的16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)采用Mega 5.1軟件構(gòu)建。

1.3 菌株DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定

DG1發(fā)酵液的制備：將菌株接種于含有10 mL PD液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中，于28℃、180 r·min-1恒溫?fù)u床培養(yǎng)2 d,然后將發(fā)酵液于4℃、10 000×g條件下離心10 min后收集上清液，上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾除菌后即為DG1發(fā)酵液。

DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的影響，共設(shè)3個(gè)處理：處理1為對(duì)照(CK)PD液體培養(yǎng)基300 μL；處理2為150 μL發(fā)酵液+150 μL PD液體培養(yǎng)基；處理3為300 μL發(fā)酵液。每處理設(shè)3次重復(fù)，分別均勻涂布于PDA培養(yǎng)基上，然后用5 mm的打孔器在大白菜菌核病菌的菌落邊緣打取菌餅，將其接種于已涂布好的PDA培養(yǎng)基平板中央，在28℃條件下培養(yǎng)72 h后，分別量取菌落直徑，計(jì)算抑制率：

抑制率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/

對(duì)照組菌落直徑×100%。

1.4 菌株DG1對(duì)幾種蔬菜病原真菌的抑制作用測(cè)定

在PDA平板中心位置分別接種番茄枯萎病菌、番茄黑斑病菌和花椰菜黑斑病菌菌絲塊，在離菌20 mm處用滅菌牙簽點(diǎn)接DG1菌株，置于28℃恒溫培養(yǎng)5 d后，調(diào)查抑菌帶大小，3次重復(fù)，每次重復(fù)3個(gè)培養(yǎng)皿。

1.5 菌株DG1揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用測(cè)定

參照宗英等[9]的方法，在活化后的大白菜菌核病菌邊緣用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，將菌餅接種在PDA培養(yǎng)基平板中間。將活化后的DG1在PDA培養(yǎng)基平板上劃線，然后將兩平板對(duì)扣，封口膜密封，28℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀察病原菌株的生長(zhǎng)情況并測(cè)量其直徑，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。以空白的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照組，按照公式計(jì)算抑制率:

抑制率=(對(duì)照組真菌菌落直徑-處理組真菌菌落

直徑)/對(duì)照組真菌菌落直徑×100%。

1.6 菌株DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌體外防治測(cè)定

取大小一致的大白菜葉片，以中脈為界，在葉片正/反面的左側(cè)用毛筆涂無(wú)菌PD液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，在葉片正/反面的右側(cè)用毛筆涂拮抗菌發(fā)酵液作為處理，分別接種活化后的大白菜菌核病菌菌絲塊，在溫度22～25℃、濕度85%以上條件下培養(yǎng)，接種后3～4 d統(tǒng)計(jì)病斑大小。按照公式計(jì)算防治效果：

防治效果=(對(duì)照組病斑直徑-處理組病斑直徑)/

對(duì)照組病斑直徑×100%。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)及分析均采用Excel 2007軟件完成，并選用單因素法進(jìn)行方差分析及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DG1的發(fā)現(xiàn)

在分離大白菜菌核病菌的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了一株對(duì)大白菜菌核病菌具有拮抗作用的拮抗菌，并將其命名為DG1。進(jìn)一步平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)證實(shí)了菌株DG1對(duì)大白菜菌核病菌的拮抗作用(圖1)。

注：A1、A2為DG1；B1、B2為對(duì)照。Note: A1,A2 for DG1. B1,B2 for control.圖1 平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of plate antagonism experiment

2.2 菌株DG1的鑒定結(jié)果

參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[7]的方法，對(duì)菌株DG1進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定。結(jié)果表明，菌株DG1為革蘭氏陽(yáng)性需氧菌，菌體呈桿狀，大小約為(0.5～0.7)μm×(2.0～3.0) μm，菌落形態(tài)為圓形、微凸、邊緣整齊，菌落顏色為奶白色。菌株DG1生理生化特征鑒定共進(jìn)行了20項(xiàng)酶活、碳源同化指標(biāo)檢測(cè)(結(jié)果見(jiàn)表1)，49項(xiàng)利用碳源產(chǎn)酸指標(biāo)檢測(cè)(結(jié)果見(jiàn)表2)。在20項(xiàng)酶活、碳源同化指標(biāo)中共有8項(xiàng)呈陽(yáng)性，4項(xiàng)呈弱陽(yáng)性，8項(xiàng)呈陰性；在49項(xiàng)利用碳源產(chǎn)酸指標(biāo)中有22項(xiàng)呈陽(yáng)性，2項(xiàng)呈弱陽(yáng)性，25項(xiàng)呈陰性?；跍y(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)，通過(guò)API鑒定系統(tǒng)將菌株DG1初步鑒定為克里布所類(lèi)芽孢桿菌(Paenibacilluskribbensis)[10]。

同時(shí)，將擴(kuò)增出的16S rDNA條帶進(jìn)行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank(序列登記號(hào): MH351014)。采用BLAST進(jìn)行序列同源性比較，菌株DG1基于16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果以Thermobacillusxylanilyticus(AJ005795.1)為外枝構(gòu)建的Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖4。根據(jù)同種細(xì)菌16S rDNA同源性不低于98.65%的標(biāo)準(zhǔn)[11]，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，菌株DG1最終被鑒定為克里布所類(lèi)芽孢桿菌(P.kribbensis)。

圖2 菌株DG1顯微鏡(1 000×)觀察照片F(xiàn)ig.2 Microscopic observation of strain DG1 (1 000×)

圖3 菌株DG1的平板菌落形態(tài)Fig.3 Plate colony morphology of strain DG1

表1 菌株DG1酶活、碳源同化特性Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain DG1-enzyme activity, carbon source assimilation

表2 菌株DG1利用碳源產(chǎn)酸生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain DG1 usinGCarbon source to produce acid

2.3 DG1對(duì)4種不同蔬菜病原真菌的抑制作用

由圖5可知，菌株DG1對(duì)4種蔬菜病原真菌均具有不同程度的抑制作用，其中對(duì)大白菜菌核病菌的抑制用最強(qiáng)，抑菌帶寬度達(dá)到9.5 mm；其次為花椰菜黑斑病菌和番茄黑斑病菌，抑菌帶寬度分別為9.3和7.0 mm；抑制作用最弱的是番茄枯萎病菌，抑菌寬帶僅為3 mm。

2.4 菌株DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表3可知，菌株DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，且抑制作用隨發(fā)酵液濃度的增加而增加。每個(gè)培養(yǎng)皿添加150 μL發(fā)酵液時(shí)，抑制率為19.4%，當(dāng)每個(gè)培養(yǎng)皿加300 μL發(fā)酵液時(shí)，抑制率增加到42.9%。

表3 菌株DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Table 3 Effect of DG1 fermentation broth on mycelia growth of S. sclerotiorum

圖4 菌株DG1基于16S rDNA基因序列比對(duì)結(jié)果構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of DG1 based on the sequence alignment of 16S rDNAGene

2.5 DG1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)證實(shí)菌株DG1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)大白菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制作用，抑制率為49.7%，抑制效果如圖6。

2.6 DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病體外預(yù)防效果

經(jīng)過(guò)3次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是接種葉正面或背面，拮抗菌DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病菌體外接種均有顯著的預(yù)防效果，平均防治效率可達(dá)75%以上(表4)，DG1發(fā)酵液對(duì)大白菜菌核病體外預(yù)防效果見(jiàn)圖7。

3 討論

類(lèi)芽孢桿菌屬(PaenibacillusAsh,Priest & Collin,1994)最早歸類(lèi)于芽孢桿菌屬，后從中分離出來(lái)。除具有芽孢桿菌屬的特征外，類(lèi)芽孢桿菌屬還具有以下

表4 DG1發(fā)酵液的體外接種預(yù)防效果Table 4 Prevention effect of detached leaf inoculation by DG1 fermentation broth

注：A：番茄枯萎病菌；B：番茄黑斑病菌； C：花椰菜黑斑病菌；D：大白菜菌核病菌。Note: A:F.oxysporum of tomato. B: A.alternate of tomato. C: A.alternate of cauliflower. D: S.sclerotiorum of cabbage.圖5 菌株DG1對(duì)4種蔬菜病原真菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of four vegetable pathogenic fungus by strain DG1

注：A：對(duì)照; B為處理。Note:A: Control. B: Treatment.圖6 菌株DG1產(chǎn)生的揮性物質(zhì)對(duì)大白菜菌 核病菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effect of volatile substances produced by strain DG1 on mycelial growth of S. sclerotiorum

注：A： 正面；B： 背面；葉片左邊均為對(duì)照;葉片右邊均為處理。Note: A: Front. B: Back. Left side of two leaves for control. Right side of two leaves for treatment.圖7 體外接種預(yù)防效果Fig.7 Prevention effect of detached leaf inoculation

特征：細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性、陰性或可變，以周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。類(lèi)芽孢桿菌屬細(xì)菌可在多種環(huán)境中存在，且與人類(lèi)、動(dòng)物、植物和環(huán)境的關(guān)系密切[12-13]。其中大多數(shù)類(lèi)芽孢桿菌屬細(xì)菌存在于土壤中，通常在根際。這些根際細(xì)菌能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，作為根際促生菌用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[14-17]。許多類(lèi)芽孢桿菌屬細(xì)菌可產(chǎn)生性質(zhì)比較穩(wěn)定的多肽類(lèi)抗菌物質(zhì)[18]，具有良好的拮抗植物病原真菌活性，可用于多種植物病害的生物防治[19-23]。因此，類(lèi)芽孢桿菌屬細(xì)菌是一類(lèi)極具開(kāi)發(fā)前景和應(yīng)用價(jià)值的生防細(xì)菌[24-25]。

申順善等[26]從化香根際土壤中分離得到的多粘類(lèi)芽孢桿菌(P.polymyxa)HK18-8，果實(shí)體外接種試驗(yàn)表明，其對(duì)辣椒炭疽病的防治效果可達(dá)88%以上。吉沐祥等[27]篩選一株多黏類(lèi)芽孢桿菌JX-13，其對(duì)草莓枯萎病的防治效果達(dá)96%。Xu等[28]研究發(fā)現(xiàn)多粘類(lèi)芽孢桿菌SC09-21可有效防治辣椒疫病并促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)。Zhang等[29]篩選的多粘類(lèi)芽孢桿菌ShX301，在溫室防治棉花黃萎病試驗(yàn)中可降低棉花黃萎病的發(fā)病率和嚴(yán)重程度，并對(duì)棉花生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。本研究分離的拮抗菌DG1，經(jīng)鑒定為克里布所類(lèi)芽孢桿菌(P.kribbensis)，為類(lèi)芽孢桿菌屬的一種。研究發(fā)現(xiàn)DG1是一種廣譜性的拮抗菌，其對(duì)多種植物病原菌(大白菜菌核病菌、花椰菜黑斑病菌、番茄黑斑病菌等)具有拮抗作用，具有作為生防菌開(kāi)發(fā)的前景和應(yīng)用價(jià)值。今后工作應(yīng)從拮抗菌DG1在蔬菜根際的定殖能力，以及拮抗菌DG1對(duì)蔬菜生長(zhǎng)的影響兩方面開(kāi)展。

在培養(yǎng)DG1的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，DG1可產(chǎn)生氣體，查閱相關(guān)文獻(xiàn)有多種芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具有抑菌活性。宗英等[9]研究發(fā)現(xiàn)一株貝萊斯芽孢桿菌JS25R可產(chǎn)生36種揮發(fā)性物質(zhì)，并可抑制禾谷鐮刀菌菌絲的生長(zhǎng)。李寶慶等[30]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BAB-1至少可產(chǎn)生17種物質(zhì)，并能夠抑制番茄灰霉菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)對(duì)拮抗菌DG1產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體的抑菌性進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)DG1產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體具有抑菌活性，可顯著抑制大白菜菌核病菌的生長(zhǎng)，但其產(chǎn)生揮發(fā)性氣體的成份還需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

4 結(jié)論

本研究篩選出一株對(duì)大白菜菌核病菌具有拮抗作用的菌株DG1，經(jīng)形態(tài)觀察、生理生化鑒定及16S rDNA測(cè)序鑒定為克里布所類(lèi)芽孢桿菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DG1是一種廣譜性的拮抗菌，對(duì)多種植物病原真菌有抑制作用，其發(fā)酵液與揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)植物病原菌的生長(zhǎng)均有抑制作用，可以作為綠色生產(chǎn)中防治植物病害的一種生防菌。