葉水烽 樓 玨 高寧寧 楊 鋅 鄧接樓

(1 上饒師范學院生命科學學院，江西 上饒 334001；2 溫州科技職業(yè)學院/溫州市農(nóng)業(yè)科學研究院 浙南作物育種重點實驗室，浙江 溫州 325006；3 上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心，上海 201106)

水稻(Oryzasativa)是我國最主要的糧食作物之一，對保障我國糧食安全發(fā)揮著重大作用。在生長過程中，水稻常會受到蟲害的侵襲。其中，危害水稻的鱗翅目害蟲主要有二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟。據(jù)報道，僅二化螟每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成高達70億元的經(jīng)濟損失[1]。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對螟蟲的防治主要依靠化學殺蟲劑。殺蟲劑雖然防治了蟲害，但不可避免地增加了水稻生產(chǎn)成本，還造成了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題，長此以往，將對人類居住環(huán)境構(gòu)成重大威脅。因此，培育抗蟲品種是當務之急。然而，目前在水稻中尚未發(fā)現(xiàn)有效的抗螟蟲的種質(zhì)資源，無法通過傳統(tǒng)的育種技術(shù)來解決抗性問題[2]。Bt基因是來源于蘇云金芽孢桿菌的一種殺蟲基因，其表達的蛋白產(chǎn)物可特異性毒殺不同的害蟲，并且對人畜和環(huán)境無害。因此，應用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將Bt基因轉(zhuǎn)入水稻，培育抗蟲品種是目前最好的方法和選擇。

1996年，Wünn等[3]報道了首例轉(zhuǎn)Bt基因水稻，三年后，科學家們獲得了第一例雙價的Bt(cry1Ac+cry2A)水稻[4]。2000年，轉(zhuǎn)Bt基因水稻的田間試驗結(jié)果面世[5]。截至目前，已經(jīng)有大量Bt轉(zhuǎn)基因水稻的報道[6]，防治鱗翅目害蟲使用較多的Bt基因主要有cry1Ab[7]、cry1Ac[8]、cry1Ab/Ac[5]、cry2AX1[9]，防治鞘翅目害蟲的基因主要是cry3A[10]、cry30Fa1[11]。華中農(nóng)業(yè)大學林擁軍教授課題組通過密碼子優(yōu)化，獲得了cry2A*[12]、cry1C*[13-15]等新型人工合成Bt基因，創(chuàng)制的轉(zhuǎn)基因植株對二化螟、三化螟和稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲的抗蟲效率均不低于95%。

近十多年來，以華中農(nóng)大華恢1號(TT51)、T1C-19、T2A-1三個成熟轉(zhuǎn)基因水稻材料為Bt基因供體，通過雜交、回交并結(jié)合分子標記輔助選擇(marker-assisted selection，MAS)技術(shù)，利用PCR鑒定Bt基因或采用膠體金試紙對Bt蛋白進行檢測，我國科學家先后選育出Bt5198[16]、Bt秀水134[17]、云抗蟲稻1號、云抗蟲稻2號、云抗蟲稻3號等[18]抗蟲水稻新材料。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，水稻除了遭受蟲害侵襲，還容易受到干旱脅迫[19]。節(jié)水抗旱稻作為新栽培稻品種類型[20-21]，是在水稻科技進步的基礎(chǔ)上，引入旱稻的節(jié)水抗旱特性而育成的新品種，對發(fā)展節(jié)水型農(nóng)業(yè)、緩解我國水資源危機具有重要意義[22-23]。華恢1號(TT51)是華中農(nóng)業(yè)大學水稻團隊研發(fā)的轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac基因抗蟲水稻，轉(zhuǎn)cry1Ab/Ac明恢63及其所配雜種Bt汕優(yōu)63表現(xiàn)出了極高的抗蟲性，并先后在2009年和2014年兩次獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒發(fā)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(生產(chǎn)應用)[24]。本研究以華恢1號(TT51)為cry1Ab/Ac基因供體，與節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3號雜交，經(jīng)過4次回交，5次自交，通過農(nóng)藝性狀考察和田間自然感蟲鑒定，獲得高抗螟蟲的新恢復系旱恢3T，以期為后續(xù)雜交轉(zhuǎn)育培育抗蟲抗旱新品種奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

cry1Ab/Ac基因供體材料——華恢1號(TT51)水稻品種，由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室林擁軍教授提供；節(jié)水抗旱稻恢復系品種旱恢3號、節(jié)水抗旱稻不育系品種滬旱5A，由上海市農(nóng)業(yè)生物基因中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 旱恢3T的選育 以華恢1號(TT51)為cry1Ab/Ac基因供體，以節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3號為母本。在水稻抽穗開花期將母本穎花去雄，然后取TT51植株的花粉進行授粉，套袋至成熟收獲。在每一代取農(nóng)藝性狀貼近旱恢3號的植株進行取樣做Cry1Ab/Ac蛋白檢測，選取陽性植株進行回交，4代后進行自交純合，自交5代后將獲得純合抗性家系命名為旱恢3T。具體選育流程見圖1：

圖1 旱恢3T恢復系的選育流程Fig.1 Breeding restore line of Hanhui 3T

1.2.2 Cry1Ab/Ac蛋白的定性和定量檢測 在轉(zhuǎn)育過程中，取分蘗期新鮮葉片，加緩沖液碾磨出汁，取500 μL置于1.5 mL離心管，將Cry1Ab/Ac膠體金試紙條插入液體中，3～5 min后進行結(jié)果讀取，有質(zhì)控線和檢測線雙條線即為陽性植株。Bt蛋白的定量測定采用美國EnvironLogix公司的ELISA檢測試劑盒(QualiplateTMkit for Cry1Ab/Cry1Ac)。樣品的制備、酶聯(lián)免疫反應及OD值的測定，均嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.2.3 農(nóng)藝性狀考察 常規(guī)大田水肥、打藥(防治螟蟲)管理，旱恢3T和旱恢3號在每個小區(qū)種植6行，每行8株，共48個單株，3個重復，每個重復隨機取10個單株，對株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重及單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀進行考察。

1.2.4 田間自然感蟲條件下的抗蟲性鑒定 在海南省陵水縣光坡鎮(zhèn)上海市農(nóng)業(yè)科學院轉(zhuǎn)基因基地內(nèi)，對旱恢3T、旱恢3號、滬旱5A/旱恢3號、滬旱5A/旱恢3T進行常規(guī)水肥管理，但不防治螟蟲，觀察植株的卷葉和白穗情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用t測驗法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交選育過程的Bt蛋白定性檢測

采用膠體金試紙法，快速、直接對雜交后代植株進行Cry1Ab/Ac蛋白檢測，陰性植株只顯示一條質(zhì)控線，陽性植株同時顯示質(zhì)控線和檢測線(圖2)，每一代保留陽性植株進行回交及自交。

2.2 旱恢3T的Cry1Ab/Ac蛋白定量測定

在分蘗初期采用ELISA試劑盒，以父本TT51為對照，對旱恢3T的Cry1Ab/Ac蛋白進行測定。結(jié)果顯示(圖3)，在分蘗初期時，旱恢3T中葉片和莖稈中的Cry1Ab/Ac蛋白含量分別為16.54 μg·g-1FW和3.08 μg·g-1FW，TT51葉片和莖稈中的Cry1Ab/Ac蛋白含量為17.30 μg·g-1FW和3.53 μg·g-1FW，表明cry1Ab/Ac基因成功轉(zhuǎn)入旱恢3號并正常表達，葉片中的表達量相對父本有所降低，具有顯著差異，莖稈中的Bt蛋白表達量與父本無顯著差異。

2.3 常規(guī)打藥條件下的旱恢3T和母本旱恢3號的農(nóng)藝性狀比較

在常規(guī)打藥條件下，旱恢3T和旱恢3號生育期沒有改變，且在株高、單株有效穗數(shù)、穗長、每穗粒數(shù)、結(jié)實率、千粒重及單株產(chǎn)量都無顯著差異(P>0.05，表1)，表明Bt蛋白的轉(zhuǎn)入對旱恢3號的農(nóng)藝性狀無影響。

表1 旱恢3T和旱恢3號的主要農(nóng)藝性狀Table 1 Agronomic traits of Hanhui 3T and Hanhui No.3

注：左為陰性植株，只顯示質(zhì)控線；右為陽性植株， 同時顯示質(zhì)控線和檢測線。Note: Left: Only one quality control line in negative plants. Right: Both quality control line and detection line in positive plants.圖2 水稻植株Cry1Ab/Ac蛋白的陽性檢測Fig.2 Positive detection of Cry1Ab/Ac protein in rice plant

注：*表示在P<0.05水平差異顯著。Note: * indicates significant difference at 0.05 level.圖3 旱恢3T植株和父本TT51植株葉片和莖稈的 Cry1Ab/Ac蛋白含量測定結(jié)果Fig.3 Determination of Cry1Ab/AC protein content in leaves and stems in Hanhui 3T plants and TT51 plants

2.4 田間自然感蟲鑒定

在保證常規(guī)水肥管理，全生育期不打藥的條件下，旱恢3T表現(xiàn)高抗旱稻縱卷葉螟，抽穗期前沒有卷葉，成熟期未見白穗；對照旱恢3號在抽穗期前則有明顯的卷葉螟為害癥狀，葉片卷成筒狀，內(nèi)有白絲及長短不一的條狀白斑，在成熟期41.5%的植株有白穗出現(xiàn)(圖4)。此外，在相同的管理條件下，以滬旱5A為母本，分別以旱恢3T和旱恢3號作父本，制得的雜種在田間抗性表現(xiàn)與父本一致，即滬旱5A/旱恢3號受卷葉螟危害，滬旱5A/旱恢3T高抗卷葉螟(圖5)。

3 討論

為實現(xiàn)我國農(nóng)業(yè)綠色和可持續(xù)發(fā)展的要求，以既有水稻高產(chǎn)特性，又有旱稻節(jié)水抗旱特性的節(jié)水抗旱稻品種為基礎(chǔ)材料，進行抗蟲性狀改良，培育“少打農(nóng)藥、少施化肥、節(jié)水抗旱、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)”的綠色超級稻，具有重要意義[25-27]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)能抗鱗翅目害蟲的水稻種質(zhì)資源，傳統(tǒng)雜交育種很難培育出抗螟蟲水稻。因此，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將蘇云金芽孢桿菌的Bt基因轉(zhuǎn)入水稻，培育抗螟蟲的水稻材料，是最可行的途徑。我國科學家已經(jīng)獲得了大量轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲水稻材料[28-30]，華恢1號(TT51)兩次獲得農(nóng)業(yè)農(nóng)村部頒布的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(生產(chǎn)應用)[24]，是理想的高抗螟蟲的Bt基因供體材料。

圖5 雜交種在田間的抗蟲性表現(xiàn)Fig.5 Insect resistance of hybrids under field

在材料轉(zhuǎn)育過程中，高效鑒定出目的基因非常重要。一般來說，PCR技術(shù)使用最廣，但偶爾會出現(xiàn)假陽性、假陰性結(jié)果。本研究采用商業(yè)化Cry1Ab/Ac膠體金檢測試紙條定性檢測目標蛋白，在田間缺少必要的實驗儀器時，可簡單、快速地進行樣品鑒定，而且Bt蛋白為外源蛋白，不受水稻本體蛋白污染，準確率高。同時，在回交過程中，挑選與輪回親本長勢相似的單株進行試驗，可加快背景基因的純合。試紙條檢測結(jié)果為陽性的植株在田間不發(fā)生卷葉。

將外源基因?qū)胨局?，其是否表達及能否穩(wěn)定遺傳是值得關(guān)注的問題。本研究利用旱恢3T為恢復系與不育系滬旱5A進行配組，獲得的滬旱5A/旱恢3T雜交種表現(xiàn)高抗螟蟲，顯示cry1Ab/Ac基因能夠穩(wěn)定遺傳并高效表達，與前人的研究結(jié)果一致[31]。

4 結(jié)論

本研究以華恢1號(TT51)為供體，對節(jié)水抗旱稻恢復系旱恢3號進行改良，獲得對稻縱卷葉螟具有高度抗性的水稻恢復系旱恢3T，其基本農(nóng)藝性狀與輪回親本旱恢3號無顯著差異，可直接用于抗蟲雜交稻組合的配制，為水稻抗性育種奠定了材料基礎(chǔ)。利用雜交選育改良優(yōu)良親本，不僅要提高改良材料的抗性，而且要保持輪回親本優(yōu)良的農(nóng)藝性狀。后期可利用全基因組芯片進行背景選擇，提高準確度和精確度，加速水稻品種改良。