趙晨穎，李 曉，梁 淼， 侯 佩

（鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，河南 鄭州 450000）

0 引言

葉 綠 素 酶 （Chlorophyllase， E.C.3.1.1.14， 簡 稱Chlase） 水解葉綠素 （Chlorophyll，Chl） 產生脫植基葉 綠 素 （Chlorophyllide， 簡 稱 Chlide） 和 葉 綠 醇（Phytol）[1]。葉綠素酶是一種固有的膜蛋白，存在于葉綠體光合膜中[2]，該酶在胞質核糖體上合成，并借助葉綠體核糖體上合成的蛋白質因子進入葉綠體膜中，但從 Terpstra 的著作中推斷出葉綠素酶主要存在于葉綠體的小膜中，而在大膜中并不活躍[3]。另有研究發(fā)現，葉綠素酶存在于類囊體膜中[4]。Chen M C M等人[5]比較不同物種中已知的葉綠素酶序列，發(fā)現在這些序列中脂酶基序和催化三聯(lián)體都高度保守，尤其是編碼 N 末端轉運肽結構域的序列，可能在其生理功能和細胞定位中起作用。Chlase 在細胞中的定位不同，源于多基因家族、不同導入途徑、不同表達模式及翻譯后修飾等不同角度的研究[6]。

Chlase 被認為具有糖蛋白的作用，在萊茵衣藻中被證明，其能促進內質網 （Endoplasmic reticulum，ER） 發(fā)生糖基化[7]。擬南芥中的 CLH1 還被認為是一種植物損傷控制酶，可調節(jié)不同植物防御途徑之間的平衡[8]。另外，Chlase 在 Chl 體內平衡中起著重要的作用，不僅在衰老的葉片和成熟果實中，而且在正常綠色葉片和發(fā)育中的果實中都檢測到了 Chlase的活性[9]。Kariola T 等人[8]已報道了 Chlase 在 Chl 降解和細胞損傷中的生物學功能，提出了葉綠素酶在保護植物組織免受氧化損傷和調節(jié)不同植物防御途徑激活中的作用。除上述作用外，Chlase 水解 Chl 產生的 Chlide 及其 Chlide 衍生物也被證明具有抗病毒作用[10]，而且，Chou Y L 等人[7]舉例介紹了它們在體外的抗氧化、抗誘變和抗癌作用。因此，葉綠素酶不僅具有生物學研究價值，而且具有潛在的工業(yè)和農業(yè)應用性[11]。

目前，國內外對葉綠素酶的研究主要集中在模式植物擬南芥上，而對煙草屬植物葉綠素酶的探索較少，培育煙草優(yōu)質品種有賴于挖掘煙草祖先種及野生種中的葉綠素酶基因?；诖耍瑥臄祿熘刑崛煵菁白嫦确N、重要野生種中的 CLH1 基因及其編碼蛋白序列，并通過生物信息學分析對其功能、基因編輯位點等進行預測，以期為煙草品質育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

研究對象包括普通煙草 （Nicotianatabacum） 祖先 種 林 煙 草 （Nicotianasylvestris） 和 絨 毛 狀 煙 草（Nicotianatomentosiformis）、 野 生 煙 草 漸 狹 葉 煙 草（Nicotianaattenuata） 和 本 氏 煙 草 （Nicotianabenthamiana）、白肋煙品種 TN90、烤煙品種 K326 和香料煙品種 Basma Xanthi （簡稱 BX） 的基因組 DNA、mRNA 和氨基酸序列。

1.2 方法

從擬 南 芥 TAIR 數據庫 （https://www.arabidopsis.org/） 中獲得擬南芥 CLH1 基因及其編碼蛋白，并以此為探針，通過同源搜索，從 NCBI 數據庫 （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）、漸狹葉煙草 NaDH 數據 庫 （http://nadh.ice.mpg.de/NaDH/）、 SGN 數 據 庫（https://solgenomics.net/） 提取煙草祖先種、野生種及普通煙草中的 CLH1 基因及其編碼蛋白序列。利用ProtParam （https://web.expasy.org/protparam/） 分 析 蛋白的理化特性；利用 DANMAN 軟件對 CLH1 編碼蛋白 序 列 進 行 分 析 ； 利 用 SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/） 對 結 構 域、互 作 蛋 白 及 功 能 進 行預測；利用 TMHMMM （http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 對蛋白跨膜結構進行預測； 利 用 MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme） 在線預測煙草 屬 植 物 CLH1 蛋 白 的 保 守 基 序 ； 運 用 SWISSMODE （https : //swissmodel. expasy. org/interactive） 對CLH1 蛋 白 的 三 級 結 構 進 行 建 模 ； 利 用 PlantCare（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/ht ml/） 預測 NsylCLH1 基因啟動子區(qū)的順式作用元件；最 后 ， 利 用 CRISPRdirect （https://crispr.dbcls.jp） 預測 NattCLH1 的基因編輯位點。

2 結果與分析

2.1 煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白的理化特性

以擬南芥 CLH1 蛋白為探針，通過同源搜索，根據得分、對比覆蓋率及與 AtCLH1 序列一致程度進行篩選，得到林煙草 （Nicotianasylvestris）、絨毛狀煙草 （Nicotianatomentosiformis）、漸狹葉煙草 （Nic-otianaattenuata）、本氏煙草 （Nicotianabenthamiana）、白肋煙 TN90、烤煙 K326 和香料煙 BX 的 CLH1 蛋白序列。利用 ExPASy - ProtParam 在線工具對栽培煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白進行理化特性分析。結果表明，不同煙草屬物種和不同栽培煙草類型 （共 7 種） 分子量范圍為 27-40 kD，氨基酸數在250～370 個，除香料煙 CLH1 蛋白 （BXCLH1） 和本氏煙 CLH1 （NbenCLH1） 蛋白的分子量和氨基酸數與擬南芥稍有差距，其他均與擬南芥相近；煙草屬植物 CLH1 的 pI 值范圍為 5.94～9.33，高于擬南芥 pI值；煙草及擬南芥 CLH1 蛋白的半衰期均為 30 h；不穩(wěn)定指數為 30.59～50.59，其中林煙草 CLH1 蛋白（NsylCLH1） 和 TN90CLH1 蛋白 （TN90CLH1） 小于40，為穩(wěn)定性蛋白，其他煙草屬植物為不穩(wěn)定性蛋白。

栽培煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白的特征參數見表 1。

表1 栽培煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白的特征參數

2.2 煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 氨基酸序列分析

將煙草屬植物 CLH1 編碼蛋白的氨基酸序列進行比對 （圖 1）。結果顯示，林煙草 NsylCLH1、絨毛狀煙草 NtomCLH1、本氏煙草 NbenCLH1、漸狹葉煙草NattCLH1、 白 肋 煙 TN90CLH1、 烤 煙 K326CLH1 和香料煙 BXCLH1 的一致性為 71.54%，表明其在功能上可能存在差異；其中，TN90CLH1 和 NsyCLH1 序列比對結果完全一致，這也證明了作為白肋煙的母本祖先種林煙草與白肋煙 TN90 的親緣關系。

多序列比對見圖 1。

圖1 多序列比對

2.3 煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白的保守基序及結構域分析

利用 MEME 對煙草 CLH1 蛋白序列的保守基序進行在線分析 （圖 2），發(fā)現除香料煙 CLH1 蛋白中不存在 Motif1，Motif1、Motif2 和 Motif3 在幾種煙草CLH1 蛋白中都存在。利用 SMART 對煙草 CLH1 蛋白的功能域進行在線分析，結果顯示幾種煙草 CLH1蛋白均具有葉綠素酶和葉綠素酶 2 結構域。其中，只有林煙草 CLH1 和 TN90CLH1 的蛋白存在跨膜結構，這與 TMHMM 對煙草 CLH1 蛋白跨膜結構的預測一致 （圖 3）。

保守基序分析見圖 2，栽培煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白的功能域分析見表 2，NsylCLH1和 TN90CLH1 蛋白的跨膜結構域分析見圖 3。

圖3 NsylCLH1 和 TN90CLH1 蛋白的跨膜結構域分析

表2 栽培煙草及其祖先種、野生種中 CLH1 蛋白的功能域分析

圖2 保守基序分析

2.4 CLH1 蛋白的三級結構預測

利用 SWISS-MODEL，對煙草 CLH1 蛋白進行三級結構建模?；谀０?5xh3.1.A 對 NsylCLH1 和TN90CLH1 進行建模；基于模板 5lul.1.A 對 Ntom CLH1 進行建模；基于模板對 NattCLH1 進行建模；基 于 模 板 對 NbenCLH1 進 行 建 模； 基 于 模 板 對K326CLH1 進行建模；基于模板對 BXCLH1 進行建模。

煙草屬植物 CLH1 蛋白的三級結構見圖 4。

圖4 煙草屬植物 CLH1 蛋白的三級結構

2.5 啟動子順式作用元件預測

從 NCBI 數 據 庫 中 提 取 NsylCLH1 基 因 上 游 的2000 bp 的片段，運用 PlantCare 對啟動子順式作用元件進行了預測 （表 3），對結果進行分析，發(fā)現NsylCLH1 基因啟動子中的順式作用元件主要包括5 類：①與基因表達等相關的組成型元件；②與脫落酸 （ABA）、茉莉酸甲酯 （MeJA）、赤霉素 （GA） 和水楊酸 （SA） 等激素應答相關的元件；③與光響應相關的元件；④與干旱、鹽分等逆境脅迫相關的元件；⑤與抗病性相關的元件。

NsylCLH1 啟動子的順式作用元件預測結果見表 3。

表3 NsylCLH1 啟動子的順式作用元件預測結果

2.6 基因編輯位點分析

運用 CRISPR direct 在線網站進行靶標設計，以NGG 為 PAM 序列，以 NtomCLH1 為例，設計該基因的靶位點。從設計結果中選擇了 GC 含量適中，脫靶率最低的 2 個位點；2 個靶位點均位于正義鏈 （+），12 bp 種子序列和 PAM 的搜索項為 1，說明靶位點在整個基因組范圍內只有 1 個，20 bp 全長序列和 PAM匹配項為 0，說明該序列可能跨越外顯子 - 外顯子連接，脫靶概率較高。

CRISPR/Cas9 基因編輯靶位點見表 4，靶位點特異性圖解見圖 5。

圖 5 靶位點特異性圖解

表4 CRISPR/Cas9 基因編輯靶位點

3 討論與結論

葉綠素酶同屬于酯酶 / 脂肪酶超家族和 α/β 水解酶家族，對多種植物的研究表明，其蛋白結構的作用不僅體現在光和逆境脅迫中，而且對植物激素信號轉導具有重要作用[12]。據報道，在擬南芥中，白光照射下 AtCLH1 和 AtCLH2 基因的產物會急劇增加[13]。將匍匐剪股穎 （AgrostisstoloniferaL.） 暴露于熱脅迫溫 度 下 35 d， 響 應 熱 脅 迫 后 ， 其 葉 綠 素 酶 活 性 增加[14]。在蜜柑 （Citrusunshiu） 中，乙烯能夠增強葉綠素酶活性，從而加速葉綠素的降解[15]。在乙烯處理過的柑橘果皮中，赤霉素 （gibberellin A3，GA3） 和芐基腺嘌呤 （benzyladenine，BA） 抵消了部分乙烯誘導的 Chlase 活性的增加。將茉莉酸甲酯 （Methyl jas monate，MeJA） 作用于擬南芥植物時，CLH 基因的表 達 量 達到最 高[4]。 此 外 ， 研 究表 明， 葉綠 素酶 的表達與銀杏葉片衰老或果實成熟過程均無關[9]。

利用擬南芥 CLH1 基因及其編碼蛋白序列，獲取了煙草祖先種、近緣野生種及 3 種不同煙草類型的CLH1 基因及其編碼蛋白序列，并對其進行了預測和分析。結果表明，它們在理化特性上存在差異，主要 體現在香料煙 CLH1 （BXCLH1） 和本氏煙 CLH1（NbenCLH1） 的分子量和氨基酸數與其他 5 種有差距；其次，林煙草 CLH1 （NsylCLH1） 和 TN90CLH1（TN90CLH1） 的穩(wěn)定性與其他 5 種不同。氨基酸序列分析表明這些序列高度相似，其蛋白結構包含了 3 個相同的保守基序。NsylCLH1 基因啟動子的順式作用元件包括抗病性作用元件，也包含干旱和鹽分等作用元件，表明該基因的表達可能受到病菌和逆境脅迫的誘導；此外，還含有響應 MeJA、GA、ABA 和SA 等激素的元件，表明該基因的表達會受到多種激素誘導。NsylCLH1 基因啟動子中還含有多個光響應元件，暗示了其可能參與光調節(jié)的葉綠素降解過程?；虮磉_的組織特異性或信號響應性通常反映了相應基因產物在植物發(fā)育和信號傳導中的功能[5]。煙草屬植物 CLH1 基因對多種生物和非生物脅迫的響應，對于煙草分子育種和抗逆性育種等工作具有重要的參考價值，同時其基因靶位點的設計也為煙草屬植物CLH1 基因編輯提供了理論基礎。