肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌病例總數(shù)的80%以上

。早期診斷可顯著改善預(yù)后，但大多數(shù)患者在首次診斷時(shí)已進(jìn)展到中晚期，5年生存率相對(duì)較差

。因此尋找對(duì)NSCLC患者進(jìn)行早期篩查和診斷方法一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前肺癌的早期篩查主要依靠低劑量螺旋CT

，確診的金標(biāo)準(zhǔn)為腫瘤組織活檢病理組織學(xué)檢查

，但低劑量螺旋CT對(duì)早期肺癌漏診率較高，活檢病理組織學(xué)作為有創(chuàng)檢查不適合早期診斷；近年來常規(guī)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)一度作為早期肺癌篩查指標(biāo)，但敏感性、特異性不盡如人意。

miRNA是內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡

。外泌體是納米級(jí)囊泡，直徑為30～100 nm，幾乎所有類型的細(xì)胞都可分泌

。外泌體是miRNA運(yùn)輸?shù)闹饕d體之一，可以存在于尿液、唾液、血漿或惡性分泌物中

。近年來，研究發(fā)現(xiàn)

miRNA在腫瘤的診斷、預(yù)后和治療中發(fā)揮重要的作用，miRNA可能成為NSCLC的新型腫瘤標(biāo)志物。miR-9-3p是新發(fā)現(xiàn)的miRNA之一，在肝癌、胃癌、膠質(zhì)瘤患者中的表達(dá)明顯下調(diào)

。在本研究中，對(duì)NSCLC患者和肺部良性病變受試者血清外泌體中miR-9-3p的表達(dá)進(jìn)行了比較和分析，并討論了NSCLC 血清外泌體中miR-9-3p聯(lián)合癌胚抗原(CEA)、細(xì)胞角蛋白19片段抗原21-1(CYFRA21-1)檢測(cè)診斷NSCLC的價(jià)值。

1 臨床材料與方法

1.1 臨 床 材 料 收 集2016 年1 月 至2017 年12 月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)確診的80例NSCLC患者為研究對(duì)象。男42例，女38例；年齡39 ～82 歲，平 均 年 齡(52.63±13.18)歲；臨 床 分期：Ⅰ期10例、Ⅱ期30例、Ⅲ期32例、Ⅳ期8例；組織學(xué)分類：肺腺癌44例、肺鱗癌36例。良性對(duì)照組50例包括肺結(jié)核、肺膿腫、良性肺結(jié)節(jié)等，男26 例，女24 例；年 齡38 ～79 歲，平 均 年 齡(53.64±14.32)歲。兩組患者性別、年齡等基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

＞0.05)，具有可比性。該研究取得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(醫(yī)院倫理批準(zhǔn)文號(hào)：Qdlyy201512097)，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 選取標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選病例均經(jīng)病理組織學(xué)確診為NSCLC；均為原發(fā)性肺癌；血清樣本收集之前，患者沒有接受過化療、放療或其他抗腫瘤治療；均有血清外泌體miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1檢查資料；研究所需資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除轉(zhuǎn)移性肺癌；排除伴有其他部位惡性腫瘤者；排除嚴(yán)重肝、心、腎功能不全者。

1.3 方法 受試者清晨空腹時(shí)采集外周靜脈血約5 mL，以1 500 g離心10 min，隨后取上清在4 ℃下12 000 g離心10 min。2 h內(nèi)用一份血清樣本檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1水平，第二份置于－80 ℃冰箱保存，直到提取總RNA。

本研究就女性免疫性不孕與慢性生殖道炎癥及微量元素的關(guān)系進(jìn)行探究與分析，結(jié)果顯示，免疫性不孕的女性患者其陰道分泌物炎性因子(IL-6、IL-8及TNF-α)及血清銅均高于健康正常孕婦，血清硒及鋅均低于健康正常孕婦，且不同分類與病程免疫性不孕者的陰道分泌物炎性因子及血清微量元素指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Logistic分析顯示，上述檢測(cè)指標(biāo)均與女性免疫性不孕有密切關(guān)系，進(jìn)而肯定了上述指標(biāo)與女性免疫性不孕的關(guān)系。其中慢性生殖道炎癥導(dǎo)致的炎性細(xì)胞因子表達(dá)增強(qiáng)可較大程度反映生殖道的炎性損傷，微量元素對(duì)于子宮內(nèi)膜及生殖系統(tǒng)其他方面的影響也較大程度存在，且對(duì)免疫的失調(diào)影響較大[17-19]。

提取外泌體之前需在室溫下將血清樣本進(jìn)行解凍，隨后取上清300 μL，加入外泌體提取試劑60 μL(美國(guó)Invitrogen

總外泌體分離試劑盒，貨號(hào)4480025)，在4 ℃孵育30 min，然后室溫下以12 000 g離心10 min，最后使用100 μL PBS緩沖液重懸沉淀，得到血清外泌體。使用miRcute miRNA提取分離試劑盒(中國(guó)天根科技生化有限公司)從外泌體中提取miRNA。通過加尾法，使用Mir-X miRNA First-Strand合成試劑盒 (TaKaRa中國(guó)) 將提取的miRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用TB-Green Premix ExTaq Ⅱ (TaKaRa中國(guó)) 試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。使用U6基因作為內(nèi)參基因，采用2

法計(jì)算miR-9-3p表達(dá)的相對(duì)定量。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

混合裝配生產(chǎn)線是指在一條生產(chǎn)線上，通過改變裝配零部件的型號(hào)來生產(chǎn)不同種類的產(chǎn)品[1]?；煅b生產(chǎn)線一方面由于每個(gè)工位裝配零部件的不同加大了工人操作的難度與強(qiáng)度；另一方面經(jīng)常在流水線更換產(chǎn)品時(shí)發(fā)生錯(cuò)裝、漏裝等問題。而防錯(cuò)系統(tǒng)可以有效地減小上述錯(cuò)誤的發(fā)生，提高產(chǎn)品的合格率[2]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Graphpad Prism 8軟件和SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用

檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用Mann-Whitney

檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)；Spearman相關(guān)分析；通過繪制ROC曲線求取miR-9-3p診斷NSCLC的最佳臨界值；以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，用四格表法統(tǒng)計(jì)計(jì)算miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1單項(xiàng)及聯(lián)合檢測(cè)診斷NSCLC的價(jià)值。

＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

英文作為通用語言，在翻譯成各國(guó)的文字時(shí)需要遵循每個(gè)國(guó)家的特點(diǎn)進(jìn)行翻譯，翻譯時(shí)需要結(jié)合本國(guó)的文化特色，風(fēng)土人情以及人們的慣用語，這樣翻譯出來的文章才能夠被廣大讀者理解和接受。下面對(duì)翻譯方法加以詳細(xì)描述。

2.1 兩組受試者血清外泌體miR-9-3p 及CEA、CYFRA21-1表達(dá)水平比較 NSCLC組血清外泌體miR-9-3p及CEA、CYFRA21-1表達(dá)水平明顯高于良性對(duì)照組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

＜0.000 1)，見表1。

2.2 NSCLC 血 清 外 泌 體miR-9-3p 與CEA、CYFRA21-1表達(dá)水平相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，NSCLC血清外泌體miR-9-3p 表達(dá)水平與CEA、CYFRA21-1 表達(dá)水平具有明顯正相關(guān)(

＝0.936、

＝0.954，

＜0.001、

＜0.001)，

＜0.01。

小流域是河流水系中的基本集水單元，大流域生態(tài)治理的規(guī)劃與實(shí)施，需要以小流域?yàn)榛局卫韱卧?。把大流域分解成不同層次、不同類型的小流域，這些小流域是一個(gè)個(gè)相對(duì)獨(dú)立的生態(tài)系統(tǒng)，也是生態(tài)環(huán)境受到不同程度人為影響的一個(gè)個(gè)單元。從小流域存在問題出發(fā)，遵循正確的生態(tài)治理理念和做法，可以把這些小流域從生態(tài)環(huán)境退化的單元改造成為水—土—?dú)狻魅恿夹匝h(huán)、人類與環(huán)境和諧共存的單元。小單元的活動(dòng)可以形成大系統(tǒng)的變化，同樣，一個(gè)個(gè)小流域的生態(tài)修復(fù)將最終達(dá)成大流域整體生態(tài)系統(tǒng)的功能恢復(fù)與提升。

2.3 血清外泌體miR-9-3p聯(lián)合CEA、CYFRA21-1診斷NSCLC 的價(jià)值比較 繪制血清外泌體miR-9-3p 診 斷NSCLC 的ROC 曲 線， 見 圖1，miR-9-3p 診斷NSCLC曲線下面積 (ROC-AUC)為0.738，選取最大約登指數(shù) (0.702) 對(duì)應(yīng)的miR-9-3p 值作為診斷NSCLC 最佳臨界值，為1.827。血清外泌體miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1在NSCLC和對(duì)照組診斷結(jié)果與病理診斷結(jié)果對(duì)照，見表2。以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，血清外泌體miR-9-3p 聯(lián) 合CEA、CYFRA21-1 診 斷NSCLC的 價(jià)值比較，見表3。三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷NSCLC的敏感性、準(zhǔn)確性、陰性預(yù)測(cè)值與各單項(xiàng)檢測(cè)比較明顯提高，

＜0.01。

3 討論

腫瘤細(xì)胞釋放的外泌體經(jīng)常攜帶蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸，在局部和遠(yuǎn)處的受體細(xì)胞之間交換必要的信息

。由于外泌體可以在體液中很容易被獲得，可以作為腫瘤“液體活檢”潛在的生物標(biāo)志物

。外泌體攜帶血液循環(huán)中的miRNA，其磷脂膜可以保護(hù)最上層的核糖核酸，不被核糖核酸酶降解，miRNA在外泌體中非常穩(wěn)定

。miRNA是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性、短單鏈非編碼的RNA分子，與腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡或細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)密切相關(guān)，對(duì)真核生物基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控具有重要作用

。miRNA表達(dá)譜已被用于腫瘤診斷、分期和預(yù)測(cè)預(yù)后

。

許多研究表明，miR-9 在腫瘤中表達(dá)異常。miR-9在胰腺癌、肝癌以及鼻咽癌中抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲

。在膠質(zhì)瘤患者中，miR-9-3p通過靶向FOXG1抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡

。從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞提取的外泌體miR-9通過下調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞特異性分子-1的表達(dá)抑制膀胱癌的進(jìn)展

。miR-9在卵巢癌中表達(dá)上調(diào)可以降低E- 鈣粘蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移

。在本研究中，我們重點(diǎn)研究了miR-9-3p在NSCLC中的表達(dá)，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，NSCLC患者中miR-9-3p的表達(dá)顯著上調(diào)，表明miR-9-3p可能是NSCLC診斷的潛在生物標(biāo)志物。本研究還做了NSCLC患者中miR-9-3p與常規(guī)標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1血清水平相關(guān)性分析，結(jié)果顯示miR-9-3p表達(dá)水平與CEA、CYFRA21-1表達(dá)水平具有明顯正相關(guān)性；血清miR-9-3p、CEA、CYFRA21-1三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)診斷NSCLC的敏感性、準(zhǔn)確性、陰性預(yù)測(cè)值與各單項(xiàng)檢測(cè)比較明顯提高，有利于臨床早期診斷，減少誤漏診。

外泌體作為新一代診斷標(biāo)志物，具有諸多優(yōu)點(diǎn)，為多種疾病的診斷開辟了新的思路。本研究筆者只探討了外泌體miR-9-3p在NSCLC血清中的表達(dá)水平，及聯(lián)合常規(guī)標(biāo)志物診斷NSCLC的價(jià)值，在后續(xù)工作中還要進(jìn)一步深入研究血清miR-9-3p與不同臨床病理因素(腫瘤大小、組織類型、臨床分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后)相關(guān)性，為NSCLC的診療提供依據(jù)。

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