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2022-03-10 02:36:44張俊明周艷艷鄭國安徐麗瑛肖小華丁琦
藥品評價 2022年23期
張俊明，周艷艷，鄭國安，徐麗瑛，肖小華，丁琦
江西省醫(yī)療器械檢測中心，江西省藥物安全評價重點實驗室，江西 南昌 330029
銀馬抗病毒顆粒處方來源于清朝吳瑭所著《溫病條辨》中銀翹馬勃散方，主要由連翹、馬勃、金銀花、蘆根、牛蒡子及射干六味中藥組成，采用傳統(tǒng)的溫水浸出工藝精制，現(xiàn)代化的β-環(huán)糊精包埋及流化床技術(shù)制備，具有清熱解毒、泄肺利咽等功效，主要用于濕溫、濕熱郁于上焦，喉阻咽痛、急性扁桃腺炎的治療［1］。本研究對該顆粒劑的藥效及急性毒性進行了實驗，為該藥臨床研究提供參考。研究如下。
1 實驗材料與儀器
1.1 藥品
銀馬抗病毒顆粒，生產(chǎn)單位：江西省藥物研究所，批號：010915；雙黃連口服液，生產(chǎn)單位：黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司，批號：20 010303；阿司匹林，生產(chǎn)單位：南京白敬宇制藥廠。
1.2 動物
昆明種清潔級小鼠，合格證：2003001 101171；SPF 級SD 大鼠，合格證：2003001 101248；新西蘭兔，合格證：2003001101393，生產(chǎn)單位：上海斯萊克實驗動物有限公司。
1.3 試劑
內(nèi)毒素顯色基質(zhì)鱟試劑盒，生產(chǎn)單位：廈門市鱟試劑實驗廠有限公司。
1.4 儀器
FA-NJA-N 電子天平，生產(chǎn)單位：上海民橋精密儀器有限公司。
2 實驗方法與結(jié)果
2.1 方法
2.1.1 對小鼠二甲苯所致耳廓炎癥的試驗［2］取雄性小鼠50 只，體質(zhì)量范圍20 g～22 g，按體質(zhì)量隨機分成5 組，10 只/組，分別為陰性對照組（純化水），供試品低、中、高劑量組（銀馬抗病毒顆粒9.1、18.2、36.5 g/kg）及陽性對照組（雙黃連12 mL/kg）。每組灌胃給予相應(yīng)藥物，1 次/d，連續(xù)7 d，每次給藥1 h 后，各組動物右側(cè)耳廓均勻涂抹20 μL 二甲苯，左側(cè)耳廓不處理作對照。0.5 h后處死動物，均沿耳基線剪下動物兩耳，并用直徑9 mm 打孔器于耳的同一部位打下耳片，用千分之一電子天平稱重，計算耳部腫脹程度（左右耳片的重量之差），比較給藥組與對照組的腫脹程度，計算藥物對耳廓腫脹的抑制率，所得數(shù)據(jù)均進行組間t檢驗。
2.1.2 對大鼠瓊脂肉芽腫的試驗［3-4］取SD 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量范圍180 g～220 g，隨機分成5 組，10 只/組，分別為陰性對照組（純化水），供試品低、中、高劑量組（銀馬抗病毒顆粒4.5、9.1、18.2 g/kg）及陽性對照組（雙黃連6 mL/kg）。用乙醚淺麻醉，在無菌操作下，每只大鼠于背中線項下注射2 mL的2%瓊脂溶液，各組灌胃給予相應(yīng)藥物，1 次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后24 h 處死動物，剝離肉芽腫，用千分之一電子天平稱量肉芽腫濕重，所得數(shù)據(jù)進行組間t檢驗比較。
2.1.3 對內(nèi)毒素致發(fā)熱實驗兔體溫的試驗［5］選擇體溫范圍在38.6～39.5 ℃內(nèi)，且二次溫度波動幅度在0.3 ℃內(nèi)實驗兔32 只，按基礎(chǔ)體溫隨機分成4 組，8 只/組，分別為陰性對照組（純化水），供試品低、高劑量組（銀馬抗病毒顆粒3.64、7.28 g/kg）及陽性對照組（阿司匹林0.10 g/kg）。各組實驗動物均灌胃給予相應(yīng)藥物，1 次/d，連續(xù)給藥3 d。末次給藥前對各組實驗兔進行基礎(chǔ)體溫測定，連續(xù)兩次間隔30 min，末次給藥30 min 后，耳緣靜脈推注細菌內(nèi)毒素30 EU/kg，靜脈注射后0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h各測量體溫1 次，并計算各時間點實驗兔體溫的變化值（測定體溫-基礎(chǔ)體溫，△℃），所得數(shù)據(jù)均進行組間t檢驗。
2.1.4 小鼠急性毒性試驗 取SPF 級昆明種小鼠80只，雄性、雌性各40 只，按體質(zhì)量隨機分為8 組，10 只/組。據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，將試驗用藥按1:0.93 的組間比等比稀釋，給藥量為30 mL/kg，單日給藥3 次，單日內(nèi)給藥劑量分別為511.875、475.850、442.590、411.640、382.820、356.070 及331.130 g/kg。對照組給予純化水，給藥后觀察實驗動物的毒性反應(yīng)及死亡情況，1 次/d，連續(xù)觀察14 d。對死亡動物及觀察期結(jié)束后的動物進行大體解剖，觀察腹腔、盆腔、胸腔、頸部、心、肝、脾、肺、腎及腦等主要臟器及組織的變化，對有異常的臟器及組織取出、固定、包埋行組織病理學(xué)檢查，用Bliss 法計算動物灌胃給藥的LD50及95%的可信區(qū)間。
2.1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用DAS3.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，進行組間t檢驗和半數(shù)致死量（LD50）的計算。
2.2 結(jié)果
2.2.1 對小鼠二甲苯所致耳廓炎癥影響 銀馬抗病毒顆粒低、中劑量組（9.1 g/kg、18.2 g/kg）和雙黃連口服液組均能不同程度地降低二甲苯所致耳廓炎癥反應(yīng)的耳腫脹度，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。結(jié)果表明，銀馬抗病毒顆粒具有良好的抑制急性炎癥反應(yīng)。結(jié)果見表1。
表1 銀馬抗病毒顆粒對小鼠二甲苯所致耳廓炎癥的影響（n=10）
2.2.2 對大鼠瓊脂肉芽腫的影響 銀馬抗病毒顆粒低、中劑量組（4.5、9.1 g/kg）與陽性對照組均明顯抑制由瓊脂所致的肉芽腫，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。結(jié)果見表2。
表2 銀馬抗病毒顆粒對大鼠瓊脂肉芽腫的影響（n=10）
2.2.3 對內(nèi)毒素致發(fā)熱實驗兔體溫的影響 受試物低劑量組（3.64 g/kg）可顯著性降低0.5 h 體溫，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組（7.28 g/kg）可顯著性降低0.5 h～2.0 h 時間段的體溫，與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）；阿司匹林組可顯著性降低0.5 h～2.5 h 的體溫，與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。結(jié)果表明，銀馬抗病毒顆粒在多個時間點可顯著抑制內(nèi)毒素致實驗兔的體溫升高，具有較好的解熱作用。結(jié)果見表3。
表3 銀馬抗病毒顆粒對內(nèi)毒素致實驗兔體溫的影響
2.2.4 小鼠急性毒性試驗 給藥組動物除對照組和銀馬抗病毒顆粒331.13 g/kg 劑量組未見異常外，其他各組動物均在給藥后24 h 內(nèi)不同程度地出現(xiàn)煩躁不安，活動增多，醉步，自主活動減少，毛發(fā)松散、嗜睡、死亡，具體的死亡動物數(shù)見表4。對死亡動物進行大體解剖，主要臟器腦、心、肝、肺、脾、腎、胃等均未見異常變化，其余存活小鼠也有嗜睡，自主活動減少，但24 h 后，其毛色、攝食、行為活動，二便均正常，無異常反應(yīng)。用Bliss 法計算銀馬抗病毒顆粒單日3 次灌胃給藥，每次給藥容量為30 mL/kg，計算得LD50為397.203 g/kg，95%的可信區(qū)間為379.699 g/kg～415.514 g/kg。
表4 銀馬抗病毒顆粒急性毒性試驗動物死亡結(jié)果
3 討論
銀馬抗病毒顆粒由連翹、牛蒡子、金銀花、射干、馬勃及蘆根六味藥組成，處方中的幾味中藥都具有抗炎、解熱的作用，盛可心等［6］報道連翹具有抗炎、抗氧化及抗病毒的作用，有研究［7-8］提示牛蒡子中木質(zhì)素和生物堿具有鎮(zhèn)痛抗炎的作用，蘇連杰等［9］研究結(jié)果表明金銀花莖葉不同方法的提取物均具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，雷玲等［10］對金銀花的解熱成分進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)其中綠原酸和木犀草素沒有解熱活性，對其解熱、抗炎的確切成分仍不明確，需要進一步的研究。二甲苯致小鼠耳腫脹是常用的急性炎癥模型，以血管通透性改變?yōu)橹鳎y馬抗病毒顆粒能明顯抑制耳腫脹程度。瓊脂致大鼠肉芽腫模型是以排異反應(yīng)為主的亞急性（慢性）炎癥模型，銀馬抗病毒顆粒對急性炎癥和慢性炎癥均具有明顯的抑制作用，提示銀馬抗病毒顆粒具有抗炎作用。在解熱實驗?zāi)Ｐ椭校瑑?nèi)毒素致進入機體后產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱原［11］，從而使機體發(fā)熱，銀馬抗病毒顆粒能明顯抑制內(nèi)毒素致實驗兔的體溫升高，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，提示銀馬抗病毒顆粒具有解熱作用，且劑量越大維持解熱的作用更明顯，時間更長。綜上，銀馬抗病毒顆粒具有抗炎解熱的作用。采用Bliss 法，銀馬抗病毒顆粒小鼠口服LD50為397.203 g/kg，95%的可信區(qū)間為379.699 g/kg～415.514 g/kg，相當于人用劑量的218.2 倍。我們的前期研究結(jié)果表明銀馬抗病毒顆粒在體內(nèi)外為均具有明顯的抗菌作用，還具有明顯抑制T 細胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用［1］。
新型冠狀病毒肺炎患者的主要癥狀是發(fā)熱、炎癥因子大量表達引發(fā)細胞因子風(fēng)暴，進而導(dǎo)致免疫失衡，因此采用有解熱抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用的中藥、中藥方劑，有利于更好地抗擊病毒［12］。銀馬抗病毒顆粒藥效學(xué)研究顯示，其在抗炎、解熱、抑菌及免疫調(diào)節(jié)方面均有明顯的作用。梁德東等［13］報告，銀馬抗病毒顆粒能較好地抑制炎癥性疼痛，有效降低LPS 誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠的體溫，具有良好的利咽、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等作用。方中含有《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［14］中推薦的單味中藥，可能對抗擊病毒具有潛在治療價值，有待進一步研究。
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2.1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用DAS3.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，進行組間t檢驗和半數(shù)致死量（LD50）的計算。
2.2 結(jié)果
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表1 銀馬抗病毒顆粒對小鼠二甲苯所致耳廓炎癥的影響（n=10）
2.2.2 對大鼠瓊脂肉芽腫的影響 銀馬抗病毒顆粒低、中劑量組（4.5、9.1 g/kg）與陽性對照組均明顯抑制由瓊脂所致的肉芽腫，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。結(jié)果見表2。
表2 銀馬抗病毒顆粒對大鼠瓊脂肉芽腫的影響（n=10）
2.2.3 對內(nèi)毒素致發(fā)熱實驗兔體溫的影響 受試物低劑量組（3.64 g/kg）可顯著性降低0.5 h 體溫，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高劑量組（7.28 g/kg）可顯著性降低0.5 h～2.0 h 時間段的體溫，與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）；阿司匹林組可顯著性降低0.5 h～2.5 h 的體溫，與對照組比較，均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05 和P＜0.01）。結(jié)果表明，銀馬抗病毒顆粒在多個時間點可顯著抑制內(nèi)毒素致實驗兔的體溫升高，具有較好的解熱作用。結(jié)果見表3。
表3 銀馬抗病毒顆粒對內(nèi)毒素致實驗兔體溫的影響
2.2.4 小鼠急性毒性試驗 給藥組動物除對照組和銀馬抗病毒顆粒331.13 g/kg 劑量組未見異常外，其他各組動物均在給藥后24 h 內(nèi)不同程度地出現(xiàn)煩躁不安，活動增多，醉步，自主活動減少，毛發(fā)松散、嗜睡、死亡，具體的死亡動物數(shù)見表4。對死亡動物進行大體解剖，主要臟器腦、心、肝、肺、脾、腎、胃等均未見異常變化，其余存活小鼠也有嗜睡，自主活動減少，但24 h 后，其毛色、攝食、行為活動，二便均正常，無異常反應(yīng)。用Bliss 法計算銀馬抗病毒顆粒單日3 次灌胃給藥，每次給藥容量為30 mL/kg，計算得LD50為397.203 g/kg，95%的可信區(qū)間為379.699 g/kg～415.514 g/kg。
表4 銀馬抗病毒顆粒急性毒性試驗動物死亡結(jié)果
3 討論
銀馬抗病毒顆粒由連翹、牛蒡子、金銀花、射干、馬勃及蘆根六味藥組成，處方中的幾味中藥都具有抗炎、解熱的作用，盛可心等［6］報道連翹具有抗炎、抗氧化及抗病毒的作用，有研究［7-8］提示牛蒡子中木質(zhì)素和生物堿具有鎮(zhèn)痛抗炎的作用，蘇連杰等［9］研究結(jié)果表明金銀花莖葉不同方法的提取物均具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，雷玲等［10］對金銀花的解熱成分進行了初步探討，發(fā)現(xiàn)其中綠原酸和木犀草素沒有解熱活性，對其解熱、抗炎的確切成分仍不明確，需要進一步的研究。二甲苯致小鼠耳腫脹是常用的急性炎癥模型，以血管通透性改變?yōu)橹鳎y馬抗病毒顆粒能明顯抑制耳腫脹程度。瓊脂致大鼠肉芽腫模型是以排異反應(yīng)為主的亞急性（慢性）炎癥模型，銀馬抗病毒顆粒對急性炎癥和慢性炎癥均具有明顯的抑制作用，提示銀馬抗病毒顆粒具有抗炎作用。在解熱實驗?zāi)Ｐ椭校瑑?nèi)毒素致進入機體后產(chǎn)生和釋放內(nèi)生致熱原［11］，從而使機體發(fā)熱，銀馬抗病毒顆粒能明顯抑制內(nèi)毒素致實驗兔的體溫升高，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，提示銀馬抗病毒顆粒具有解熱作用，且劑量越大維持解熱的作用更明顯，時間更長。綜上，銀馬抗病毒顆粒具有抗炎解熱的作用。采用Bliss 法，銀馬抗病毒顆粒小鼠口服LD50為397.203 g/kg，95%的可信區(qū)間為379.699 g/kg～415.514 g/kg，相當于人用劑量的218.2 倍。我們的前期研究結(jié)果表明銀馬抗病毒顆粒在體內(nèi)外為均具有明顯的抗菌作用，還具有明顯抑制T 細胞介導(dǎo)的遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用［1］。
新型冠狀病毒肺炎患者的主要癥狀是發(fā)熱、炎癥因子大量表達引發(fā)細胞因子風(fēng)暴，進而導(dǎo)致免疫失衡，因此采用有解熱抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用的中藥、中藥方劑，有利于更好地抗擊病毒［12］。銀馬抗病毒顆粒藥效學(xué)研究顯示，其在抗炎、解熱、抑菌及免疫調(diào)節(jié)方面均有明顯的作用。梁德東等［13］報告，銀馬抗病毒顆粒能較好地抑制炎癥性疼痛，有效降低LPS 誘導(dǎo)發(fā)熱大鼠的體溫，具有良好的利咽、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱等作用。方中含有《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》［14］中推薦的單味中藥，可能對抗擊病毒具有潛在治療價值，有待進一步研究。
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