陳靜，魏鑒騰，陳文雅，劉曄瑋

（蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000）

記憶是人腦對過去經(jīng)驗的保持和再現(xiàn)，它是進(jìn)行思維、想象等高級心理活動的基礎(chǔ)[1]。應(yīng)激、衰老、代謝綜合征及危險基因等都是引起記憶障礙的危險因素[2]。隨著社會的高速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，學(xué)習(xí)、工作壓力增加，而由壓力引起的焦慮、抑郁、失眠等狀態(tài)會對大腦造成一定的損傷，最直接的結(jié)果便是頭痛、記憶力下降等癥狀[3]。記憶障礙的持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致認(rèn)知障礙，嚴(yán)重者還會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）、阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、亨廷頓病（Huntington disease，HD）、肌萎縮側(cè)索硬化癥（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）等[4]。因此，研究和開發(fā)改善記憶障礙的功能食品已成為研究的熱點。

生物活性肽由結(jié)構(gòu)多樣的氨基酸組成，通過蛋白質(zhì)水解獲得[5]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力、保護(hù)心血管等多種生物學(xué)作用[6]。此外，許多研究表明一些生物活性肽具有改善記憶的功能，如裴新榮等[7]以鮭魚魚皮等深海魚皮為主要原料制備的海洋膠原肽，林海生[8]以牡蠣為原料制備的牡蠣蛋白肽及Wu等[9]研究了五肽Gln-Met-Asp-Asp-Gln與Ala-Gly-Leu-Pro-Met對小鼠記憶改善的協(xié)同作用。魚籽多肽是以魚籽為原料經(jīng)蛋白酶水解后得到的多肽，氨基酸種類及含量豐富、營養(yǎng)價值較高、具有多種生物活性。但目前關(guān)于魚籽多肽改善記憶的研究鮮有報道。本文通過研究魚籽多肽對小鼠記憶改善的作用，為魚籽多肽的高值化開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

鲅魚魚籽：市售。

1.1.2 試驗動物

SPF級雌性KM種小鼠（144只，體重為18g～22g）：北京華阜康生物科技股份有限公司。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0008。動物房內(nèi)溫度20℃～22℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗，均標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。動物質(zhì)量合格證：No.110322200101173261。

1.1.3 主要儀器及試劑

YLS-3TB型跳臺儀、YLS-17B型穿梭箱、XRXR101型Morris水迷宮儀：淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司；SMART 3.0小動物行為學(xué)視頻采集與分析系統(tǒng)：深圳市瑞沃德生命科技有限公司。

無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 魚籽多肽的制備

魚籽多肽的制備參考文獻(xiàn)[10]稍作修改。魚籽和水經(jīng)高速剪切、酶切、滅酶、離心、烘干等，獲得魚籽多肽。

1.2.2 動物分組及干預(yù)

144只KM種雌性小鼠分為3組，分別用于跳臺實驗、穿梭箱實驗和Morris水迷宮實驗。48只小鼠隨機分為空白對照組和魚籽多肽低、中、高劑量組4個組，灌胃劑量分別為 0、0.17、0.33、1.00 g/kg BW，經(jīng)口灌胃量為10 mL/kg BW，空白對照組給予等量無菌水，1次/d，持續(xù) 41 d。

1.2.3 跳臺實驗

跳臺實驗參照文獻(xiàn)[11]的方法略作修改。末次給受試物后次日開始訓(xùn)練，將小鼠放置在絕緣平臺上，記錄每只小鼠第1次跳下平臺的潛伏期和5 min內(nèi)跳下平臺的錯誤次數(shù)。24 h后重新測試，記錄每只小鼠3 min內(nèi)第1次跳下平臺的潛伏期及跳下平臺的錯誤次數(shù)和受到電擊的小鼠總數(shù)。5 d后進(jìn)行消退實驗。

1.2.4 穿梭箱實驗

穿梭箱實驗參照文獻(xiàn)[12]的方法略作修改。末次給受試物后次日開始訓(xùn)練。小鼠在箱內(nèi)適應(yīng)60 s后，持續(xù)燈光15 s，給予10 s電刺激（電流0.2 mA）。間隔1 d訓(xùn)練一回，每回30次，連續(xù)訓(xùn)練3回記錄并分析小鼠主動、被動回避次數(shù)，小鼠主動、被動回避時間，計算小鼠主動回避率。24 h后重新測試。5 d后進(jìn)行消退實驗。

1.2.5 Morris水迷宮實驗

Morris水迷宮實驗參照文獻(xiàn)[13]的方法略作修改。末次給受試物后次日開始訓(xùn)練。實驗全程嚴(yán)格保持室內(nèi)物體位置固定以及光照強度恒定（25 W）后開始測試。將小鼠從同一象限放入水中開始實驗，若小鼠進(jìn)入平臺停留時間超過3 s或總時長60 s后停止計時，記錄數(shù)據(jù)。若小鼠60 s內(nèi)未進(jìn)入平臺，手動將其放入平臺停留30 s。24 h后重新測試。5 d后進(jìn)行消退實驗。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗或Dunnett T3檢驗，以p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。跳臺實驗跳下平臺的錯誤次數(shù)及受電擊動物數(shù)、穿梭箱實驗主動和被動回避次數(shù)、Morris水迷宮實驗穿臺次數(shù)采用χ2檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚籽多肽對小鼠體重的影響

魚籽多肽對小鼠體重的影響見表1。

表1 魚籽多肽對小鼠體重的影響Table 1 The effect of polypeptides from fish roes on the weight of mice

由表1可見，經(jīng)連續(xù)灌胃給予小鼠不同劑量的魚籽多肽41 d后，跳臺實驗、穿梭箱實驗及Morris水迷宮實驗低、中、高劑量組小鼠的體重與對照組相比，無顯著差異（p＞0.05）。結(jié)果表明魚籽多肽對小鼠的體重?zé)o不良影響。

2.2 魚籽多肽對小鼠跳臺實驗的影響

魚籽多肽對小鼠跳臺實驗的影響見表2～表4。

由表2可見，高劑量組小鼠測驗時跳下平臺的潛伏期與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；低、中劑量組雖未有統(tǒng)計學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出潛伏期有延長的趨勢。由表3可見，高劑量組小鼠測驗時跳臺錯誤次數(shù)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；低、中劑量組雖未有統(tǒng)計學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出跳臺錯誤次數(shù)有減少的趨勢。由表4可見，高劑量組小鼠測驗時受電擊動物數(shù)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；低、中劑量組雖未有統(tǒng)計學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出受電擊動物數(shù)有減少的趨勢。

表2 魚籽多肽對小鼠跳臺潛伏期的影響Table 2 The effect of polypeptides from fish roes on diving latency in mice jumping platform

表3 魚籽多肽對小鼠跳臺錯誤次數(shù)的影響Table 3 The effect of polypeptides from fish roes on the number of errors in mice jumping platform

表4 魚籽多肽對小鼠跳臺受電擊動物數(shù)的影響Table 4 The effect of polypeptides from fish roes on the number of animals subjected to electric shock in mice jumping platform

2.3 魚籽多肽對小鼠穿梭箱實驗的影響

魚籽多肽對小鼠穿梭箱實驗的影響見表5～表7。

由表5可見，中劑量組小鼠測試時主動回避時間與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；低、高劑量組雖未有統(tǒng)計學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出主動回避時間有縮短的趨勢。由表6可見，各劑量組小鼠測驗時被動回避時間與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），但是從結(jié)果中可以看出小鼠被動回避時間有縮短的趨勢。由表7可見，各劑量組小鼠測驗時主動回避只數(shù)與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），但是從消退期的結(jié)果中可以看出主動回避的小鼠數(shù)有增多的趨勢。

表5 魚籽多肽對小鼠穿梭箱主動回避時間的影響Table 5 The effect of polypeptides from fish roes on active evading time of shuttle box of mice

表6 魚籽多肽對小鼠穿梭箱被動回避時間的影響Table 6 The effect of polypeptides from fish roes on passive evading time of shuttle box of mice

表7 魚籽多肽對小鼠穿梭箱主動回避數(shù)的影響Table 7 The effect of polypeptides from fish roes on actively evadingin the shuttle box of mice

2.4 魚籽多肽對小鼠Morris水迷宮實驗的影響

魚籽多肽對小鼠Morris水迷宮實驗的影響見表8～表 9。

表8 魚籽多肽對小鼠Morris水迷宮實驗潛伏期的影響Table 8 The effect of polypeptides from fish roes on the latent period of Morris water maze test in mice

表9 魚籽多肽對小鼠Morris水迷宮實驗穿臺次數(shù)的影響Table 9 The effect of polypeptides from fish roes on the number of crossing the platform in the Morris water maze test in mice

由表8可見，各劑量組小鼠測驗潛伏期與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。但是從結(jié)果中可以看出潛伏期有縮短的趨勢。由表9可見，中劑量組小鼠測試時的穿臺次數(shù)與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05）；低、高劑量組雖未有統(tǒng)計學(xué)意義，但是從結(jié)果中可以看出穿臺次數(shù)有增多的趨勢。

3 結(jié)論與討論

跳臺實驗、穿梭箱實驗以及Morris水迷宮實驗是常用來研究改善記憶的動物實驗[14]。跳臺實驗中，當(dāng)把小鼠放在平臺上時，它會立即跳下平臺，如果小鼠跳下平臺時受到電擊，其正常反應(yīng)是跳回平臺以躲避傷害刺激。多數(shù)小鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺。因此，小鼠跳臺潛伏期越長、跳下平臺的錯誤次數(shù)越少和受電擊動物數(shù)越少證明小鼠的記憶能力越好。穿梭箱實驗是將小鼠放入箱子中，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后，利用暗箱中的鐵柵與小鼠的雙腳形成閉合回路，給予小鼠電擊，若小鼠在受到聲音刺激時主動逃到箱體的一端，則不會被電擊，否則將會遭到電擊。因此小鼠的主被動回避時間越短證明小鼠的記憶能力越好。Morris水迷宮實驗主要用于檢測實驗動物的運動和空間位置記憶能力，同時能較準(zhǔn)確地反映與海馬體功能直接相關(guān)的動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[15]。在實驗中，將小鼠在固定位置面向池壁輕放入水中并開始計時，若小鼠在60 s內(nèi)找到站臺并停留10 s，則以停留10 s后的時間作為潛伏期。若小鼠在60 s內(nèi)未找到站臺則將其引至站臺并停留10 s，潛伏期記為60 s。小鼠連續(xù)訓(xùn)練5 d后，觀察記錄其上站臺的潛伏期。在定位航行實驗完成后，待小鼠休息一段時間，撤去站臺，在固定位置將小鼠面向池壁放入水中，記錄其60 s內(nèi)其穿越站臺區(qū)的次數(shù)。因此，當(dāng)小鼠的穿臺次數(shù)越多、潛伏期越短證明小鼠的記憶力越好。

本實驗的魚籽多肽以魚籽為原料，經(jīng)高速剪切及酶解得到[10]。研究表明，魚籽多肽中有較為豐富的谷氨酸、天冬氨酸和L-亮氨酸[16]。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過激活N-甲基-D-天冬氨酸受體，進(jìn)而產(chǎn)生長時程增強效應(yīng)（long-term potentiation，LTP），實現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶過程[17]。L-亮氨酸通過激活mTOR及其下游底物（4E-BP1和P70S6K）對記憶損傷有一定的改善作用[18]。推測谷氨酸和L-亮氨酸為使魚籽多肽具有記憶改善作用的主要氨基酸成分。魚籽多肽是經(jīng)酶解得到的多肽混合物，其物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機制還有待進(jìn)一步研究。

研究結(jié)果表明，跳臺實驗高劑量組小鼠測驗時跳下平臺的潛伏期延長、跳下平臺錯誤次數(shù)、跳下平臺動物數(shù)與對照組相比明顯減少（p＜0.05）。穿梭箱實驗中劑量組小鼠測驗時主動回避時間與對照組相比明顯縮短（p＜0.05）。Morris水迷宮實驗中劑量組小鼠測試時的穿臺次數(shù)與對照組相比明顯增加（p＜0.05）。綜上所述，魚籽多肽對小鼠的記憶功能有一定的改善作用，本實驗結(jié)果可為魚籽多肽改善記憶功能食品的應(yīng)用開發(fā)提供實驗基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。