劉智媛，葉 康，杜習(xí)武，彭勇政，秦 俊*，曾 麗*

(1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.上海辰山植物園，上海 201602)

藤本月季‘安吉拉’(Rosa‘Angela’)為薔薇科薔薇亞科薔薇屬植物，20世紀(jì)80年代由德國Kordes公司育成，因花成簇開放、花量大、花色鮮艷、多季節(jié)開花、枝條長勢強、葉色中綠有光澤、耐熱性及抗病性好等特點，廣泛應(yīng)用于高架橋、花墻、花架、廊道及建筑墻面等立體綠化中，近年來受到越來越多的關(guān)注，也是目前中國長三角地區(qū)園林綠化應(yīng)用的熱點花卉之一[1-2]?；ㄊ侵参镒钪匾挠^賞器官之一，其中花色種類豐富，色彩絢麗且渲染力強，是園林景觀不可缺少的元素，也是提升和評價園林植物景觀品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。狹義的花色是指構(gòu)成花冠的花瓣所呈現(xiàn)的顏色，廣義的花色是指完整花器官甚至苞葉所呈現(xiàn)的顏色[3]。植物的花色受花色素種類及含量、糖類、脂類、細(xì)胞pH、花瓣結(jié)構(gòu)、溫度、光照、水分等綜合因素的影響[4-5]。前人對月季花色的研究較多，SCHMITZER等[6]利用高效液相色譜/質(zhì)譜法測量月季花發(fā)育過程中花色苷、槲皮素、兒茶素和酚酸的濃度，并計算色度參數(shù)與花色苷之間的相關(guān)性。OSTERC[7]發(fā)現(xiàn)月季從花蕾到衰老發(fā)育過程中，花瓣L*值增加，b*值和a*值減少；花朵盛開期花青素和槲皮素的總含量最高，而凋花期最低。程怡等[8]研究表明月季品種‘仙境’花色主要受到花色苷的直接作用，其他因素則通過影響花色苷間接影響花色的呈現(xiàn)。WAN等[9]對月季‘Sun City’花瓣進(jìn)行高效液相色譜和質(zhì)譜檢測分析，花發(fā)育過程中花半開放時總黃酮含量最高(1 152.29 μg/g)，類胡蘿卜素盛花期最高(142.71 μg/g)，黃酮醇和類胡蘿卜素是形成黃色花的主要色素。目前有關(guān)月季發(fā)育過程中花瓣顏色、形態(tài)結(jié)構(gòu)、色素分布、色素種類、色素含量等方面的變化規(guī)律仍缺乏較系統(tǒng)的研究，有關(guān)藤本月季‘安吉拉’花色與花瓣結(jié)構(gòu)及色素含量變化規(guī)律尚未見報道。

該研究以藤本月季‘安吉拉’為試驗材料，通過其花色度的L*值(明度)、a*值(紅綠參數(shù))、b*值(黃藍(lán)參數(shù)) 、h值(色相角)和C*值(彩度)，花色苷，類黃酮，類胡蘿卜素和葉綠素含量的測定，結(jié)合花瓣發(fā)育過程中形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，探索藤本月季‘安吉拉’發(fā)育過程花瓣形態(tài)結(jié)構(gòu)和色素的相關(guān)性及變化規(guī)律，研究結(jié)果對提升藤本月季景觀效果、推動藤本月季行業(yè)高效發(fā)展具有積極意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

藤本月季‘安吉拉’，來自上海辰山植物園，試驗期間進(jìn)行常規(guī)養(yǎng)護(hù)管理。

1.2 試驗方法

1.2.1 花瓣發(fā)育過程的分期 參考程怡等[8]將花瓣發(fā)育過程分為 6 個時期(圖 1)，分別為小蕾期(BS，花蕾直徑0.70 cm±0.02 cm)、大蕾期(CCS，小蕾期后3 d，花蕾直徑0.75 cm±0.06 cm)、露色期(CES，小蕾期后6 d，花蕾直徑1.10 cm±0.08 cm，花萼略微張開，花瓣從花萼中顯現(xiàn))、初開期(IOS，小蕾期后 9 d，花萼完全張開，花瓣逐漸開始開放，花瓣較小，花徑4.25 cm±0.12 cm)、盛開期(FOS，小蕾期后10 d，花瓣完全展開，花徑4.91 cm±0.08 cm)以及凋花期(WS，小蕾期后13 d，花型松散，花瓣開始掉落，花徑6.02 cm±0.25 cm)。

花瓣發(fā)育過程中花蕾及花朵外部直徑的測定是在相同栽培條件下，隨機(jī)采取同一發(fā)育時期不同花蕾或花朵10個測其直徑，取平均值。

1.2.2 花色值測定 采用英國皇家園藝協(xié)會比色卡(Royal Horticultural Social Color Chart，RHSCC)(RHS，2015)測定不同發(fā)育時期的花瓣顏色。

1.2.3 花瓣形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 通過徒手切片法、石蠟切片法及掃描電鏡法觀察不同發(fā)育時期花瓣結(jié)構(gòu)。

徒手切片法：分別選取6個發(fā)育時期的新鮮花瓣，采用雙刀片法劃取花瓣中間部位，取下刀片間花瓣結(jié)構(gòu)，在Olmypus BX41顯微鏡下觀察花瓣橫切結(jié)構(gòu)及色素分布，并拍照。

石蠟切片法：分別選取6個發(fā)育時期的新鮮花瓣中間部位，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋及修塊等步驟后，利用萊卡Leica2245切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度8～10 μm，將切片放置于萊卡H1220烘片臺烘片，條帶完全展開后用番紅/固綠溶液染色，Olmypus BX41顯微鏡下觀察花瓣橫切結(jié)構(gòu)，并隨機(jī)選擇不同發(fā)育時期5個花瓣樣本測量花瓣厚度，取平均值為花瓣厚度。

掃描電鏡法：選取6個發(fā)育時期的新鮮花瓣，將花瓣中間部位剪裁成0.5 cm×0.5 cm，立即用2.5%戊二醛溶液固定保存24 h，在磷酸緩沖液中徹底清洗。隨后用乙醇溶液梯度脫水，叔丁醇逐級置換，用VFD冷凍干燥儀進(jìn)行冷凍干燥后粘于樣品臺上，材料表面噴鍍薄層金膜，置于HITACHIQ250掃描電鏡下觀察花瓣上表皮和下表皮結(jié)構(gòu)，并拍照。同時在3000 ×放大倍數(shù)下對花瓣上表皮細(xì)胞(upper epidermal cells，UC)數(shù)目和下表皮細(xì)胞(below pidermal cells，BC)數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，重復(fù)5次，取平均值。

1.2.4 花瓣不同色素含量的測定 采集不同發(fā)育時期的花瓣，迅速用液氮冷凍并保存于-80 ℃冰箱內(nèi)，去除花瓣基部，取花瓣前2/3部分進(jìn)行不同色素含量的測定。

類黃酮測定參考WAN等[9]方法，采用AlCl3顯色法，烘干樣品0.02 g，加入 2 mL 提取液，60 ℃振蕩提取2 h取上清，依次6 μL的NaNO2混勻； 5 min后加入6 μL的AlCl3混勻，放置 6 min；加 80 μL的NaOH溶液，靜置15 min后，在波長510 nm處的測定其OD值?；ㄉ諟y定參考唐琳等[10]采用pH示差法，稱取烘干樣品0.1 g，加入1 mL 60%酸性乙醇提取液，取20 μL上清液，分別用pH l.0的氯化鉀-鹽酸緩沖液、pH 4.5的醋酸鈉-鹽酸緩沖液稀釋10倍，40 ℃水浴20 min，分別在530 nm和 700 nm下測定其OD值。

類胡蘿卜素(carotenoid，Car)和葉綠素(chlorophyll，Chl)采用唐延林等[11]方法進(jìn)行提取測定，剪取0.2 g花瓣樣品加入(丙酮、無水乙醇 、蒸餾水的體積比為4.5∶4.5∶1)100 mL提取液于室溫下遮光靜置至花瓣完全發(fā)白，在波長663、645和440 nm下測量其OD值，類胡蘿卜素和葉綠素計算公式：

葉綠素a (mg/L)=9.784OD663 nm-0.990OD645 nm

葉綠素b(mg/L)=21.426OD645 nm-4.650OD663 nm

總?cè)~綠素(mg/L)=5.134OD663 nm+20.436OD645 nm

類胡蘿卜素(mg/L)=4.695OD440 nm-0.268 (葉綠素a+葉綠素b)

葉綠素(mg/g)=[葉綠素 (mg/L)×提取液體積(mL)]/[樣品質(zhì)量(g)×1 000]。

類胡蘿卜素(mg/g)=[類胡蘿卜素(mg/L)×提取液體積(mL)]/[樣品質(zhì)量(g)×1 000]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用SigmaPlot 14.0軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 花瓣不同發(fā)育時期表型變化特征

采用英國皇家園藝協(xié)會比色卡測定不同發(fā)育時期的花瓣近軸面、遠(yuǎn)軸面顏色(圖1)。從小蕾期至凋花期近軸面花色值依次為154D-39B-63A-N57B-N66B-N66D，遠(yuǎn)軸面花色值依次為154D-38A-58B-62A-62A-73B，由此可以看出近軸面和遠(yuǎn)軸面花瓣顏色變化規(guī)律相似，但遠(yuǎn)軸面花色比近軸面花色略淺。

利用分光測色儀測花瓣上表皮、下表皮的L*值、a*值、b*值如表1所示。小蕾期花瓣L*值和b*值顯著高于其他時期，a*值和h值顯著低于其他時期，說明花色亮度較高，主要呈黃綠色且有明顯的色相差。大蕾期L*值、b*值和C*值開始下降，a*值和h值顯著增加，說明此時花瓣亮度開始降低，紅色開始顯現(xiàn)，但仍有明顯的色像差。露色期L*值達(dá)到最低，a*值和C*值升高，b*值和h值下降，說明此時花瓣紅色開始加深。初開期L*值上升，a*值和C*值達(dá)到較高，b*值和h值持續(xù)降低，說明此時花瓣紅色程度達(dá)到最高，花瓣顏色均勻。盛開期L*值雖有顯著上升，但a*值、b*值、C*值和h值均出現(xiàn)顯著降低的趨勢，說明此時花瓣紅色開始褪減，花瓣顏色分布不均勻。凋花期花瓣L*值顯著增加，但a*值和C*值顯著下降，b*值與盛花期時無明顯差異，說明此時花瓣紅色表現(xiàn)持續(xù)減弱，部分褪至白色，整體顏色分布不均。花瓣近軸面與遠(yuǎn)軸面花色變化規(guī)律基本一致。

注：A是小蕾期；B是大蕾期；C是露色期；D是初開期；E是盛開期；F是凋花期；BP是近軸面，F(xiàn)P是遠(yuǎn)軸面。Note: A is bud stage; B is color changing stage; C is color exposing stage; D is initial opening stage; E is full opening stage; F is wilting stage; BP is back petal, FP is front petal.圖1 花瓣不同發(fā)育時期形態(tài)Fig.1 Morphology at different development stages

表1 花瓣不同發(fā)育時期花色值變化Tab.1 The changes of petals color changes at different development stages

2.2 花瓣不同發(fā)育時期橫切結(jié)構(gòu)的變化

通過石蠟切片法觀察藤本月季‘安吉拉’花瓣橫切結(jié)構(gòu)，如圖2 所示?；ò隀M切結(jié)構(gòu)由上表皮、柵欄組織、海綿組織和下表皮四個部分組成，上表皮、柵欄組織和下表皮由一層細(xì)胞組成，細(xì)胞間排列較緊密，海綿組織由多層細(xì)胞組成，細(xì)胞間有間隙，其中分布有維管束。采用徒手切片法觀察不同發(fā)育時期花瓣結(jié)構(gòu)如圖3，大蕾期、露色期、初開期色素集中分布在上表皮和下表細(xì)胞中，盛開期部分海綿組織有色素分布。

小蕾期(圖2A)上表皮向外成圓形凸起，細(xì)胞排列緊密；柵欄組織間細(xì)胞排列緊密，構(gòu)成細(xì)胞形狀有差異；海綿組織無規(guī)則排列，多層，有明顯細(xì)胞空隙；下表皮細(xì)胞呈柱狀，細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞表面無明顯突起，細(xì)胞體積較上表皮細(xì)胞大。此時未見明顯色素分布(圖3A)。

大蕾期(圖2B)上表皮細(xì)胞有明顯圓錐狀突起，細(xì)胞體積增大；柵欄組織和海綿組織細(xì)胞體積開始增大；下表皮細(xì)胞體積縱向增長，花瓣厚度未見有明顯差異。上表皮和下表皮有明顯色素積累，顏色較淺。花瓣結(jié)構(gòu)與小蕾期無顯著差異(圖3B)。

露色期(圖2C)花瓣結(jié)構(gòu)與小蕾期、大蕾期結(jié)構(gòu)出現(xiàn)顯著差異。上表皮細(xì)胞向外凸起伸長呈乳突狀；柵欄組織和海綿組織排列疏松，細(xì)胞間存在明顯空隙；下表皮細(xì)胞體積增大，細(xì)胞表面無明顯突起。上表皮、下表皮細(xì)胞有明顯色素積累，顏色加深(圖3C)。

初開期(圖2D)花瓣厚度持續(xù)增加，上表皮細(xì)胞頂部開始萎縮，由較長的乳突狀變?yōu)楸馄降娜橥粻?；柵欄組織一層細(xì)胞，排列緊密程度降低；海綿組織細(xì)胞間隙增加；下表皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形狀、大小有差異。上表皮、下表皮細(xì)胞和柵欄組織均有明顯色素積累，且亮度較高(圖3D)。

盛開期(圖2E)花瓣厚度達(dá)到最大，上表皮細(xì)胞持續(xù)萎縮，柵欄組織與初開期相似，海綿細(xì)胞空隙進(jìn)一步增加，下表皮細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間無間隙。與初開期細(xì)胞結(jié)構(gòu)無明顯差異。此時細(xì)胞色素積累減少，顏色變淺(圖3E)。

凋花期(圖2F)花瓣厚度變薄，上表皮呈彎曲狀，細(xì)胞寬度增加，高度降低，僅基部緊密相連；無明顯柵欄組織，組成海綿組織的細(xì)胞基本破裂，細(xì)胞間隙變大；下表皮呈彎曲狀，細(xì)胞間排列仍保持緊密。上表皮、下表皮色素分布均不明顯(圖3F)。

注：A是小蕾期；B是大蕾期；C是露色期；D是初開期；E是盛開期；F是凋花期；UC是上表皮細(xì)胞；MC是中層細(xì)胞；BC是下表皮細(xì)胞；IS是細(xì)胞間隙；Pa是柵欄組織；Sp是海綿組織。 Note: A is bud stage; B is color changing stage; C is color exposing stage; D is initial opening stage; E is full opening stage; F is wilting stage; UC is upper epidermal cells; MC is middle cells; BC is below pidermal cells; IS is clearance between cells; Pa is palisade tissue; Sp is sponge tissue.圖2 花瓣不同發(fā)育時期橫切結(jié)構(gòu)變化Fig.2 Cross-sectional structure of petals at different development stages

注：A是小蕾期；B是大蕾期；C是露色期；D是初開期；E是盛開期；F是凋花期。Note: A is bud stage; B is color changing stage; C is color exposing stage; D is initial opening stage; E is full opening stage; F is wilting stage.圖3 花瓣不同發(fā)育時期表皮色素積累變化Fig.3 Changes in epidermal pigmentation at different development stages

花瓣不同發(fā)育時期厚度發(fā)生變化，見圖4。盛開期花瓣厚度最大為324.25 μm，顯著高于其他時期；小蕾期和大蕾期花瓣厚度變薄，分別為111.72 μm和115.98 μm，無顯著性差異。

注：a、b 和 c表示P≤0.05水平有顯著性差異；BS、CCS、CES、IOS、FOS和WS分別代表小蕾期，大蕾期，露色期，初開期，盛開期和凋花期。Note:a, b and c indicate significant difference at P≤0.05 level; BS, CCS, CES, IOS, FOS and WS represent stand for bud stage, color changing stage, color exposing stage, initial opening stage, full opening stage and wilting stage.圖4 花瓣不同發(fā)育時期厚度的變化Fig.4 Changes of petal thickness of Rosa ‘Angela’ at different development stages

2.3 花瓣不同發(fā)育時期上表皮、下表皮細(xì)胞形態(tài)及數(shù)目的變化

利用掃描電鏡法觀察花瓣不同發(fā)育時期的上表皮和下表皮外部形態(tài)，同時在3000×放大倍數(shù)下對花瓣上表皮細(xì)胞數(shù)目和下表皮細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計，如圖5。隨花瓣的發(fā)育，上表皮細(xì)胞和下表皮細(xì)胞不斷生長，體積持續(xù)增加，同一視野中上表皮細(xì)胞數(shù)目和下表皮細(xì)胞數(shù)目均呈下降趨勢，上表皮細(xì)胞體積較小，其數(shù)目均明顯多于下表皮細(xì)胞。

圖6所示花瓣不同發(fā)育時期上表皮和下表皮結(jié)構(gòu)?；ò杲S面和遠(yuǎn)軸面表皮細(xì)胞形態(tài)完整且排列規(guī)則，但表皮細(xì)胞大小、形狀存在差異。

注：a、b 和 c表示上表皮細(xì)胞P≤0.05水平有顯著性差異；A、B和C表示下表皮細(xì)胞P≤0.05水平有顯著性差異；BS、CCS、CES、IOS、FOS和WS分別代表小蕾期，大蕾期，露色期，初開期，盛開期和凋花期。 Note: a, b and c indicate significant difference at P≤0.05 level of UC; A, B and C indicate significant difference at P≤0.05 level test of BC; BS, CCS, CES, IOS, FOS and WS represent stand for bud stage, color changing stage, color exposing stage, initial opening stage, full opening stage and wilting stage.圖5 花瓣不同發(fā)育時期表皮細(xì)胞數(shù)目的變化Fig.5 Changes of epidermal cells number of Rosa ‘Angela’ at different development stage

小蕾期花瓣上表皮細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形，細(xì)胞間排列緊密，細(xì)胞表面微微隆起，細(xì)胞表面有不規(guī)則條紋褶皺，細(xì)胞間無空隙，細(xì)胞體積較小。下表皮細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞邊緣出現(xiàn)波紋狀條紋，細(xì)胞間無明顯差異。

注：A是上表皮結(jié)構(gòu)3 000×倍數(shù)，B是上表皮結(jié)構(gòu)10 000×倍數(shù)，C是下表皮結(jié)構(gòu)3 000×倍數(shù)，D是下表皮結(jié)構(gòu)10 000×倍數(shù)。Note: A is upper epidermal structure at 3000×multiple, B is upper epidermal structure 10000×multiple, C is below epidermal structure at 3000×multiple, D is below epidermal structure at 10000×multiple.圖6 花瓣不同發(fā)育時期表皮結(jié)構(gòu)變化Fig.6 Petal epidermal structure at different development stages

大蕾期花瓣上表皮細(xì)胞開始向上伸長，頂部扁平呈穹頂型，細(xì)胞表面光滑，細(xì)胞間無間隙，細(xì)胞體積開始增大。下表皮細(xì)胞呈不規(guī)則多邊形狀，細(xì)胞邊緣出現(xiàn)不規(guī)則褶皺，細(xì)胞間無明顯差異。

露色期花瓣上表皮細(xì)胞頂部持續(xù)向上伸長，細(xì)胞頂端出現(xiàn)明顯褶皺且細(xì)胞呈乳突狀，細(xì)胞體積持續(xù)增加。下表皮細(xì)胞中部開始向下凹陷，表面形成明顯的網(wǎng)狀突起，細(xì)胞表面布滿褶皺，細(xì)胞邊緣輪廓清晰。

初開期花瓣上表皮細(xì)胞呈乳突狀，細(xì)胞頂端褶皺加深，細(xì)胞飽滿且體積持續(xù)增加，部分細(xì)胞尖端開始變扁平。下表皮細(xì)胞中部持續(xù)向下凹陷且褶皺逐漸加深，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)與露色期無明顯差異。

盛開期花瓣上表皮細(xì)胞尖端扁平，表面的褶皺紋路變少，細(xì)胞出現(xiàn)萎縮。下表皮細(xì)胞形狀與露色期和初開期無明顯差異，但部分細(xì)胞體積開始變小。

凋花期花瓣上表皮細(xì)胞皺縮嚴(yán)重，細(xì)胞體積縮小。下表皮細(xì)胞網(wǎng)狀凸起變扁平，褶皺減少甚至消失。

2.4 花瓣不同發(fā)育時期色素含量的變化

花瓣不同發(fā)育時期類黃酮和花色苷含量的變化如圖7。小蕾期和大蕾期隨花瓣發(fā)育類黃酮含量相同，均為6.82 mg/g，初開期至凋花期花瓣類黃酮含量呈顯著下降趨勢，分別為5.47、4.52和3.43 mg/g?；ㄉ蘸砍尸F(xiàn)先增加再降低的規(guī)律，小蕾期花色苷含量最低，為132.82 μg/g，隨著花瓣發(fā)育花色苷含量顯著升高，初開期花色苷含量最高，為2 124 μg/g，顯著高于其他時期，盛開期和凋花期花色苷含量顯著下降，分別為1 589.17 μg/g和1 150.46 μg/g。

注：a、b 和 c表示P≤0.05水平有顯著性差異；BS、CCS、CES、IOS、FOS和WS分別代表小蕾期，大蕾期，露色期，初開期，盛開期和凋花期。Note:a, b and c indicate significant difference at P≤0.05 level; BS, CCS, CES, IOS, FOS and WS represent stand for bud stage, color changing stage, color exposing stage, initial opening stage, full opening stage and wilting stage.圖7 花瓣不同發(fā)育時期類黃酮和花色苷含量的變化Fig.7 Changes of flavonoids and anthocyanins contents of Rosa ‘Angela’ at different development stages

花瓣不同發(fā)育時期類胡蘿卜素和葉綠素含量的變化見圖8?；ò臧l(fā)育過程中葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量變化規(guī)律相似，均呈逐漸下降的趨勢。小蕾期達(dá)到最高，且顯著高于其他時期，盛開期和凋花期之間無顯著性差異。

2.5 花瓣不同發(fā)育時期各指標(biāo)間相關(guān)性分析

利用SPSS22.0對各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果見表2和表3。花瓣a*值與b*值、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素、類胡蘿卜素存在負(fù)相關(guān)關(guān)系?；ò赀h(yuǎn)軸面a*值與花色苷表現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系，而與上表皮細(xì)胞數(shù)目呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。花色苷含量與花瓣厚度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與類胡蘿卜素、葉綠素a和總?cè)~綠素含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。類黃酮含量和花瓣近軸面b*值呈正相關(guān)關(guān)系，與上表皮細(xì)胞數(shù)目呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。類胡蘿卜素與總?cè)~綠素存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99。上表皮細(xì)胞數(shù)目、下表皮細(xì)胞數(shù)目與花瓣中類黃酮、類胡蘿卜素、總?cè)~綠素等呈正相關(guān)關(guān)系?；ò昙t色的程度與細(xì)胞數(shù)目和花色苷含量呈顯著正相關(guān)，而花瓣黃綠色程度則與類黃酮、類胡蘿卜素和總?cè)~綠素含量呈顯著正相關(guān)。

注：a、b 和 c表示P≤0.05水平有顯著性差異；BS、CCS、CES、IOS、FOS和WS分別代表小蕾期，大蕾期，露色期，初開期，盛開期和凋花期。 Note: a, b and c indicate significant difference at P≤0.05 level; BS, CCS, CES, IOS, FOS and WS represent stand for bud stage, color changing stage, color exposing stage, initial opening stage, full opening stage and wilting stage.圖8 花瓣不同發(fā)育時期類胡蘿卜素和葉綠素含量的變化Fig.8 Changes of chlorophyll and carotenoid contents of Rosa ‘Angela’ at different development stages

表2 花瓣發(fā)育過程中各指標(biāo)與近軸面花色的相關(guān)分析Tab.2 Correlation coefficients among different physiological and biochemical indexes of back petals

表3 花瓣發(fā)育過程中各指標(biāo)與遠(yuǎn)軸面花色的相關(guān)分析Tab.3 Correlation coefficients among different physiological and biochemical indexes of front petals

3 討 論

3.1 花色與花瓣結(jié)構(gòu)的關(guān)系

該研究發(fā)現(xiàn)藤本月季‘安吉拉’花色隨花瓣發(fā)育上表皮、下表皮細(xì)胞形態(tài)及色素分布發(fā)生相應(yīng)變化：小蕾期和大蕾期花瓣上表皮平整光滑，表皮細(xì)胞體積較小，邊緣出現(xiàn)波紋狀條紋，可反射更多光線，上表皮、下表皮均無明顯的色素分布，花瓣亮度較高，L*值顯著高于其他時期；露色期和初開期花瓣上表皮細(xì)胞體積和厚度逐漸增大，向外的凸起伸長呈乳突狀，下表皮細(xì)胞向外形成網(wǎng)狀突起，并布滿條狀褶皺，上表皮、下表皮有明顯的色素分布，且上表皮色素積累多于下表皮，可吸收更多的入射光線，從而使花瓣顏色加深，此時a*值顯著高于其他時期，顏色為深粉色；盛開期和凋花期花瓣上表皮、下表皮細(xì)胞凸起降低，下表皮細(xì)胞近扁平，上表皮、下表皮色素分布不明顯，且花瓣海綿細(xì)胞出現(xiàn)色素，此時a*值逐漸下降，顏色為淺粉色。

花瓣色素的分布影響花色的變化，花瓣色素一般存在于上表皮、下表皮細(xì)胞，不同植物花瓣的色素分布存在明顯差異[12]。陳建等[13]研究發(fā)現(xiàn)非洲菊花色素主要分布在花瓣上表皮細(xì)胞、下表皮細(xì)胞和柵欄組織；岳娟[14]發(fā)現(xiàn)色素主要分布在花瓣表皮和柵欄組織，認(rèn)為花瓣中色素的分布位置對花色的形成和呈現(xiàn)產(chǎn)生影響；程怡等[8]發(fā)現(xiàn)色素集中分布在月季 ‘仙境’上表皮和柵欄組織的上部，且上表皮顏色較下表皮深，與該試驗中色素分布規(guī)律相似。

花瓣上表皮、下表皮細(xì)胞的形狀及數(shù)目影響花色的變化，劉石泉等[15]認(rèn)為當(dāng)花瓣上表皮細(xì)胞向外呈乳突狀時可促進(jìn)入射光的吸收，從而使花色加深，形成紅色；下表皮細(xì)胞呈扁平狀，可反射入射光，使花色變淺。陳建等[13]發(fā)現(xiàn)非洲菊花瓣上表皮細(xì)胞圓錐形結(jié)構(gòu)表面反射入射光對花色的影響隨著色素含量的增加而增大；岳娟[14]發(fā)現(xiàn)花瓣上表皮細(xì)胞尖錐形凸起使花色更深；NODA等[16]通過Myb基因組調(diào)控表皮細(xì)胞形狀，從而改變金魚草花色深淺。YOSHIDA等[17]發(fā)現(xiàn)花菖蒲紫色會隨花瓣表皮細(xì)胞的長度以及排列順序而發(fā)生變化。安田齊[4]發(fā)現(xiàn)紅色薔薇上表皮、下表皮變化可改其花色深淺，與該研究結(jié)果相似。

3.2 花色與色素種類及含量的關(guān)系

花色素是影響花色變化的主要因素，由類黃酮(含黃酮、黃酮醇、查爾酮和花色苷)、類胡蘿卜素和生物堿決定。藤本月季‘安吉拉’花色受到不同色素種類和含量的影響，小蕾期及大蕾期花色主要呈黃綠色，類黃酮、葉綠素和類胡蘿卜素顯著高于其他時期；進(jìn)入露色期后，花瓣開始變紅，花色苷顯著增加，類黃酮、葉綠素和類胡蘿卜素含量開始下降；初開期后，花色苷含量達(dá)到最高，隨后花瓣紅色逐漸減退。盛開期和凋花期后，花色苷、類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素含量均呈逐漸下降趨勢?；ò挈S綠程度與類黃酮、類胡蘿卜素和葉綠素含量呈顯著正相關(guān)，花瓣紅色程度與花色苷含量呈顯著正相關(guān)。

花色苷是花色素組成成分之一，在花瓣中含量較少，主要控制紅色系花色的形成，隨花色苷的增加，花色逐漸由紅色向紫色和黑色轉(zhuǎn)變[4, 17]。程怡等[8]對月季‘仙境’花色變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)花色苷是近軸面花色的主要決定因素。陳小紅等[18]證明花色苷是影響鴛鴦茉莉花色變化的決定性代謝產(chǎn)物。與該研究中花色苷與花瓣近軸面a*值具有極顯著的相關(guān)關(guān)系結(jié)果相符。

類黃酮是組成花色素的重要成分，主要包括黃酮、查爾酮及橙酮，是影響黃色系花形成的原因之一[4]，類黃酮類化合物可通過共色作用與花色苷一起呈現(xiàn)增色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象[19]。鐘培星等[20]發(fā)現(xiàn)芍藥開花過程中黃酮含量升高，花青苷含量減少是花瓣紅色減退的主要原因。張楊青慧等[21]發(fā)現(xiàn)菊花花瓣顏色在未變紅時，花瓣中僅檢測出類黃酮化合物特征吸收峰，說明菊花花瓣黃色由類黃酮決定，這與該研究中b*值與類黃酮呈正相關(guān)關(guān)系相符。

類胡蘿卜素主要決定花的黃色和橙色[22]，葉綠素參與植物光合作用，主要使葉片呈綠色[23]。類胡蘿卜素的顏色常被葉綠素所掩蓋，但在植物發(fā)育的后期，其色彩逐漸顯現(xiàn)，可增強花瓣顏色[24]。類胡蘿卜素積累能改變桂花花瓣的a*值[25]，同時是黃色菊花的主要顯色物質(zhì)[26]，通過調(diào)節(jié)類胡蘿卜素異構(gòu)酶能夠有效改變金盞花花瓣顏色[27]。該試驗中類胡蘿卜素和葉綠素和b*值有顯著相關(guān)關(guān)系，說明類胡蘿卜素和葉綠素對‘安吉拉’小蕾期花瓣黃綠色有顯著影響，與前人研究相符。

月季開花過程中花色變化十分復(fù)雜，不僅與花色素的種類、積累和分布、花瓣結(jié)構(gòu)的變化有相關(guān)關(guān)系，還會受到細(xì)胞pH、環(huán)境變化和基因調(diào)控等因素的影響，有關(guān)月季的花色形成機(jī)制及相關(guān)影響因子還有待進(jìn)一步研究。