馬維彩，何學(xué)柏#，孫英健，李本勝，張彩榮，芮國(guó)紅，李煥榮*，李秋明*

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101206)

雞球蟲病是由一種或多種艾美耳球蟲感染引起的腸道疾病[1]，其中毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)易感染 56～126日齡的雞，發(fā)病率和死亡率最高可達(dá)80%[2]，患病雞主要表現(xiàn)食欲下降、血便、飼料轉(zhuǎn)化率降低、生長(zhǎng)發(fā)育受阻，蛋雞產(chǎn)蛋量下降[3]。 據(jù)估計(jì)2016年全球雞球蟲病的名義經(jīng)濟(jì)成本超過了10.4億英鎊，主要包括治療、死亡和控制成本[4]。從20世紀(jì)40年代開始，幾種磺胺類藥物被用作抗球蟲藥物，隨后又推出一系列合成和離子載體藥物產(chǎn)品[5]。雖然抗球蟲藥物在控制球蟲病方面發(fā)揮了巨大作用, 但由于抗球蟲藥物的長(zhǎng)期使用,導(dǎo)致針對(duì)不同抗球蟲藥物的耐藥性球蟲的出現(xiàn),從而引起了越來越嚴(yán)重的抗球蟲藥物耐藥性問題[6]。而近年來由于耐藥蟲株的產(chǎn)生及抗球蟲藥限制使用等規(guī)定[7]，使得球蟲病的防治再次陷入困境。相對(duì)抗球蟲藥而言，雞球蟲疫苗是預(yù)防雞球蟲病最理想的一種方法，具有操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)。隨著球蟲強(qiáng)毒苗廣泛的使用，逐漸出現(xiàn)如安全性差、免疫反應(yīng)大和影響生產(chǎn)性能等難以克服的缺點(diǎn)，進(jìn)而研究人員通過壓力選擇研制卵囊排出最小潛在期縮短或裂殖生殖缺失一代最終導(dǎo)致毒力相對(duì)減弱的早熟蟲株疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，早熟株疫苗具有穩(wěn)定、高效、對(duì)動(dòng)物生產(chǎn)性能影響較小，可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫力和保護(hù)力等優(yōu)點(diǎn)。該研究通過毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)早熟株對(duì)雞進(jìn)行2次免疫，然后在雞不同日齡接種毒害艾美耳球蟲親本株，檢測(cè)免疫相關(guān)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)抗球蟲效果，為獲得安全和有效的雞球蟲疫苗株提供試驗(yàn)參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1日齡雞購(gòu)自北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，鹽酸氨丙啉購(gòu)自惠康動(dòng)物藥業(yè)有限公司，毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)親本株和毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)早熟株由北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院球蟲實(shí)驗(yàn)室保存。試驗(yàn)已通過北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物福利與倫理審查，編號(hào)BUA2021040。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)雞分組和免疫處理 無(wú)球蟲條件下育1日齡雞備用，取4日齡健康、體質(zhì)量50～70 g雞隨機(jī)分為對(duì)照組、鹽酸氨丙啉添加組、一免組和二免組，每組50只雞地面飼養(yǎng)，試驗(yàn)期81 d。對(duì)照組、免疫組(免疫組包括一免組和二免組)雞飼喂基礎(chǔ)日糧，鹽酸氨丙啉添加組雞按照藥物說明全程基礎(chǔ)日糧加鹽酸氨丙啉拌服。采用的日糧為無(wú)抗生素添加的基礎(chǔ)日糧(表1)。一免組雞4日齡一免，劑量1 000個(gè)/只毒害艾美耳球蟲早熟株孢子化卵囊；二免組雞53日齡二免，劑量200個(gè)/只毒害艾美耳球蟲早熟株孢子化卵囊。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平Tab.1 Composition and nutritional level of the basic diet

在雞25日齡、53日齡、74日齡時(shí)從地面飼養(yǎng)的各組隨機(jī)抽取6只雞移到籠上飼養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置紅對(duì)照組(雞不免疫不喂藥僅攻毒)?；\養(yǎng)雞除對(duì)照組外，其他試驗(yàn)組雞均攻毒，攻毒方法為逐只雞經(jīng)口接種毒害艾美耳球蟲親本株(10×104個(gè)孢子化卵囊/只)。免疫組雞自免疫后第7天每天檢測(cè)每克糞便中的卵囊數(shù)(oocyst per gram，OPG)，直到試驗(yàn)結(jié)束。

1.2.2 飼養(yǎng)管理 雞飼養(yǎng)在北京農(nóng)學(xué)院雞球蟲實(shí)驗(yàn)室，試驗(yàn)前對(duì)雞舍進(jìn)行全面沖刷、消毒。飼養(yǎng)期間，自然光照加人工補(bǔ)光，光照強(qiáng)度30 Lx，1～7日齡每天光照24 h，8日齡后每天光照23 h、黑暗1 h。雞舍溫度第1天到第7天33～35 ℃，之后每7 d下降2 ℃，至25 ℃不再下降。每天定時(shí)飼喂1次，自由采食、自由飲水，注意雞舍衛(wèi)生及合理通風(fēng)。

1.2.3 相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)的測(cè)定 試驗(yàn)期間肉眼觀察和記錄各組雞的精神狀態(tài)、采食、飲水、活動(dòng)狀況及糞便情況，并在雞25日齡、53日齡、74日齡攻毒當(dāng)天和攻毒后第7天稱取體質(zhì)量，計(jì)算雞相對(duì)體增質(zhì)量、存活率、小腸病變記分、小腸病變記分減少率(reduction in lesion scores，RLS)、卵囊數(shù)、卵囊減少率和抗球蟲指數(shù)(anticoccidiosis index，ACI)。

平均體增質(zhì)量=平均終期體質(zhì)量―平均初期體質(zhì)量

相對(duì)平均體增質(zhì)量率=試驗(yàn)組雞平均體增質(zhì)量/對(duì)照組雞平均體增質(zhì)量×100%

(1)

存活率=組內(nèi)存活雞只數(shù)/試驗(yàn)前組內(nèi)總雞只數(shù)×100%

采用麥克馬斯特氏計(jì)數(shù)法計(jì)算每克盲腸糞便卵囊數(shù)，根據(jù)陳春林等[8]提供的方法對(duì)卵囊值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

卵囊減少率=(紅對(duì)照組卵囊平均產(chǎn)量-試驗(yàn)組卵囊平均產(chǎn)量)/紅對(duì)照組卵囊平均產(chǎn)量×100%

(2)

小腸病變記分按文獻(xiàn)[9]標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。

病變值=各組雞小腸平均病變記分×10

小腸病變記分減少率=(紅對(duì)照組小腸平均病變記分-試驗(yàn)組小腸平均病變記分)/紅對(duì)照組小腸平均病變記分×100%

(3)

公式(1)和(2)及(3)中試驗(yàn)組分別指鹽酸氨丙啉添加組、一免組和二免組。

抗球蟲指數(shù)(ACI)=(存活率+相對(duì)平均體增質(zhì)量率)×100%―(病變值+卵囊值)。

其判定標(biāo)準(zhǔn)[10]ACI<120為療效差，120≤ACI<160為療效中等，160≤ACI<180為療效良好，ACI≥180為療效優(yōu)秀。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Graph pad Prism 8.0軟件One-Way ANOVA分析組間差異，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后的臨床表現(xiàn)

肉眼觀察試驗(yàn)期間雞狀態(tài)和25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后5～7 d血便情況。整個(gè)試驗(yàn)期間對(duì)照組雞精神狀態(tài)良好，采食、飲水正常，被毛整齊，未出現(xiàn)任何臨床癥狀。25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后第4天，紅對(duì)照組雞開始出現(xiàn)精神萎靡、食欲不佳、飲水下降、扎堆，第5天到第7天出現(xiàn)血便連片；攻毒后第7天其中53日齡雞出現(xiàn)死亡；25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后第5天，鹽酸氨丙啉添加組雞表現(xiàn)精神萎靡、扎堆、飲水和食欲均下降，并出現(xiàn)大量血便；25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后一免組和二免組雞食欲與飲水稍微下降、雞只出現(xiàn)少量血便，至第6天逐漸恢復(fù)正常。

2.2 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后對(duì)體質(zhì)量的影響

25日齡、53日齡、74日齡雞攻毒后第7天，鹽酸氨丙啉添加組和免疫組雞平均體增質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組但顯著或極顯著高于紅對(duì)照組，二免組高于一免組(圖1)；免疫組和鹽酸氨丙啉添加組相比，25日齡雞攻毒后免疫組平均體增質(zhì)量明顯高于鹽酸氨丙啉添加組，在53日齡和74日齡雞攻毒后免疫組平均體增質(zhì)量顯著低于鹽酸氨丙啉添加組。

2.3 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后的免疫保護(hù)

毒害艾美耳球蟲早熟株免疫后雞的存活率、小腸病變記分、小腸病變記分減少率和抗球蟲指數(shù)見表2。試驗(yàn)周期內(nèi)除53日齡雞攻毒后紅對(duì)照組有2只雞死亡外，其余各組雞均無(wú)死亡；免疫組雞小腸平均病變記分均低于紅對(duì)照組，小腸病變記分減少率高于紅對(duì)照組，其中二免組不同日齡雞(25日齡、53日齡、74日齡)攻毒后雞小腸平均病變記分均低于一免組，小腸病變記分減少率均高于一免組，且74日齡雞攻毒后小腸病變記分減少率最高；不同日齡雞攻毒后鹽酸氨丙啉添加組和免疫組抗球蟲指數(shù)極顯著高于紅對(duì)照組，雞在25日齡攻毒后免疫組抗球蟲指數(shù)高于鹽酸氨丙啉添加組，但在53日齡和74日齡攻毒后免疫組的抗球蟲指數(shù)低于鹽酸氨丙啉添加組，然而二免組不同日齡雞抗球蟲指數(shù)均高于145且高于一免組，即二免組雞抗球蟲效果達(dá)到中效水平。

注：與對(duì)照組相比，#表示差異顯著(P<0.05)，##表示差異極顯著(P<0.01)；紅對(duì)照組與其他組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。Note: Compared with the control group,# indicates significant difference (P<0.05), ## indicates extremely significant difference (P<0.01); Compared with the red control group , * indicates significant difference (P<0.05), ** indicates extremely significant difference (P<0.01). 圖1 不同日齡雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株體質(zhì)量變化Fig.1 The weight gain of chicks immunized Eimeria necatrix precocious strains with different days

表2 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后的免疫保護(hù)Tab.2 The immune protection of chickens immunized with precocious strains of Eimeria necatrix

2.4 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后對(duì)卵囊產(chǎn)出的影響

采用麥克馬斯特氏計(jì)數(shù)法計(jì)算雞每克盲腸糞便中的卵囊數(shù)(表3)。在不同日齡攻毒后紅對(duì)照組雞卵囊數(shù)均顯著高于鹽酸氨丙啉添加組和免疫組，其中25日齡攻毒后免疫組雞卵囊數(shù)均明顯低于鹽酸氨丙啉添加組，53日齡攻毒后免疫組雞卵囊數(shù)均顯著高于鹽酸氨丙啉添加組，74日齡攻毒后免疫組雞卵囊數(shù)極高于鹽酸氨丙啉添加組且一免組高于二免組；免疫組25日齡雞卵囊減少率極顯著高于鹽酸氨丙啉添加組且高達(dá)85%以上，免疫組53日齡和74日齡雞卵囊減少率低于鹽酸氨丙啉添加組，但二免組74日齡雞卵囊減少率高于一免組且高達(dá)90%。

感染毒害艾美耳球蟲后第7天到第81天一免組與二免組雞排出糞便中卵囊數(shù)變化情況見圖2。在感染后的第128 小時(shí)各感染組雞糞便中均檢測(cè)到卵囊，一免組和二免組雞在7～56 d間雞卵囊排出量變化不大，在60～77 d間二免組雞卵囊排出量明顯高于一免組，且在65 d雞排出卵囊量出現(xiàn)小高峰。表明2次人工免疫可延長(zhǎng)卵囊排出時(shí)間,即延長(zhǎng)免疫保護(hù)時(shí)間。

表3 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后對(duì)卵囊產(chǎn)出的影響Tab.3 The production of coccidial oocysts from chickens immunized with Eimeria necatrix precocious strain

圖2 雞免疫毒害艾美耳球蟲早熟株后的卵囊數(shù)變化Fig.2 Changes of oocyst numbers in chickens immunized with Eimeria necatrix precocious strain

3 討 論

不同種艾美耳球蟲誘導(dǎo)的免疫強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間因其生物學(xué)特性和免疫方法的不同而不同，在7種雞艾美耳球蟲中毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)力最弱，至少需要3個(gè)生命周期才能逐步建立對(duì)致病性毒害艾美耳球蟲的免疫保護(hù)[11]。該試驗(yàn)采用毒害艾美耳球蟲早熟株2次免疫雞(4日齡一免，53日齡二免)，并于免疫后3次接種毒害艾美耳球蟲親本株(25日齡、53日齡、74日齡)，通過檢測(cè)免疫保護(hù)相關(guān)指標(biāo)評(píng)價(jià)毒害艾美耳球蟲早熟株對(duì)雞的免疫效果。在25日齡、53日齡、74日齡攻毒后，免疫組雞表現(xiàn)較強(qiáng)的免疫保護(hù)力，即與紅對(duì)照組相比，相對(duì)體增質(zhì)量顯著升高、雞小腸病變記分顯著下降、盲腸糞便中卵囊數(shù)明顯減少。另外，與25日齡攻毒相比，53日齡攻毒后紅對(duì)照組雞出現(xiàn)死亡，相對(duì)體增質(zhì)量最低、腸道病變程度最嚴(yán)重和抗球蟲指數(shù)最低，這也表明53日齡左右是毒害艾美耳球蟲易感日齡；在74日齡攻毒后一免組雞無(wú)抗球蟲效果，二免組雞抗球蟲效果達(dá)中效，且二免組雞小腸病變記分和卵囊數(shù)低于前2次攻毒。

在研究雞球蟲早熟株的免疫效果時(shí), 羅鵬[12]和李瑞琪等[13]發(fā)現(xiàn)2次免疫的效果優(yōu)于只進(jìn)行1次免疫，與該試驗(yàn)結(jié)果相同。研究表明，雞體一免后其體內(nèi)產(chǎn)生的抗體可在一段時(shí)間內(nèi)提供足夠的免疫保護(hù)力[13]，但是體內(nèi)抗體會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低以至于消失，為了使機(jī)體內(nèi)的抗體水平恢復(fù)，則需要在合適時(shí)間進(jìn)行第2次免疫，從而延長(zhǎng)免疫保護(hù)力。該試驗(yàn)選擇一免后第49天(53日齡)進(jìn)行二免，二免組雞獲得良好的免疫力。球蟲病康復(fù)雞對(duì)再感染球蟲有抵抗力，但若缺乏再次感染，隨飼養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)雞對(duì)球蟲的免疫力會(huì)減弱，這是因?yàn)槊庖叽螖?shù)少產(chǎn)生免疫抗體滴度低，不能很好的預(yù)防球蟲病，而2次免疫可使抗體水平迅速提高，且免疫產(chǎn)生的抑制期較短[14]。有研究報(bào)道，雛雞在嚴(yán)格無(wú)球蟲的環(huán)境中飼養(yǎng)，免疫接種球蟲活卵囊后雞的免疫力隨著時(shí)間延長(zhǎng)而下降，但若再次免疫接種后免疫期將會(huì)延長(zhǎng)，免疫力亦有所增強(qiáng)[15]。事實(shí)上，雞球蟲免疫是一種典型的局部帶蟲免疫，卵囊的反復(fù)感染是形成免疫保護(hù)力的必要條件，且隨時(shí)間變化而呈現(xiàn)一定程度的波動(dòng)[11]。