唐運成，馬瑞，彭禹，羅明

十堰市太和醫(yī)院急診科，湖北省十堰442000

急性胰腺炎（acute pancreatitis， AP）的發(fā)生發(fā)展一直是外科領(lǐng)域的研究熱點［1］。在AP 的早期階段，胰蛋白酶激活、過量的氧自由基和促炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致腺泡細(xì)胞的損傷和死亡［2］。腺泡細(xì)胞的死亡形式包括凋亡、壞死和焦亡［3］。焦亡是一種由胱天蛋白酶（caspase）介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，在AP 的腺泡細(xì)胞中存在caspase-1 激活，提示焦亡與AP 有關(guān)［4］。miR-375 在AP 中會促進(jìn)腺泡細(xì)胞的炎癥反應(yīng)與凋亡［6］?；罨鞍證 （activated protein C，APC）是一種內(nèi)源性抗凝劑，具有抗血栓、纖溶和抗炎作用，且對AP 有治療效果［7］。目前，越來越多的長鏈非編碼核糖核酸被發(fā)現(xiàn)在AP 進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用［5］。但Opa 相互作用蛋白5-反義RNA 1 （Opa interacting protein 5-antisense RNA1， OIP5-AS1）在AP 中的作用尚不清楚。因此，本研究旨在探討OIP5-AS1 充當(dāng)miR-375 的競爭性內(nèi)源RNA 對胰腺腺泡細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用，為老年AP的診斷和治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑

Lipofectamine 3000 和TRIzol 試劑（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；miR-375 模擬物（mimic）、OIP5-AS1 過表達(dá)載體（pcDNA-OIP5-AS1）、靶向APC小干擾RNA （si-APC）及各自對照物（廣州云舟生物科技有限公司）；ELISA 和LDH 試劑盒（南京建成生物工程研究所）；FAM FLICA caspase-1 活性檢測試劑盒（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；實驗所有抗體（英國Abcam 公司）；PCR 引物（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）；雙熒光素酶基因檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；FISH 試劑盒（廣州伯信生物科技有限公司）；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 生物信息學(xué)分析

從NCBI 獲取GEO 芯片數(shù)據(jù)，選擇GSE42455 分析AP 的差異表達(dá)miRNA。通過miRWalk、RNA22 和StarBase 在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測miR-375 的上／下游靶點。DAVID 數(shù)據(jù)庫用于基因本體（gene ontology， GO）和京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）富集分析。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

大鼠胰腺腺泡AR42J 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。37℃、5%CO2條件下，于20%胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)AR42J 細(xì)胞。24 h 后，AR42J 細(xì)胞與100 nmol雨蛙素孵育0、4、8、12、24 h。用Lipofectamine 3000 將miR-375 mimic、pcDNA-OIP5-AS1 和si-APC轉(zhuǎn)染AR42J 細(xì)胞。24 h 后，加入100 nmol 雨蛙素處理AR42J 細(xì)胞24 h，刺激后提取RNA 或蛋白進(jìn)行后續(xù)分析。

細(xì)胞分為8 組：Control 組（AR42J 細(xì)胞不做任何處理）、Caerulein 組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激）、Caerulein+pcDNA-NC 組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激且轉(zhuǎn)染 pcDNA-NC）、 Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激且轉(zhuǎn)染pcDNA-OIP5-AS1）、 Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 + miR-NC 組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激且轉(zhuǎn)染pcDNA-OIP5-AS1和miR-NC）、Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 + miR-375 mimic 組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激且轉(zhuǎn)染pcDNAOIP5-AS1 和miR-375 mimic）、 Caerulein + pcDNAOIP5-AS1 +si-NC 組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激且轉(zhuǎn)染pcDNA-OIP5-AS1 和si-NC）、Caerulein + pcDNAOIP5-AS1 +si-APC組（AR42J 細(xì)胞經(jīng)雨蛙素刺激且轉(zhuǎn)染pcDNA-OIP5-AS1 和si-APC）。

1.4 ELISA［8］

培養(yǎng)基在雨蛙素處理24 h 后收集，根據(jù)ELISA 說明書測量促炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-18 （interleukin-18， IL-18）和IL-1β 的分泌。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)［9］

收集AR42J 細(xì)胞于FLICA 溶液中培養(yǎng)1 h，緩沖液洗滌3 次。以CytoFLEX 流式細(xì)胞儀分析信號，通過CytExpert2.3 分析數(shù)據(jù)，測定caspase-1 活性。

1.6 Western blot［10］

檢測NLR 家族pyrin 域蛋白3 （NOD-likereceptor family pyrin domain-containing protein 3， NLRP3）和消皮素D （gasdermin D， GSDMD）的蛋白表達(dá)。RIPA裂解液裂解AR42J 細(xì)胞，10% SDS-PAGE 分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉。4℃條件下，將膜與NLRP3 （1 ∶1000）、GSDMD （1 ∶1000）和caspase-1 （1∶1000）的一抗孵育過夜，洗滌后與二抗孵育2 h。GAPDH作為內(nèi)參，用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒和ImageJ 軟件定量分析蛋白條帶。

1.7 LDH 測定［11］

根據(jù)試劑盒說明書，測量雨蛙素刺激后AR42J 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH 的釋放。

1.8 實時熒光定量PCR （qRT-PCR）

使用TRIzol 試劑從培養(yǎng)的AR42J 細(xì)胞中分離總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并進(jìn)行PCR 擴增。U6 和GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)。見表1。

表1 引物序列

1.9 雙熒光素酶報告實驗

將含有miR-375 野生型（wild type， WT）或突變型（mutant， MUT）結(jié)合位點的OIP5-AS1 或APC3′UTR 片段擴增，并插入pMIR 報告熒光素酶報告載體，命名為OIP5-AS1-WT、OIP5-AS1-MUT、APC-WT 和APC-MUT。200 ng 熒光素酶報告載體和20 μmol miR-375 mimic 或?qū)φ瘴锸褂肔ipofectamine 3000 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。48 h 后，使用雙熒光素酶報告系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.10 FISH

室溫下，AR42J 細(xì)胞在4% 多聚甲醛中固定15 min，PBS 洗滌。用0.5%Triton X-100 在4℃下滲透細(xì)胞15 min。地高辛標(biāo)記的OIP5-AS1 探針或?qū)φ誇ISH 探針在55℃下培養(yǎng)AR42J 細(xì)胞4 h，并用2 ×PBS 洗滌10 min。HRP 標(biāo)記的地高辛二抗檢測信號，DAPI 用于核染色，采用激光共聚焦顯微鏡獲得圖像。

1.11 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 22. 0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2 組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測

AP 中15 個miRNA 顯著上調(diào)，16 個miRNA 顯著下調(diào)，根據(jù)既往研究［6］選擇miR-375 進(jìn)行后續(xù)分析。RNA22 在線靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站顯示，miR-375 和OIP5-AS1 存在特異性結(jié)合位點。在RNA22、StarBase 和miRWalk 獲取miR-375 的下游靶基因并取交集，共有1 172個交集靶基因。將這些靶基因通過DAVID 網(wǎng)站進(jìn)行GO 和KEGG 功能富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞增殖相關(guān)通路（GO：0008285）和干細(xì)胞相關(guān)通路（hsa04550）。將富集在這2 個通路中的基因取交集，交集結(jié)果為REST、APC、SMAD2、JARID2、LIF和KLF4。根據(jù)先前的研究［7］，選擇APC進(jìn)行后續(xù)分析。見圖1。

圖1 生物信息學(xué)工具預(yù)測結(jié)果

2.2 AP 細(xì)胞模型中OIP5-AS1、APC 和miR-375 的表達(dá)

在0、4、8、12、24 h 采用qRT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，AR42J 細(xì)胞中OIP5-AS1 和APC的水平隨刺激時間延長而逐漸降低，而miR-375 的水平隨刺激時間延長而逐漸升高。見圖2。

圖2 AP 細(xì)胞模型中OIP5-AS1、miR-375 和APC 的表達(dá)

2.3 過表達(dá)OIP5-AS1 減輕雨蛙素誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

與Caerulein 組比較，pcDNA-OIP5-AS1 轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了OIP5-AS1 的水平。過表達(dá)OIP5-AS1 能抑制IL-18和IL-1β 的分泌，減少LDH 的釋放，降低caspase-1 的活性，并抑制GSDMD、NLRP3 和caspase-1 的蛋白表達(dá)水平。提示過表達(dá)OIP5-AS1 可顯著減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞焦亡。見圖3。

圖3 過表達(dá)OIP5-AS1 減輕雨蛙素誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷

2.4 OIP5-AS1 與miR-375 存在靶向關(guān)系

FISH 結(jié)果顯示，OIP5-AS1 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。雙熒光素酶報告實驗證實了OIP5-AS1 和miR-375 的互作用關(guān)系，miR-375 mimic 可顯著抑制OIP5-AS1-WT的熒光活性。此外，雨蛙素刺激AR42J 細(xì)胞后miR-375 顯著上調(diào)，而過表達(dá)OIP5-AS1 后miR-375 顯著下調(diào)。見圖4。

2.5 過表達(dá)miR-375 可加重OIP5-AS1 減輕的細(xì)胞損傷

將pcDNA-OIP5-AS1 和miR-375mimic 共轉(zhuǎn)染AR42J 細(xì)胞，用雨蛙素刺激AR42J 細(xì)胞24 h。pcDNAOIP5-AS1 抑制的miR-375 在轉(zhuǎn)染miR-375 mimic 后顯著升高。炎性因子和LDH 水平測定結(jié)果顯示，過表達(dá)OIP5-AS1降低的 IL-18、 IL-1β 和 LDH 被 miR-375 mimic升高。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，過表達(dá)miR-375 顯著提高了caspase-1 的活性。此外，GSDMD、NLRP3 和 caspase-1 的蛋白水平在轉(zhuǎn)染 miR-375mimic 后顯著升高。表明過表達(dá)miR-375 可部分逆轉(zhuǎn)OIP5-AS1 減輕的雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞損傷。見圖5。

2.6 APC 是miR-375 的靶基因

miR-375 mimic 顯著降低APC-WT 的熒光素酶活性，證實了APC是miR-375 的靶基因。qRT-PCR 檢測顯示，AR42J 細(xì)胞中的APC在雨蛙素刺激后下調(diào)，過表達(dá)OIP5-AS1 后APC顯著上調(diào)，而過表達(dá)miR-375后APC再次下調(diào)。見圖6。

圖6 OIP5-AS1 是miR-375 的海綿

2.7 沉默APC 能部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)OIP5-AS1 對腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用

pcDNA-OIP5-AS1 顯著提高的APC水平在轉(zhuǎn)染si-APC后降低。ELISA 和LDH 檢測結(jié)果顯示，過表達(dá)OIP5-AS1 顯著抑制的IL-18、IL-1β 和LDH 在沉默APC后顯著升高。Caerulein + pcDNA-OIP5-AS1 +si-APC組的caspase-1 活性顯著升高。Western blot 結(jié)果顯示，pcDNA-OIP5-AS1 顯著降低了GSDMD、NLRP3 和caspase-1 的蛋白水平，而沉默APC部分逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果。表明OIP5-AS1 可通過上調(diào)APC的表達(dá)顯著減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞焦亡。見圖7。

圖7 沉默APC 能夠部分逆轉(zhuǎn)過表達(dá)OIP5-AS1 對腺泡細(xì)胞的保護(hù)作用

3 討論

雨蛙素是一種膽囊收縮素的類似物，用其誘導(dǎo)AP操作便捷且周期短，因此已成為目前AP 造模的最常用方式［12］。本研究采用雨蛙素刺激AR42J 細(xì)胞構(gòu)建AP 細(xì)胞模型，證實了OIP5-AS1 通過調(diào)控miR-375／APC軸進(jìn)而影響AP 進(jìn)展的作用。

既往研究表明，OIP5-AS1 對缺氧誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞／巨噬細(xì)胞炎癥和氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用［13］，在骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中也具有抗炎作用［14］。但OIP5-AS1 在AP 中的作用尚未報道。本次研究發(fā)現(xiàn)，雨蛙素處理AR42J 細(xì)胞后，OIP5-AS1 的表達(dá)呈時間依賴性降低，故將OIP5-AS1 過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染AR42J細(xì)胞探究OIP5-AS1 在AP 細(xì)胞模型中的作用。細(xì)胞焦亡過程具有caspase-1 依賴性，caspase-1 通過GSDMD 誘發(fā)焦亡，caspase-1 前體可與NLRP3 等模式識別受體結(jié)合為炎癥小體，隨后刺激細(xì)胞釋放炎性因子IL-8和IL-1β 等［15］。因此，本研究通過ELISA 檢測AR42J 細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-8 和IL-1β，結(jié)果顯示過表達(dá)OIP5-AS1 可顯著降低雨蛙素誘導(dǎo)升高的IL-8 和IL-1β。LDH 的釋放進(jìn)一步驗證細(xì)胞焦亡的發(fā)生［16］，過表達(dá)OIP5-AS1 顯著降低了LDH 的釋放。此外，雨蛙素顯著提高的caspase-1 活性被上調(diào)的OIP5-AS1 抑制，過表達(dá)OIP5-AS1 能顯著抑制焦亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。上述結(jié)果表明，OIP5-AS1 可有效抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J 細(xì)胞焦亡。

為驗證OIP5-AS1 在AP 進(jìn)展中的分子機制，本研究進(jìn)一步探究了其可能調(diào)控的靶點。既往研究表明，miR-375 在動脈粥樣硬化中異常高表達(dá)，可加重炎癥反應(yīng)［17］。qRT-PCR 檢測結(jié)果顯示，miR-375 在雨蛙素刺激的AR42J 細(xì)胞中上調(diào)，且OIP5-AS1 可負(fù)調(diào)控miR-375 的表達(dá)。此外，過表達(dá)miR-375 可促進(jìn)IL-8、IL-1β 和LDH 的釋放，激活caspase-1 的活性，并提高焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、NLRP3 和caspase-1 的表達(dá)，對OIP5-AS1 減輕的AR42J 細(xì)胞損傷起抑制作用。提示OIP5-AS1 可能通過下調(diào)miR-375 表達(dá)對AP 中的腺泡細(xì)胞起保護(hù)作用。

多種在線靶向關(guān)系預(yù)測網(wǎng)站篩選得到miR-375 的下游靶基因，對靶基因做GO 和KEGG 分析得到與AP進(jìn)展相關(guān)的細(xì)胞增殖通路。而干細(xì)胞近年來也被逐漸應(yīng)用于AP 的治療，因此將增殖和干細(xì)胞通路納入研究，對交集基因進(jìn)行分析后，將在AP 中有相關(guān)研究的APC作為本研究中miR-375 的靶基因［7］。APC作為一種抗凝血漿絲氨酸蛋白酶，具有很強的細(xì)胞保護(hù)和抗炎活性作用［18］。能保護(hù)胰腺免受損傷，改善疾病進(jìn)展［19］。本研究發(fā)現(xiàn)APC在雨蛙素誘導(dǎo)的AP 細(xì)胞模型中表達(dá)降低。APC是miR-375 的靶基因。過表達(dá)OIP5-AS1 可抑制IL-8、IL-1β 和LDH 的釋放，降低caspase-1 的活性，并降低焦亡相關(guān)蛋白GSDMD、NLRP3和caspase-1 的表達(dá)，而沉默APC可部分逆轉(zhuǎn)這一結(jié)果。提示沉默APC可加速AP 中腺泡細(xì)胞焦亡，OIP5-AS1 可能通過上調(diào)APC的表達(dá)，抑制AP 腺泡細(xì)胞焦亡。

本研究從腺泡細(xì)胞焦亡影響AP 進(jìn)展的角度首次發(fā)現(xiàn)，OIP5-AS1 通過海綿吸附miR-375 上調(diào)APC的表達(dá)，保護(hù)AP 中的腺泡細(xì)胞免受焦亡。OIP5-AS1／miR-375／APC有望作為有效作用靶點應(yīng)用于AP 的治療。