張慶芳， 王倩倩， 遲雪梅， 于 爽， 陳立功， 遲乃玉， 劉春瑩*

(1.大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116622)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, EC l.1.3.4, GOD)在分子氧存在下能氧化葡萄糖(glucose, Glu)生成D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時消耗氧生成過氧化氫，其催化過程或產(chǎn)物有去除葡萄糖、殺菌和脫氧作用，在畜牧養(yǎng)殖、水產(chǎn)、醫(yī)療及化工等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[1-2]。GOD廣泛分布于自然界生物體內(nèi)，已研究的GOD主要來源于霉菌和昆蟲[3-6]，細(xì)菌和酵母菌來源的GOD較少[7-12]。目前，隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，GOD酶活性檢測方法也在逐步創(chuàng)新和優(yōu)化，主要包括電化學(xué)法、靛紅褪色法和分光光度法等進(jìn)行GOD酶活性檢測[13-15]。電化學(xué)法通過測定酶促反應(yīng)中的電壓或電流的變化，推算酶活性[16-19]；靛紅褪色法利用催化生成的H2O2使靛藍(lán)胭脂紅褪色計算酶活性[20-23]。分光光度法是目前使用最多的GOD酶活性檢測方法，利用GOD-過氧化物酶-鄰聯(lián)茴香胺偶聯(lián)反應(yīng)，測定反應(yīng)后因物質(zhì)變化引起的吸光度的改變，進(jìn)而推算出GOD的酶活性[24-25]。該方法靈敏度高，試劑用量較少，但在本研究檢測過程中，發(fā)現(xiàn)該方法檢測GOD酶活性不穩(wěn)定，有時甚至測不出酶活性[21,26-27]。本研究對傳統(tǒng)分光光度法進(jìn)行改良，避免鄰聯(lián)茴香胺溶液中的乙醇破壞蛋白質(zhì)中原有的氫鍵，影響蛋白質(zhì)活性。目前，GOD研究主要存在兩大問題，一是研究對象多來自陸地環(huán)境，例如霉菌和昆蟲等，屬于中高溫酶，而對低溫GOD的研究較少[28-29]；二是對微生物來源的GOD的研究主要集中在霉菌和細(xì)菌，而以曲霉研究最多，對酵母菌來源的GOD研究較少[30-31]，尤其是海洋擔(dān)子菌屬來源的GOD的研究更少，已報道的只有劉春瑩等[32]從海洋中篩選到1株擔(dān)子菌。因此，研究海洋擔(dān)子菌來源的低溫GOD，對GOD資源庫的擴(kuò)充具有重要意義。本研究使用的菌株來自渤海海域海泥，是通過前期篩選得到的1株高產(chǎn)低溫GOD菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定確定其屬擔(dān)子菌屬(Basidioascussp.)，命名為Basidioascussp.LG-31，在前期實驗的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化。為海洋來源的低溫GOD研究及低溫GOD的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 菌株來自遼寧省海洋微生物工程中心實驗室，分離自遼寧大連渤海海域(123°371′E，39°697′N)，深度為25～30 m的海泥，命名為Basidioascussp.LG-31。

1.1.2 培養(yǎng)基 發(fā)酵/種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖60，蛋白胨3，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.7，KCl 0.5，NaNO34，pH 7.0。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 鄰聯(lián)茴香胺溶液、辣根過氧化物酶溶液、5%的葡萄糖溶液(自配)；D(+)-麥芽糖(BR)、發(fā)酵用麩皮(BR)、發(fā)酵用秸稈粉(BR)、玉米漿膏(BR)(北京奧博星生物科技有限公司)；D-甘露糖(Biotech Grade)、L-谷氨酸(BC Grade)、M-苯丙氨酸(AR)、N-乙酰-L-苯丙氨酸(AR)、無水肌酸(AR)(生工生物科技(上海)有限公司)；葡聚糖(AR)(中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司)；微晶纖維素(Tech Grade)、檸檬酸三銨(USP Grade)(BBI有限公司)；KNO3(AR)(天津市科米歐化學(xué)試劑有限公司)；NH4NO3(AR)(天津市雙船化學(xué)試劑廠)；NH4Cl(AR)(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；(NH4)2HPO4(AR)、(NH4)2SO4(AR)、乙酸銨(AR)(天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氨水(AR(25%))(天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司)。低溫恒溫培養(yǎng)箱(LTI-700，上海艾朗實驗設(shè)備有限公司)；恒溫?fù)u床(CRY-2112，上海艾朗實驗設(shè)備有限公司)；酶標(biāo)儀(Multiskan GO，賽默飛世爾科技(芬蘭)有限公司)；立式壓力蒸汽滅菌器(YXQ-LS-100SII，上海博訊工貿(mào)有限公司)；微量高速冷凍離心機(jī)(Biofuge fresco,賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(CR21N,日立(中國)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 酶活性測定 對傳統(tǒng)分光光度法進(jìn)行改良，避免了鄰聯(lián)茴香胺溶液中的乙醇破壞蛋白質(zhì)中原有的氫鍵，影響蛋白質(zhì)活性。①對照組：將鄰聯(lián)茴香胺溶液150 μL和辣根過氧化物酶溶液10 μL加入96孔板中，并于25 ℃保溫10 min，然后加入150 μL 5%葡萄糖溶液和30 μL粗酶液，立刻測OD460，3組平行實驗。②實驗組：將鄰聯(lián)茴香胺溶液150 μL和辣根過氧化物酶溶液10 μL加入96孔板中，25 ℃保溫10 min；將150 μL粗酶液和750 μL 5%葡萄糖溶液混合均勻后于30 ℃水浴保溫5 min，取180 μL保溫好的粗酶液與葡萄糖的混合溶液加入到鄰聯(lián)茴香胺-辣根過氧化物酶混合溶液中，振蕩反應(yīng)10 s，測OD460，3組平行實驗。酶活性單位(U)定義：在上述條件下，催化產(chǎn)生l μmol N-乙酰-D-氨基葡萄糖所需的酶量。酶活性計算公式：Y=[(A-A0)+C]/K×N/T/M。式中，Y：葡萄糖氧化酶活性(U/mL)；A：實驗組的吸光度；A0：對照組的吸光度；K：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；C：標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；N：酶液的總稀釋倍數(shù)；T：反應(yīng)時間(min)；M：酶液體積(mL)。

1.2.2 生長曲線和酶活性曲線測定方法 挑取菌株Basidioascussp. LG-31單菌落置于5 mL種子培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.55～0.60，作為測定生長曲線及酶活性曲線的種子液。以1%接種量接種菌株Basidioascussp.LG-31種子液于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每4 h取菌液測OD600吸光度，3組平行實驗，取平均值繪制生長曲線。以1%接種量接種菌株Basidioascussp.LG-31種子液于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，25 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每4 h取發(fā)酵液4 000 r/min離心，取上清于OD460處檢測酶活性，3組平行實驗，取平均值繪制酶活性曲線。

1.2.3 單因素優(yōu)化方法 ①碳源種類優(yōu)化：選取葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、甘油、發(fā)酵用麩皮、發(fā)酵用秸稈粉、D-甘露糖、葡聚糖、微晶纖維素、幾丁質(zhì)做為碳源。添加量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)為碳源6%，蛋白胨0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%(體積分?jǐn)?shù)，下同)，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。②蔗糖添加量優(yōu)化：蔗糖添加量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，蛋白胨0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。③有機(jī)氮源種類優(yōu)化：有機(jī)氮源分別為胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母浸粉、酵母膏、玉米漿膏、尿素、尿酸、乙酰胺、干酪素、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、N-乙酰-L-苯丙氨酸、無水肌酸，其添加量為0.3%，蔗糖4%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。④酵母粉添加量優(yōu)化：酵母粉添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%，蔗糖4%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。⑤無機(jī)氮源種類優(yōu)化：無機(jī)氮源分別為NaNO3、KNO3、NH4NO3、NH4Cl、(NH4)2SO4、氨水、(NH4)2HPO4、檸檬酸三銨、檸檬酸氫二銨、乙酸銨，其添加量0.4%，蔗糖4%，酵母粉0.3%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。⑥NaNO3添加量優(yōu)化：NaNO3添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%，蔗糖4%，酵母粉0.3%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。⑦KH2PO4添加量優(yōu)化：KH2PO4添加量分別為0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%、0.16%、0.18%、0.20%，蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，MgSO4·7H2O 0.07%，KCl 0.05%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。⑧KCl添加量優(yōu)化：KCl添加量分別為0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%，蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，MgSO4·7H2O 0.07%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。⑨MgSO4·7H2O添加量優(yōu)化：MgSO4·7H2O添加量分別為0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%，蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，KCl 0.1%，發(fā)酵溫度25 ℃，初始pH 7.0，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。⑩發(fā)酵初始pH優(yōu)化：蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，KCl 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，初始pH 3～11，發(fā)酵溫度25 ℃，裝液量100 mL/250 mL，接種量1%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。接種量優(yōu)化：蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，KCl 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，初始pH 7.0，發(fā)酵溫度25 ℃，裝液量100 mL/250 mL，接種量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。裝液量優(yōu)化：蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，KCl 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，初始pH 7.0，發(fā)酵溫度25 ℃，裝液量分別為25 mL/250 mL、50 mL/250 mL、75 mL/250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL、175 mL/250 mL、200 mL/250 mL，接種量2%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。發(fā)酵轉(zhuǎn)速優(yōu)化：蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，KCl 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，初始pH 7.0，發(fā)酵溫度25 ℃，裝液量125 mL/250 mL，接種量2%，分別于80、100、120、140、160、180、200、220 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性。發(fā)酵溫度優(yōu)化：蔗糖4%，酵母粉0.3%，NaNO30.4%，KH2PO40.02%，KCl 0.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，初始pH 7.0，發(fā)酵溫度分別為5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃，裝液量125 mL/250 mL，接種量2%，200 r/min培養(yǎng)28 h，于OD460處檢測酶活性，所有實驗均設(shè)3組平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線與酶活性曲線

如圖1標(biāo)準(zhǔn)曲線所示，OD460(y)與H2O2(x)含量之間的關(guān)系為y=0.005 2x+0.013 7，R2=0.997 4，大于0.99，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用。

圖1 酶活性標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 Standard curve of enzyme activity

菌株Basidioascussp.LG-31在25 ℃，200 r/min培養(yǎng)條件下，生長曲線和酶活性曲線如圖2所示。由生長曲線可知，菌株Basidioascussp. LG-31在0～16 h處于延滯期，生長繁殖緩慢，產(chǎn)酶量少；16 h后菌株生長進(jìn)入對數(shù)期，菌株生長繁殖加劇，發(fā)酵液菌體濃度迅速增加，這一階段GOD酶活性也快速升高，28 h時酶活性達(dá)到最高，為15.28 U/mL，而后酶活性迅速降低；約48 h時菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，此階段菌株代謝活動減慢，增殖速度隨之降低，發(fā)酵液菌體濃度相對穩(wěn)定，菌株產(chǎn)酶很少，基本無GOD酶活性；菌株生長進(jìn)入56 h后，緩慢進(jìn)入衰亡期，此階段菌株增殖速度小于死亡速度，可能因為發(fā)酵進(jìn)入此時期時，發(fā)酵液內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)消耗過多，不能滿足大量菌體生長繁殖需要。確定該菌株產(chǎn)酶最適培養(yǎng)時間為28 h。

圖2 菌株Basidioascuss sp. LG-31生長曲線與酶活性曲線Fig.2 Growth and enzyme activity curves of strain Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2 菌株Basidioascus sp.LG-31產(chǎn)GOD發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對菌株Basidioascussp.LG-31產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，蔗糖是該菌株生長產(chǎn)酶的最佳碳源，可溶性淀粉、葡聚糖對菌株產(chǎn)酶有較好的誘導(dǎo)作用，葡萄糖、乳糖、甘油、發(fā)酵用麩皮、發(fā)酵用秸稈粉及D-甘露糖有一定的誘導(dǎo)產(chǎn)酶能力。麥芽糖、微晶纖維素和幾丁質(zhì)不能誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶。

圖3 不同碳源對菌株Basidioascus sp.LG-31酶活性的影響Fig.3 Effects of different carbon sources on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2.2 蔗糖添加量對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖4可知，當(dāng)蔗糖添加量為2%時，菌株酶活性最高，隨著蔗糖添加量的增加，菌株酶活性降低。因此，確定最佳蔗糖添加量為4%。

圖4 蔗糖添加量對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.4 Effect of sucrose addition on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2.3 不同有機(jī)氮源對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖5可知，酵母粉是該菌株生長產(chǎn)酶的最佳有機(jī)氮源，與對照組相比，胰蛋白胨、乙酰胺、L-苯丙氨酸、無水肌酸對菌株酶活性均有促進(jìn)作用；其余有機(jī)碳源對菌株酶活性有抑制作用，尿素和L-谷氨酸抑制效果最強(qiáng)。

圖5 不同有機(jī)氮源對菌株Basidioascus sp.LG-31酶活性的影響Fig.5 Effects of different organic nitrogen sources on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2.4 酵母粉添加量對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖6可知，在一定濃度范圍內(nèi)，酵母粉添加量與葡萄糖氧化酶活性呈正比例關(guān)系；當(dāng)酵母粉添加量為0.3%時，菌株產(chǎn)葡萄糖氧化酶的酶活性達(dá)到最高，此后繼續(xù)增大酵母粉添加量，酶活性下降。當(dāng)酵母粉添加量在0.3%～0.6%時，對菌株酶活性影響不大。因此，確定酵母粉最佳添加量為0.3%。

圖6 酵母粉添加量對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.6 The effect of the added amount of yeast powder on the enzyme production of Basidioascus sp. LG-31 strain

圖7 不同無機(jī)氮源對Basidioascus sp.LG-31菌株酶活性的影響Fig.7 Effects of different inorganic nitrogen sources on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2.6 NaNO3添加量對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖8可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NaNO3添加量的增加，GOD酶活性升高，當(dāng)NaNO3添加量為0.4%時，酶活性最高，繼續(xù)增大NaNO3添加量，酶活性下降。因此，確定最佳NaNO3添加量為0.4%。

圖8 NaNO3添加量對菌株Basidioascus sp.LG-31產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of NaNO3 addition on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2.7 無機(jī)鹽添加量對菌株Basidioascussp.LG-31酶活性的影響 ① KH2PO4添加量優(yōu)化：由圖9可知，低濃度KH2PO4對菌株產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，當(dāng)KH2PO4添加量為0.02%時，菌株酶活性最高；隨著KH2PO4添加量的增加，酶活性下降。因此，確定最佳KH2PO4添加量為0.02%。② KCl添加量優(yōu)化:由圖10可知，KCl添加量為0.1%時，菌株酶活性最高，隨著KCl添加量的增加，酶活性緩慢下降，高濃度的KCl對菌株產(chǎn)酶抑制效果較強(qiáng)。最佳KCl添加量為0.10%。③ MgSO4·7H2O添加量優(yōu)化：由圖11可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著MgSO4·7H2O添加量的增加，葡萄糖氧化酶活性升高，當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.10%時，酶活性最高，繼續(xù)增大MgSO4·7H2O添加量，酶活性下降。因此，確定最佳MgSO4·7H2O添加量為0.10%。

2.2.8 初始發(fā)酵pH對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 如圖12所示，菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH越接近中性時酶活性越高，偏酸或偏堿都會影響菌株酶活性，當(dāng)pH為7.0時產(chǎn)酶活性最高。因此，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為7.0。

2.2.9 接種量對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 如圖13所示，接種量為2%時，GOD酶活性最高，當(dāng)接種量超過2%，GOD酶活性隨著接種量的增大急劇降低，可能是因為接種量濃度過大，培養(yǎng)基中菌體生長產(chǎn)酶所需的氧氣消耗加劇，不能滿足其正常的生長產(chǎn)酶需要。因此，確定最適接種量為2%。

圖9 KH2PO4添加量對菌株Basidioascus sp.LG-31酶活性的影響Fig.9 Effects of KH2PO4 addition on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

圖10 KCl添加量對菌株Basidioascus sp.LG-31酶活性的影響Fig.10 Effects of KCl addition on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

圖11 MgSO4·7H2O添加量對菌株Basidioascuss sp. LG-31酶活性的影響Fig.11 Effects of MgSO4·7H2O addition on enzyme production by Basidioascus sp. LG-31 strain

圖12 初始發(fā)酵pH對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.12 The effect of initial fermentation pH on enzyme production of Basidioascus sp. LG-31 strain

圖13 接種量對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.13 Influence of inoculation amount on enzyme production of Basidioascus sp. LG-31 strain

2.2.10 裝液量對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖14可知，當(dāng)裝液量為125 mL/250 mL時，菌株酶活性最高，增加或減少裝液量都會使GOD酶活性降低。因此，確定最適裝液量為125 mL/250 mL。

2.2.11 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖15可知，轉(zhuǎn)速較低時，菌株酶活性隨著轉(zhuǎn)速的增加而增高，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時，酶活性達(dá)到最高值。因此，確定最適轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.2.12 發(fā)酵溫度對菌株Basidioascussp. LG-31酶活性的影響 由圖16可知，溫度過高或過低，都會影響菌株產(chǎn)GOD活性，當(dāng)發(fā)酵溫度為15～30 ℃時，菌株酶活性較高，當(dāng)發(fā)酵溫度為20 ℃時，菌株GOD酶活性最高，這可能是因為菌株來源于海洋。因此，確定最適發(fā)酵溫度為20 ℃。

圖14 裝液量對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.14 The effect of liquid volume on enzyme production of Basidioascus sp. LG-31 strain

圖15 發(fā)酵轉(zhuǎn)速對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.15 The effect of fermentation speed on enzyme production of Basidioascus sp. LG-31 strain

圖16 發(fā)酵溫度對菌株Basidioascus sp. LG-31酶活性的影響Fig.16 Effect of fermentation temperature on the enzyme production of Basidioascus sp. LG-31 strain

3 討 論

本研究表明，菌株Basidioascussp.LG-31的培養(yǎng)基最佳成分為蔗糖4%、酵母粉0.3%、NaNO30.4%、KH2PO40.02%、KCl 0.10%、MgSO4·7H2O 0.10%。最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度20 ℃、初始pH值7.0、三角瓶裝液量125 mL/250 mL、接種量2%、轉(zhuǎn)速200 r/min。

本研究為了提高菌株Basidioascussp.LG-31產(chǎn)低溫GOD酶活性，對菌株Basidioascussp.LG-31的最佳產(chǎn)酶條件進(jìn)行單因素優(yōu)化。實驗結(jié)果表明，菌株Basidioascussp.LG-31在不同培養(yǎng)條件下產(chǎn)酶能力有很大差異，蔗糖和酵母粉能夠大量誘導(dǎo)菌株產(chǎn)酶；菌株在較低溫度下的產(chǎn)酶能力明顯強(qiáng)于高溫下的產(chǎn)酶能力，這可能與菌株來源和低溫GOD特性有關(guān)；裝液量及轉(zhuǎn)速結(jié)果表明，較低的裝液量和較高的轉(zhuǎn)速更利于菌株產(chǎn)酶，說明菌株發(fā)酵產(chǎn)酶對溶氧量需求較高。經(jīng)過單因素優(yōu)化后，酶活性達(dá)到435.37 U/mL，相對于優(yōu)化前的酶活性15.28 U/mL，提高了28.49倍，大大提高了菌株Basidioascussp. LG-31的GOD酶活性。2014年石淑鈺等[33]從海洋中篩選獲得一株產(chǎn)低溫GOD的米氏假單胞桿菌(Pseudomonasmigulae)，該菌株所產(chǎn)GOD最適催化溫度為20 ℃，10 ℃時仍具有較高酶活性，最適pH為7.0，但酶活性最高只有25 U/mL；高齊霖等[34]從海泥中篩選出6株產(chǎn)GOD菌株，其中一株霉菌酶活性最高，為0.904 U/mL；胡善松等[35]從海洋中篩選出一株產(chǎn)GOD檸檬酸桿菌屬(Citrobacterssp．)菌株，并對其進(jìn)行誘變選育和克隆表達(dá)，在大腸埃希菌中克隆表達(dá)后，重組GOD最適作用溫度為25 ℃，酶活性2.04 U/mL；王一茜等[36]以海泥為樣品，篩選得到一株產(chǎn)低溫GOD的酵母菌WYQ 23，該GOD最適作用溫度為20 ℃，并對該菌株產(chǎn)酶進(jìn)行了單因素發(fā)酵條件優(yōu)化，優(yōu)化后酶活性達(dá)1.67 U/mL。與以往報道的產(chǎn)GOD的菌株相比，菌株Basidioascussp.LG-31在溫度和酶活性方面有明顯優(yōu)勢，尤其是經(jīng)過單因素優(yōu)化后，酶活性明顯提高。接下來本課題組(遼寧省海洋微生物工程技術(shù)中心)會在本研究的基礎(chǔ)上，對菌株Basidioascussp.LG-31產(chǎn)GOD酶活性進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，系統(tǒng)性地完成產(chǎn)酶條件優(yōu)化，以進(jìn)一步提高產(chǎn)GOD酶活性，并對其發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)，逐漸進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。

GOD在氧氣存在的條件下可催化葡萄糖轉(zhuǎn)化，并生成H2O2，從而將巰基(-SH)氧化生成二硫鍵(-S-S-)，增強(qiáng)面粉強(qiáng)度，使其口感更筋道[37-38]。GOD作為一種新型的飼料添加劑，進(jìn)入動物體內(nèi)，可以起到幫助分解葡萄糖的作用。催化過程中消耗氧氣，降低腸道內(nèi)氧氣含量，抑制好氧病原微生物生存及繁殖，從而維持腸道菌群平衡，有效地提高動物免疫力；生成的葡萄糖酸和H2O2，能夠調(diào)節(jié)畜禽腸道pH，有助于食物的消化吸收[39-40]。本研究中的菌株Basidioascussp. LG-31分離自海洋，因此具有耐低溫特性，也可有效解決上述GOD研究現(xiàn)存問題。菌株Basidioascussp. LG-31的成功分離不僅對GOD資源庫尤其是酵母來源的GOD的擴(kuò)充具有重要意義，也為低溫GOD的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用提供重要的參考。此外，菌株Basidioascussp.LG-31所產(chǎn)的GOD在低溫下仍有很高酶活性，可降低工業(yè)生產(chǎn)成本，具有開發(fā)前景和應(yīng)用潛力。