黃艷娜， 王金斌， 王賽賽， 段賽菲， 周茂超， 唐雪明

(上海市農業(yè)科學院 生物技術研究所，上海 201106)

保加利亞乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus, 以下簡稱L.bulgaricus)為革蘭陽性菌，在分類上屬于乳桿菌屬，兼性厭氧，為乳酸菌家族中的重要一員，其作為發(fā)酵劑而被廣泛應用于食品工業(yè)中[1-3]。乳酸菌細胞內乳酸脫氫酶的立體特異性決定了形成乳酸的立體構型，如德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、詹氏乳桿菌(Lactobacillusjensenii)和棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniforis)發(fā)酵產物以D-乳酸為主[4-8]，有的菌株含有D型和L型兩種乳酸脫氫酶或存在乳酸消旋酶，最終形成DL-乳酸，而有些乳酸菌產生的是L-乳酸[9]。保加利亞乳桿菌可通過NAD-依賴的D-乳酸脫氫酶催化底物合成D-乳酸，恒化培養(yǎng)時可以合成L-乳酸，由L-乳酸脫氫酶催化[10]。L.bulgaricusATCC11842屬于同型乳酸發(fā)酵細菌，也是極少的幾株通過EMP途徑利用葡萄糖合成光學純D-乳酸的野生菌株[11]。事實上，不同的保加利亞乳桿菌菌株具有菌株特異性，其合成D-乳酸和L-乳酸的能力也有所不同，Manome等[9]報道L.delbrueckiiATCC 9649菌株合成D-乳酸的光學純度為87.2%；L.bulgaricusATCC11842自然發(fā)酵合成D-乳酸的光學純度約為95%(本研究測得)，表明其合成乳酸的調控機制可能是不同的。目前對L.bulgaricusATCC11842中D-乳酸脫氫酶的酶學性質和蛋白結構已有報道，研究表明保加利亞乳桿菌的D-LDH和L-LDH分別來自兩個完全不同的家族，其蛋白序列同源性較低，僅有27%～37%[11-13]。但有關L-乳酸脫氫酶尚無系統(tǒng)研究，對其作用也無明確結論。為進一步了解保加利亞乳桿菌合成乳酸的調控機制，本研究以L.bulgaricusATCC11842為出發(fā)菌株，克隆其L-LDH同工酶基因ldb0120和ldb0094，以pET28a(+)為表達載體，在大腸埃希菌BL21(DE3)中過量表達，通過搖瓶發(fā)酵研究該酶催化合成L-乳酸的能力，結合蛋白純化和酶活的測定，揭示L-乳酸脫氫酶同工酶基因在保加利亞乳桿菌中的作用機制，為進一步了解保加利亞乳桿菌合成乳酸的機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 大腸埃希菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)和表達載體pET28a (+)為上海市農業(yè)科學院生物技術研究所保存，保加利亞乳桿菌ATCC11842購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基(Oxid, Hampshire, England)用于保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉15 g/L) 用于大腸埃希菌及其重組菌的培養(yǎng)；重組大腸埃希菌的發(fā)酵培養(yǎng)基采用M9培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 9.0，Na2HPO4·12H2O 15.12，KH2PO43.0，NaCl 0.5，NH4Cl 3.0，每升添加1 mol/L MgSO42 mL，1 mol/L CaCl20.1 mL，1%(質量分數(shù))維生素B10.2 mL，微量元素0.1 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器設備Taq酶、DNA Marker、蛋白Marker、XhoI/NheI限制性內切酶、T4 連接酶(大連寶生物有限公司) ；細菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒(Solarbio LIFE Sciences, Beijing)；D-/L-乳酸測定試劑盒(Megazyme international, Ireland)。超凈工作臺(ZHJH-C1112C，上海智城分析儀器制造有限公司)；生化培養(yǎng)箱(Spx-100B-Z,上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(ZWY-240,上海智城分析儀器制造有限公司)；紫外-可見分光光度計(Evolution 60,Thermo Fisher)；電泳儀(EPS-200,上海天能生命科學有限公司)；雙板垂直電泳儀(DYCZ-24DH,北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 目的基因克隆 參照細菌基因組提取試劑盒所述抽提保加利亞乳桿菌基因組。根據(jù)GenBank中公布的L.bulgaricusATCC11842 L-乳酸脫氫酶的基因序列(ldb0120和ldb0094)，設計特異性引物(表1)。PCR擴增條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

表1 引物設計

1.2.2 重組表達載體的構建 分別將PCR產物和載體pET28a(+)按表1所示限制性內切酶進行雙酶切，膠回收純化后，采用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。連接產物熱激轉化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，37 ℃復蘇1 h后涂布終濃度為50 μg/mL卡那霉素抗性的LB平板，培養(yǎng)12 h后，挑單菌落至LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)10 h，挑選重組轉化子，送至生工生物工程上海股份有限公司測序，并對重組菌進行質粒抽提和限制性內切酶酶切驗證。

1.2.3 目的基因在大腸埃希菌中的表達 將培養(yǎng)過夜的重組菌按照1%(體積分數(shù))的接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)期前期，添加終濃度為0.5 mmol/L IPTG進行誘導，誘導時間為4 h，以空質粒重組菌和未誘導重組菌為對照，收集菌體進行全細胞聚丙酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)。

1.2.4 重組蛋白的純化 分別將1%(體積分數(shù))重組菌種子液接種于含有終濃度為50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖瓶發(fā)酵至菌液OD600值為0.6～0.8后加入IPTG，使其終濃度為0.5 mmol/L，并在25 ℃、150 r/min條件下誘導12 h，冷凍離心收集菌體，用pH 7.5，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗滌懸浮，采用高壓勻漿超聲破碎儀破碎，超聲破碎條件：功率37.5 W，超聲周期2 s-2 s，時間10 min。4 ℃離心取上清。參照Ni-NTA瓊脂糖純化樹脂試劑盒對重組蛋白中帶有的His-Tag進行鎳柱親和層析，并對純化后的蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 L-乳酸脫氫酶活性的測定 采用考馬斯亮藍法檢測酶液的蛋白濃度。參照乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒說明書測定L-乳酸脫氫酶酶活，以滅活的酶為空白對照。酶活力定義：每mg蛋白每分鐘催化產生1 nmol丙酮酸所需的酶量為1個酶活力單位。

1.2.6 表達L-乳酸脫氫酶基因重組大腸埃希菌的搖瓶發(fā)酵 將重組大腸埃希菌種子液按照1%(體積分數(shù))的接種量接種于M9發(fā)酵培養(yǎng)基中，添加終濃度為0.5 mmol/L IPTG進行誘導，以空質粒重組菌E.coli/pET28a作對照。有氧發(fā)酵條件：250 mL三角瓶，裝液量30 mL，8層紗布包裹瓶口；微好氧培養(yǎng)條件：50 mL藍口瓶，裝液量40 mL。其中D-乳酸脫氫酶重組菌添加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素，37 ℃，200 r/min，發(fā)酵時間24 h，測定細胞生長(OD600)，并采用D-/L-乳酸檢測試劑盒測定L-乳酸的濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 搖瓶發(fā)酵實驗中每個菌株設置3次生物學重復，每個實驗重復3次，采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)的顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 L-乳酸脫氫酶基因的克隆

以保加利亞乳桿菌ATCC11842基因組為模板，以表1所示為引物，PCR擴增L-乳酸脫氫酶同工酶基因ldb0094和ldb0120。瓊脂糖凝膠電泳均獲得特異大小的條帶(圖1)，測序得到該片段長度分別為909和924 bp ，并與GenBank的L.bulgaricusATCC11842的ldb0094(CAI96935.1, 909 bp)和ldb0120(CAI96961.1, 924 bp)進行同源比對，結果顯示基因序列完全一致，證明克隆的基因正確。

2.2 表達L-LDH同工酶基因的重組大腸埃希菌的構建

對目的基因片段和質粒pET28a分別進行雙酶切，膠回收純化后對目的片段和線性化pET28a載體進行連接，并將連接產物轉化E.coliBL21感受態(tài)細胞，采用卡那霉素抗性篩選重組轉化子。抽提重組質粒質粒并進行雙酶切驗證，結果如圖2所示。每個重組質粒切成兩條帶，較大的為pET28a線性化載體，為5.3 kb左右，較小的條帶為目的基因，與預期大小一致，表明重組大腸埃希菌構建成功。

圖1 L-乳酸脫氫酶基因PCR擴增電泳圖Fig.1 The electrophoretogram of PCR products of L-lactate dehdyrogenase gene Marker： 100～3 000 bp; 1： ldb0094; 2： ldb0120

圖2 重組質粒雙酶切驗證電泳圖Fig.2 The elelectrophoresis of double restriction enzyme digestion of recombinant plasmidMarker: 250～15 000 bp; 1： ldb0120 (Nhe I 和 Xho I 雙酶切); 2： ldb0094(Nhe I 和 Xho I 雙酶切)Marker: 250-15 000 bp; 1： ldb0120 restricted by Nhe I and Xho I; 2： ldb0094 restricted by Nhe I and Xho I

2.3 重組大腸埃希菌聚丙烯酰氨凝膠電泳

表達L-LDH同工酶因的重組大腸埃希菌聚丙烯酰胺凝膠電泳結果如圖3所示。與對照E.coliBL21和空質粒E.coliBL21/pET28a相比，重組菌E.coliBL21/pET28aldb0020和E.coliBL21/pET28aldb0094均有特異蛋白表達，其中LDB0120蛋白分子量為29 kDa左右，LDB0094蛋白分子量為26 kDa左右。

圖3 表達ldb0120和ldb0094基因的重組大腸埃希菌SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE electrophoresis of recombinant E. coli expressing ldb0120 and ldb00941： E.coli BL21; 2： E.coli BL21/pET28a; 3： E.coli BL21/pET28aldb0120 (0 mmol/L IPTG); 4：E.coli BL21/pET28aldb0120 (0.5 mmol/L IPTG); 5：E.coli BL21/pET28aldb0094 (0 mmol/L IPTG); 6：E.coli BL21/pET28aldb0094 (0.5 mmol/L IPTG)

2.4 重組蛋白的純化

采用Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂試劑盒分別對重組蛋白進行純化。并將蛋白破碎液、蛋白流穿液、兩次蛋白收集液進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果如圖4所示。經Ni-NTA 瓊脂糖純化樹脂洗脫純化，目的蛋白在第二次收集液中僅顯示單一條帶，且蛋白分子量與預期一致，LDB0094和LDB0120分子量大小分別為26 kDa和29 kDa左右，這表明獲得了LDB0094和LDB0120的純酶。

2.5 L-乳酸脫氫酶酶活的測定

對重組蛋白進行Ni-NTA柱親和層析和酶學活性測定，結果顯示，LDB0120和LDB0094的比活力分別為0 和25 U/mg，這表明LDB0094具有低活性，而LDB0120沒有活性。推測可能是保加利亞乳桿菌主要合成D-乳酸的原因所在。Hao等[13]對L.bulgaricus2038進行了全基因組測序和功能注釋，認為L-LDH在細胞中是不表達的，而D-LDH在體內表達水平較高，其中l(wèi)dhL1(LBU0059) 和ldhL2(LBU0084)密碼子適應指數(shù)(Condon adaption index, CAI)分別為0.305和0.225。Ragout等[10]的研究顯示L.bulgaricusATCC 11842存在L-乳酸脫氫酶，可以可逆催化丙酮酸合成L-乳酸的反應。但該酶非常不活躍，只能產生極少量的L-乳酸，而且該合成不依賴于培養(yǎng)基中pH和葡萄糖濃度的變化[14]，這表明L-LDH在保加利亞乳桿菌ATCC11842菌株糖代謝合成乳酸過程中作用甚微。

2.6 重組大腸埃希菌L-乳酸合成的搖瓶發(fā)酵實驗

以表達空質粒重組菌為對照，分別對表達L-乳酸脫氫酶重組大腸埃希菌進行好氧和微好氧發(fā)酵，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，測定菌體濃度OD600，4 ℃、12 000 r/min離心收集發(fā)酵樣品，采用D-/L-乳酸試劑盒測定L-乳酸的含量，搖瓶發(fā)酵結果如表2所示。與對照E.coliBL21/pET28a相比，重組菌E.coliBL21/pET28aldb0120與對照E.coliBL21/pET28a無差異，L-乳酸的濃度僅為3～6 mg/L，表明重組酶Ldb0120在L-乳酸的合成中沒有作用，而菌株E.coliBL21/pET28aldb0094微好氧條件可以合成L-乳酸，濃度為227.9 mg/L，好氧條件下L-乳酸的濃度為41.9 mg/L，表明LDB0094具有活性，且受到氧的負調控，好氧條件下酶活降低，導致L-乳酸的合成下降。該結果與酶活測定結果吻合，由于LDB0120未檢測到酶活，揭示了LDB0094為催化L-乳酸合成的關鍵酶。有研究表明乳酸的合成受氧的調控，Collins等[15]的研究顯示厭氧條件下LDHs的酶活是好氧條件的10倍左右，因此改變通氣量和攪拌轉速等參數(shù)也會影響乳酸的合成。這與本研究中表達ldb0094基因的重組大腸埃希菌在微好氧條件下可以合成更多乳酸的結果一致。

圖4 純化的L-乳酸脫氫酶SDS-PAGE電泳圖Fig.4 SDS-PAGE electrophoresis of purified L-lactate dehydrogenase1： E.coli BL21/pET28aldb0094蛋白破碎液; 2： E.coli/pET28aldb0094 蛋白洗脫液; 3： E.coli BL21/pET28aldb0094 第一次蛋白收集液; 4： E.coli BL21/pET28aldb0094 第二次蛋白收集液; 5： E.coli BL21/pET28aldb0120 蛋白破碎液; 6： E.coli BL21/pET28aldb0120 蛋白洗脫液; 7： E.coli BL21/pET28aldb0120 第一次蛋白收集液; 8： E.coli BL21/pET28aldb0120 第二次蛋白收集液1： E.coli BL21/pET28aldb0094 protein fragmentized solution; 2： E.coli/pET28aldb0094 protein flow-through solution; 3： E.coli BL21/pET28aldb0094 1st protein collecting solution; 4： E. coli BL21/pET28aldb0094 2nd protein collecting solution; 5： E.coli BL21/pET28aldb0120 protein fragmentized solution; 6： E.coli BL21/pET28aldb0120 protein flow-through solution; 7： E.coli BL21/pET28aldb0120 1st protein collecting solution; 8： E.coli BL21/pET28aldb0120nd protein collecting solution

表2 表達L-乳酸脫氫酶基因重組大腸埃希菌搖瓶發(fā)酵結果

3 討 論

近年來，在乳酸菌LAB的基因組測序方面取得了長足的進展。截止2020年，NCBI數(shù)據(jù)庫中已有50個完整的德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)基因組草圖，包括L.lactis、L.bulgaricus、L.jakobsenii、L.indicus和L.sunkii[16-19]。保加利亞乳桿菌基因組測序顯示的一些特征揭示了該菌株基因組處于快速進化的假設。在嗜酸菌群的乳酸菌中L.delbrueckii通常被認為是不典型的，目前的基因組序列觀察到的GC含量差異主要是由于密碼子3位的GC含量不同，可以解釋為近期進化的可能性，也表明L.delbrueckiisubsp.bulgaricus可能比曾經認為的還不典型[18]。Song等[20]對蔗糖復原脫脂牛奶酸化發(fā)酵結果的全基因組關聯(lián)研究分析表明，L-乳酸脫氫酶(lldD: Ldb2036)和細菌產酸速率相關。Tanigawa等[21]分析采用多位點序列分型技術對41株L.delbrueckii進行了多樣性分析，發(fā)現(xiàn)L.delbrueckii具有較高的遺傳多樣性。

L.bulgaricusATCC11842是D-乳酸合成菌株，目前關于保加利亞乳桿菌合成乳酸的研究主要集中于利用不同原料及其水解物來合成高純度的D-乳酸[22-24]。Balakrishnan等[25]以Kodo小米麩皮酸解和酶解物為原料對L.delbrueckiiNBRC3202進行了有氧和微好氧發(fā)酵，D-乳酸濃度為25.38 g/L，光學純度達到97.79%；Karnaouri等[26]研究顯示L.bulgaricusATCC11842可利用有機溶劑預處理山毛櫸和松樹獲得的木質纖維素生物質合成光學純的D-乳酸；Xu等[27]研究了保加利亞乳桿菌利用可再生菊粉生產D-乳酸，在同步糖化發(fā)酵條件下D-乳酸的濃度可達到126.3 g/L，光學純度>99.9%。Wang等[28]利用酸預處理玉米秸稈發(fā)酵L.bulgaricusCICC21101產D-乳酸，光學純度可達99%。在L-乳酸合成方面，王剛等[29]研究了ldhL-ldb0094基因敲除對保加利亞乳桿菌CICC21101產L-乳酸的影響，結果顯示該基因的敲除使得ldb0120基因轉錄水平上調，進而提高L-乳酸的合成，其光學純度由54.56%增加到92.25%。在本研究中，對L.bulgaricusATCC11842菌株進行了D-乳酸和L-乳酸合成的測定，結果顯示在厭氧條件該菌株D-乳酸的合成比例約占95%左右(數(shù)據(jù)未顯示)，表明L.bulgaricusATCC11842與L.bulgaricusCICC21101可能在乳酸合成的調控方面機制有所不同。

因此，為了解保加利亞乳桿菌L-乳酸脫氫酶同工酶基因對細胞合成L-乳酸的作用，本研究首次將L-乳酸脫氫酶同工酶基因進行大腸埃希菌的異源表達，以L.bulgaricusATCC11842基因組DNA為模板，克隆得到兩種L-LDH同工酶基因 (ldb0120和ldb0094)，構建重組質粒并轉化大腸埃希菌BL21，實現(xiàn)了保加利亞乳桿菌L-LDH同工酶基因在大腸埃希菌中的表達。對重組大腸埃希菌進行了好氧和微好氧搖瓶發(fā)酵實驗，結果顯示重組菌E.coliBL21/pET28aldb0120無論在好氧還是微好氧條件下均基本不合成L-乳酸，E.coliBL21/pET28aldb0094在好氧和微好氧條件下L-乳酸的濃度分別為41.9和227.9 mg/L，這表明L-乳酸脫氫酶的活性受到氧的負調控，這與酶活測定數(shù)據(jù)相吻合。因此，綜合兩株重組菌在厭氧和微好氧條件下L-乳酸的合成和L-乳酸脫氫酶同工酶酶活的測定，推測保加利亞乳桿菌ATCC11842主要通過L-乳酸脫氫酶同工酶LDB0094來催化丙酮酸合成L-乳酸，盡管活性很低，但仍然在L-乳酸的合成中起著關鍵作用。本研究深入了解了保加利亞乳桿菌中L-乳酸脫氫酶在乳酸合成中的作用，結果表明兩種L-乳酸脫氫酶同工酶在保加利亞乳桿菌中僅LDB0094具有非常低的酶活，進而影響了L-乳酸的合成，也從側面揭示保加利亞乳桿菌主要合成D-乳酸可能與此有關。