劉曉柳， 鐘 燦， 謝 景， 侯鳳飛， 戴甲木， 陳貴明， 王先有,5， 張水寒， 金 劍*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，湖南 長(zhǎng)沙 410208;2.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410013;3.湖南補(bǔ)天藥業(yè)股份有限公司，湖南 懷化 410017;4．湖南省茯苓工程技術(shù)研究中心，湖南 懷化 410017；5.湖南省靖州苗族侗族自治縣茯苓專業(yè)協(xié)會(huì)，湖南 懷化 410017)

茯苓為多孔菌科真菌茯苓(Poriacocos(Schw.) Wolf)的干燥菌核[1]，具有利水滲濕、健脾化痰、寧心安神等多種功效，為多種經(jīng)典方劑原料，有“十方九苓”之說(shuō)[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，茯苓具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗衰老[5]、抗炎[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]等多種藥理活性，臨床應(yīng)用價(jià)值顯著。茯苓栽培利用歷史悠久[8]，我國(guó)具有保藏號(hào)的茯苓菌株近100株，但菌株資源來(lái)源混雜，同種異名現(xiàn)象嚴(yán)重[9]。目前，栽培所用茯苓菌株多為菌核分離，長(zhǎng)期無(wú)性繁殖導(dǎo)致的茯苓菌種退化、產(chǎn)量和質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題成為制約產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸[10]。開展茯苓的優(yōu)良菌株培育創(chuàng)新具有重要意義。近年來(lái)，多基因特征序列分析成為菌種鑒定和遺傳進(jìn)化關(guān)系分析的有效手段[11-14]。ITS、LSU、TEF1-α基因片段序列分析已在靈芝[15]、冬蟲夏草[16]、貝蓋側(cè)耳[17]等真菌中開展相關(guān)應(yīng)用。而茯苓研究主要集中在藥理和藥效上，其基本特性及遺傳關(guān)系的研究相對(duì)較少[18]。同時(shí)基于國(guó)家新品種保護(hù)政策，許多其他藥食用菌已成功開展新品種研究[19-20]，而茯苓未有相關(guān)報(bào)道。通過(guò)太空誘變開展種質(zhì)創(chuàng)新是新品種選育的重要手段[21]。我國(guó)已有22個(gè)省市參與了航天育種工作，38個(gè)品種通過(guò)國(guó)家審定，80多個(gè)品種在大面積推廣。湖南省懷化市靖州苗族侗族自治縣(靖州縣)是“中國(guó)茯苓之鄉(xiāng)”，一直致力于茯苓的種質(zhì)創(chuàng)新研究工作。2013年靖州縣茯苓專業(yè)委員會(huì)與國(guó)家航天育種研究中心合作，將茯苓“湘靖28”菌株通過(guò)神舟十號(hào)送上太空，嘗試?yán)锰照T變作用培育出茯苓新品種。本研究基于分子生物技術(shù)和大田栽培實(shí)驗(yàn)，對(duì)搭載“神舟十號(hào)”太空誘變選育的茯苓太空10號(hào)菌株與目前市場(chǎng)上主流商業(yè)應(yīng)用的茯苓湘靖28、5.78菌株進(jìn)行比較，探討太空10號(hào)菌株推廣應(yīng)用的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茯苓菌株和菌核樣品 茯苓菌株“太空10號(hào)”(PoriacocosStrain Mutagenesis Breeding In Space No.10, MBIS No.10)、“湘靖28”(Poriacocosstrain Xiangjing 28)、“5.78”(Poriacocosstrain 5.78)由湘黔桂食藥用菌研究所提供。3個(gè)菌株分別按照GAP規(guī)范，進(jìn)行茯苓二級(jí)種和三級(jí)種傳代制種，在云南省普洱市寧洱哈尼族彝族自治縣寧洱鎮(zhèn)茯苓基地進(jìn)行栽培，收集新鮮茯苓菌核。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①栽培種培養(yǎng)基(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%)：松木屑78，麩皮20，蔗糖1，石膏粉1，硫酸鎂0.2，含水量(60±2)，pH值5.5～6.5。②ZJ固體平板培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖15 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母粉2 g，瓊脂15 g，去離子水1 000 mL。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 DNA提取試劑盒購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司，特異性引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成；金牌MIX(包含dNTPTaq酶、緩沖液)購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；無(wú)水乙醇(湖南匯虹試劑有限公司 202008191)；茯苓酸購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司(批號(hào)CHB180727)，茯苓對(duì)照藥材購(gòu)自中國(guó)檢驗(yàn)科學(xué)研究院(批號(hào)121117-201910)。正置生物顯微鏡(Leica DM2 500 LED，德國(guó)徠卡)；超微量生化分光光度計(jì)(ScanDrop 100，德國(guó)耶拿)；薄層色譜成像系統(tǒng)(GoodLook-100，上?？普苌萍加邢薰?；PCR儀(AG 22331 Hamburg，德國(guó)Eppendorf公司)；冷凍高速離心機(jī)(Multifuge X1R,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；高靈敏度化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ChemiDoc XRS+Image LabTM,武漢佰蕾真生物科技有限公司)；智能人工氣候箱(RXZ-380，寧波江南儀器廠)；生物冷凍掃描電鏡(Cryo-SEM,FEI Quanta 450)。

1.2 方法

1.2.1 菌絲及菌核性狀觀察 參照《中國(guó)藥典》2020版茯苓項(xiàng)下觀察太空10號(hào)茯苓菌核形態(tài)。去皮，切取直徑1 cm左右新鮮菌核接種于ZJ固體培養(yǎng)基中，30 ℃避光培養(yǎng)10 d，觀察菌絲生長(zhǎng)表觀形態(tài)。取少量菌核，干燥、粉碎，過(guò)50目篩，牙簽蘸取少量粉末制水合氯醛裝片，于光學(xué)顯微鏡下觀察。用刀片切取新鮮菌核和菌絲樣品放置于硅片上，用無(wú)水乙醇浸潤(rùn)5～10 s后取出自然干燥，約0.5～1 h后，取樣固定在樣品臺(tái)上進(jìn)行液氮冷凍，制成樣品后生物冷凍電鏡掃描儀下觀察。

1.2.2 拮抗試驗(yàn) 在無(wú)菌操作環(huán)境下，將茯苓供試菌株用打孔器定量直徑1 cm菌塊，接種于ZJ培養(yǎng)基平板，接種塊間距約30 mm，每個(gè)平板接兩個(gè)不同菌株，共三種組合，每種組合3個(gè)重復(fù)，30 ℃避光培養(yǎng)7～10 d直至菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板，觀察不同菌株間是否出現(xiàn)拮抗線及拮抗線是否明顯[22]。

1.2.3 不同溫度下的菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定 菌絲生長(zhǎng)速度測(cè)定參照陳興東等[23]、上官舟建等[24]方法進(jìn)行。采用打菌塊法將3株茯苓菌株用打孔器定量直徑1 cm菌塊接種于ZJ固體培養(yǎng)基中，分別正置于10、20、30、40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個(gè)菌株5個(gè)重復(fù)，待菌塊周圍出現(xiàn)新鮮菌絲后，使用十字交叉法每24 h測(cè)量菌落直徑并記錄，直至菌落長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

1.2.4 茯苓栽培轉(zhuǎn)化率測(cè)定 3株茯苓菌株分別按照GAP規(guī)范進(jìn)行茯苓二級(jí)種和三級(jí)種傳代制種，采用傳統(tǒng)種植法種植茯苓。下窖時(shí)稱量每一窖段木總質(zhì)量(M)，測(cè)產(chǎn)驗(yàn)收時(shí)稱量每一窖茯苓總質(zhì)量(m1)，計(jì)算總鮮質(zhì)量與栽種茯苓時(shí)所用段木總質(zhì)量比值，得鮮質(zhì)量轉(zhuǎn)化率(α1)。切取新鮮茯苓菌核m0(約50 g)，置于60 ℃烘箱中干燥至恒重，稱其干重m2得出干質(zhì)量占比，繼而得出每一窖茯苓干質(zhì)量，計(jì)算干質(zhì)量與所用段木質(zhì)量即得干質(zhì)量轉(zhuǎn)化率(α2)。轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式：

1.2.5 薄層色譜鑒別 參照《中國(guó)藥典》2020版四部通則0502薄層色譜法試驗(yàn)[25]。取太空10號(hào)、湘靖28、5.78茯苓粉末各1 g，加乙醚50 mL，超聲處理10 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使其溶解，作為供試品溶液。另取茯苓對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取茯苓酸對(duì)照品1 g，加甲醇配制為0.1 mg/mL的茯苓酸對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以V甲苯∶V乙酸乙酯∶V甲酸=20∶5∶0.5為展開劑，展開，取出晾干，噴以V香草醛硫酸溶液(2%)∶V乙醇=4∶1混合溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)品色清晰。

1.2.6 浸出物測(cè)定 水溶性浸出物含量參照《中國(guó)藥典》2020版四部通則2201浸出物測(cè)定法測(cè)定[26]。取供試品約2 g，精密稱定，置250 mL的錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過(guò)，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量(%)。按照水溶性浸出物測(cè)定法測(cè)定，以稀乙醇代替水,進(jìn)行醇溶性浸出物含量測(cè)定。

1.2.7 特征基因序列比對(duì)及進(jìn)化分析 ①模板DNA制備：采用試劑盒提取法，選用通用型植物基因組DNA提取試劑盒，按說(shuō)明書步驟分別提取3株茯苓菌株的總DNA，取2 μL用超微量分光光度計(jì)測(cè)試其濃度及純度，剩余-20 ℃保存?zhèn)溆谩?②特征基因序列擴(kuò)增體系及程序：參考Wu等[27]選取核糖rDNA內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、核糖體大亞基(LSU)、翻譯延伸因子(TEF1-α)引物序列，合成通用上下游引物(表1)，以提取的總DNA為模板擴(kuò)增ITS、LSU、TEF1-α基因序列。擴(kuò)增體系：DNA模板1 μL，金牌Mix 22 μL，正向引物1 μL(10 μmol/L)，反向引物1 μL(10 μmol/L)，總體積25 μL。反應(yīng)程序參照Song 等[28]：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性10 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃最后延伸10 min，4 ℃結(jié)束。取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像觀察；取10 μL送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。數(shù)據(jù)分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建：在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將ITS、LSU、TEF1-α序列測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲取與供試菌株相似性較高的菌株序列。應(yīng)用MEGA6.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹分析[29]，將測(cè)序獲得的3株茯苓菌株的ITS、LSU、TEF1-α以及ITS+LSU+TEF1-α分別進(jìn)行多序列比對(duì)，去掉兩端差異序列，運(yùn)行1 000次Bootstrap，鄰接法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[30]。

表1 ITS、LSU、TEF1-α基因序列擴(kuò)增引物

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 轉(zhuǎn)化率和浸出物以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。通過(guò)使用SPSS statistics 26(美國(guó)紐約州紐約市國(guó)際商業(yè)機(jī)器公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，通過(guò)LSD的多范圍檢驗(yàn)P<0.05確定顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲及菌核表觀性狀特征

太空10號(hào)菌株栽培所得菌核呈類球形、橢圓形、扁圓形或不規(guī)則的塊狀，大小不一，如圖1A和圖1B所示。外皮薄而粗糙，棕褐色至黑褐色，有明顯隆起的皺紋。體重，質(zhì)地堅(jiān)硬，斷面不平坦，呈顆粒狀或粉狀，有的具裂隙，外層淡棕色，內(nèi)部白色(圖1C)。氣微，味淡，嚼之粘牙。菌絲細(xì)長(zhǎng)，菌絲體外觀均呈白色絨毛狀，具有獨(dú)特的多同心環(huán)狀菌落(圖1D)。顯微鏡下觀察茯苓粉末水合氯醛裝片，如圖1E和圖1F所示，可見不規(guī)則狀團(tuán)塊和分枝狀團(tuán)塊，菌絲無(wú)色，細(xì)長(zhǎng)稍彎曲。

圖1 太空10號(hào)菌核、菌絲及水合氯醛裝片顯微性狀Fig.1 Microscopic characters of sclerotia, hypha and chloral hydrate of MBIS No.10 A、B：菌核；C：菌核斷面；D：菌絲；E：水合氯醛裝片顯微下顆粒狀團(tuán)塊；F：水合氯醛裝片顯微下顆粒狀菌絲 A,B: Sclerotium; C: Sclerotia section; D:Mycelium; E: Chloral hydrate was loaded into tablets, and granular masses were observed under microscope; F:Chloral hydrate tablets were loaded and the granular hyphae were observed under microscope

生物冷凍電鏡掃描下觀察，茯苓太空10號(hào)菌核呈不規(guī)則柱狀凸起的團(tuán)塊(圖2A)。如圖2B所示，不規(guī)則柱狀凸起表面光滑，多短小分支，直徑5～15 μm。同時(shí)，菌核內(nèi)存有少量細(xì)長(zhǎng)菌絲，表面或附有絨毛，或光滑，或細(xì)小隆起，菌絲粗細(xì)不一。粗壯的菌絲由細(xì)長(zhǎng)菌絲擰繩狀融合而成(圖2C)。電鏡下平板上菌絲體呈細(xì)長(zhǎng)管狀，未見鎖狀聯(lián)合，表面有的光滑，有的具有小球狀凸起，推測(cè)凸起部分為菌絲生長(zhǎng)分泌物，或菌絲隆起膨大而成(圖2D)。如圖2E和圖2F所示，部分菌絲具有明顯的分節(jié)和菌絲體膨大特征。結(jié)合茯苓菌核表觀性狀和顯微特征，推測(cè)茯苓菌核是由菌絲擰繩狀融合，或由菌絲不規(guī)則膨大堆積而成。

2.2 不同菌株拮抗反應(yīng)

拮抗試驗(yàn)是鑒定食藥用菌間遺傳差異的傳統(tǒng)方法，菌絲間的拮抗反應(yīng)是不同遺傳特性的重要表現(xiàn)[31-32]。通過(guò)茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株兩兩之間平板實(shí)驗(yàn)分析其拮抗反應(yīng)。如圖3所示，太空10號(hào)和湘靖28的拮抗線相對(duì)不明顯，拮抗反應(yīng)較弱，說(shuō)明兩個(gè)菌株的親緣關(guān)系較近，太空10號(hào)和5.78以及湘靖28和5.78拮抗線明顯，拮抗反應(yīng)較強(qiáng)，說(shuō)明親緣關(guān)系較太空10號(hào)和湘靖28之間的親緣關(guān)系疏遠(yuǎn)。

圖2 太空10號(hào)菌核、菌絲冷凍電鏡掃描特征Fig.2 Scanning characteristics of sclerotia and hyphae of MBIS No.10 under freeze electron microscope A～C：菌核；D～F：平板上菌絲 A-C: Sclerotium; D-F: Mycelium on the plate

圖3 茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株拮抗反應(yīng)Fig.3 Antagonistic reaction of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strainsA：太空10號(hào)與湘靖28拮抗反應(yīng)；B：太空10號(hào)與5.78拮抗反應(yīng)；C：湘靖28與5.78拮抗反應(yīng)；D：太空10號(hào)與湘靖28拮抗反應(yīng)平板背面；E：太空10號(hào)與5.78拮抗反應(yīng)平板背面；F：湘靖28與5.78拮抗反應(yīng)平板背面A: Antagonistic reaction of MBIS No.10 and Xiangjing 28; B: Antagonistic reaction of MBIS No.10 and 5.78 strains; C:Antagonistic reaction of Xiangjing 28 and 5.78 strains; D: Back of MBIS No.10 and Xiangjing 28 antagonistic reaction plate; E: Back of MBIS No.10 and 5.78 strains antagonistic reaction plate; F:Back of Xiangjing 28 and 5.78 strains antagonistic reaction plate

2.3 不同溫度下菌絲的生長(zhǎng)速度測(cè)定

于10、20、30、40 ℃溫度下培養(yǎng)茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78 菌株，發(fā)現(xiàn)3個(gè)菌株在10、40 ℃下茯苓菌絲基本不生長(zhǎng)，在20 ℃條件下能夠生長(zhǎng)，30 ℃條件下生長(zhǎng)較快(圖9)。3株茯苓菌株在20 ℃下培養(yǎng)的生長(zhǎng)速度差別較大(圖4A)，太空10號(hào)生長(zhǎng)速度明顯高于湘靖28和5.78，第2天時(shí)3株菌株生長(zhǎng)速度之間有顯著性差異，第5天時(shí)太空10號(hào)和5.78有顯著性差異(P<0.05)；30 ℃條件下不同菌株質(zhì)檢生長(zhǎng)速度差別不明顯，第1天時(shí)太空10號(hào)和湘靖28有顯著性差異(P<0.05)(圖4B)?？梢姕囟冗^(guò)低或過(guò)高都不利于茯苓菌絲生長(zhǎng)，選取適宜的栽培溫度是提高茯苓產(chǎn)量的一個(gè)重要因素。

2.4 大田栽培結(jié)苓和轉(zhuǎn)化率研究

茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株均能正常結(jié)苓，太空10號(hào)的平均結(jié)苓個(gè)數(shù)為5個(gè)/窖，湘靖28和5.78菌株均為5個(gè)/窖(表2)。3個(gè)茯苓菌株的鮮質(zhì)量產(chǎn)量也存在差異，其中太空10號(hào)的總鮮質(zhì)量為5.53 kg/窖，而湘靖28和5.78菌株分別為3.07 kg/窖和4.00 kg/窖。3株茯苓菌株所得菌核藥材的生物轉(zhuǎn)化率也存在差異，太空10號(hào)菌株的鮮質(zhì)量轉(zhuǎn)化率和干質(zhì)量轉(zhuǎn)化率均為最高，其中太空10號(hào)鮮質(zhì)量轉(zhuǎn)化率比湘靖28高出44.41%，比5.78高出34.55%，干質(zhì)量轉(zhuǎn)化率比湘靖28高出42.42%，比5.78高出24.23%。

圖4 茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株生長(zhǎng)速度比較Fig.4 Comparison of growth rates of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strainsA：20 ℃，B: 30 ℃；* 表示差異顯著(P<0.05)A: 20 ℃, B: 30 ℃; * The difference was significant (P<0.05)

表2 茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株結(jié)苓和菌核生物轉(zhuǎn)化率

2.5 薄層色譜分析

茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株所得菌核藥材與茯苓酸對(duì)照品、茯苓對(duì)照藥材的薄層色譜如圖5所示。結(jié)果顯示在與茯苓酸和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株大田栽培所獲得的菌核藥材均顯相同顏色的主斑點(diǎn)，其中茯苓酸的比移值Rf為0.43，色譜主要斑點(diǎn)分離度良好，斑點(diǎn)清晰，符合《中國(guó)藥典》2020版一部茯苓項(xiàng)下薄層色譜要求。

圖5 茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株薄層結(jié)果 Fig.5 Thin layer results of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strainsA：茯苓酸；B：茯苓藥材樣品；C：太空10號(hào)；D：湘靖28；E：5.78A:Poria acid;B:Samples of P.cocos;C:Space 10; D:Xiangjing 28; E:5.78

2.6 浸出物測(cè)定

根據(jù)中國(guó)藥典和歐洲藥典的指標(biāo)限量要求，對(duì)茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株大田所得菌核藥材的醇溶性浸出物和水溶性浸出物含量進(jìn)行了測(cè)定。由表3可見，太空10號(hào)水溶性浸出物含量為1.77%，低于湘靖28(水溶性浸出物含量為2.57%)和5.78(水溶性浸出物含量為2.45%)。而對(duì)于醇溶性浸出物含量，太空10號(hào)為3.00%，湘靖28為2.50%， 5.78為2.29%，太空10號(hào)具有較高的醇溶性浸出物含量。

表3 菌株茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78浸出物含量

2.7 ITS、LSU、TEF1-α基因序列比對(duì)及進(jìn)化分析

菌株茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78的ITS、LSU、TEF1-α基因擴(kuò)增片段瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰(圖6)，與Marker比較其長(zhǎng)度分別為1 600、1 400、600 bp左右，測(cè)序后雙向拼接得到完整的ITS、LSU序列和TEF1-α序列，其長(zhǎng)度與電泳結(jié)果一致，將其進(jìn)行序列比對(duì)，菌株太空10號(hào)與湘靖28和5.78的ITS、LSU、TEF1-α基因序列相似性達(dá)100%。將菌株太空10號(hào)ITS、LSU、TEF1-α基因測(cè)序結(jié)果分別在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行在線BLAST，成功得出3個(gè)基因序列均與茯苓同源，選取評(píng)分較高序列及參考Wu 等[27]選取外源菌株TrametessuaveolensCui 11586序列比對(duì)，進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，制作系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖7、8、9、10)。ITS、LSU、TEF1-α以及ITS+LSU+TEF1-α進(jìn)化樹結(jié)果中，太空10號(hào)、湘靖28、5.78 三株菌株均聚類為一支，表明3株菌株親緣關(guān)系較近。

圖6 茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78菌株ITS、LSU、TEF1-α序列PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果 Fig.6 MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains its, LSU and TEF1-α electrophoresis results of sequence PCR products M：2 000 bp DNA ladder Marker；1、2、3：ITS序列；4、5、6：LSU序列；7、8、9：TEF1-α序列；1、4、7：太空10號(hào)；2、5、8：湘靖28；3、6、9：5.78M: 2 000 bp DNA ladder Marker; 1, 2, 3: ITS sequence; 4, 5, 6: LSU sequence; 7, 8, 9: TEF1-α Sequence; 1, 4, 7: MBIS No 10; 2, 5, 8: Xiangjing 28; 3, 6, 9: 5.78 strains

圖7 菌株茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78 ITS基因遺傳關(guān)系聚類分析Fig.7 Cluster analysis of ITS gene genetic relationship of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains

圖8 菌株茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78 LSU基因遺傳關(guān)系聚類分析Fig.8 Cluster analysis of genetic relationship of LSU gene of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains

圖9 菌株茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78 TEF1-α基因遺傳關(guān)系聚類分析Fig.9 Cluster analysis of TEF1-α gene genetic relationship of MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains

圖10 菌株茯苓太空10號(hào)、湘靖28和5.78 ITS+LSU+TEF1-α基因聯(lián)合遺傳關(guān)系聚類分析Fig.10 MBIS No.10, Xiangjing 28 and 5.78 strains ITS+LSU+TEF1-α cluster analysis of genetic association

3 討 論

太空具有諸多與地球完全不同的環(huán)境因素，除強(qiáng)烈的太空輻射外，還有微重力、高真空、弱磁場(chǎng)等。太空輻射是公認(rèn)的有效的誘變因子，容易引起種子后代遺傳性狀的變化[34]。研究發(fā)現(xiàn)，香菇、平菇、黑木耳、金針菇、靈芝等食用菌經(jīng)太空誘變產(chǎn)生了拮抗反應(yīng)、生長(zhǎng)速度等方面的變化[35]。通過(guò)將搭載“神舟十號(hào)”太空誘變選育的菌株茯苓太空10號(hào)與菌株湘靖28、5.78對(duì)比分析，對(duì)其進(jìn)行生物特性分析和品質(zhì)評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步開展茯苓種質(zhì)資源創(chuàng)新、品種保護(hù)及優(yōu)良品種選育提供新思路。

本研究根據(jù)《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，茯苓藥材的性狀、顯微、薄層色譜、浸出物含量等各項(xiàng)指標(biāo)是其品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要依據(jù)[1]，對(duì)其各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，表觀性狀上，菌株太空10號(hào)符合《中國(guó)藥典》2020版一部茯苓項(xiàng)下的性狀描述。薄層色譜斑點(diǎn)清晰，達(dá)到《中國(guó)藥典》2020版茯苓藥材要求標(biāo)準(zhǔn)。生理指標(biāo)上，在28～30 ℃茯苓最適生長(zhǎng)溫度下[36]，菌絲體生長(zhǎng)速度差距不明顯，20 ℃低溫培養(yǎng)，茯苓太空10號(hào)菌株呈現(xiàn)出較快的生長(zhǎng)速度，規(guī)?；a(chǎn)中與其他兩個(gè)菌株相比可節(jié)省工時(shí)，呈現(xiàn)出提高經(jīng)濟(jì)效益優(yōu)勢(shì)。大田栽培實(shí)驗(yàn)中，太空10號(hào)的菌核質(zhì)量較優(yōu)，與其他兩個(gè)菌株相比，結(jié)苓個(gè)數(shù)、最大單個(gè)鮮質(zhì)量、總鮮質(zhì)量、鮮重轉(zhuǎn)化率、干重轉(zhuǎn)化率為其他兩個(gè)菌株的1.2～1.8倍，呈現(xiàn)出增產(chǎn)優(yōu)勢(shì)。菌株太空10號(hào)醇溶性浸出物含量達(dá)3.0%高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，呈現(xiàn)出品質(zhì)優(yōu)良優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)誘變的菌株太空10號(hào)茯苓菌核性狀符合茯苓藥材要求，且通過(guò)傳統(tǒng)栽培法能達(dá)到生長(zhǎng)情況良好，呈現(xiàn)出一定的提高經(jīng)濟(jì)效益、增產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等培育優(yōu)勢(shì)，具有推廣應(yīng)用潛力。

相關(guān)研究顯示，ITS序列間差異應(yīng)用于研究屬內(nèi)和屬間物種關(guān)系時(shí)十分有價(jià)值，尤其可用于近似種的區(qū)分[37]，而LSU、TEF1-α序列因其可較好地反映菌株遺傳關(guān)系特點(diǎn)，也常被用于進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究[38-39]。2020年Wu 等[27]在茯苓中開展了相關(guān)研究，并將中國(guó)茯苓與北美茯苓區(qū)分為兩個(gè)不同種，參考其選用的及已在其他食藥用真菌中應(yīng)用的ITS、LSU和TEF1-α進(jìn)行擴(kuò)增序列比對(duì)分析聯(lián)合拮抗反應(yīng)，在基源鑒定上，發(fā)現(xiàn)3株菌株之間沒有顯著遺傳差異，呈現(xiàn)出穩(wěn)定遺傳優(yōu)勢(shì)，具有推廣應(yīng)用潛力。但太空環(huán)境對(duì)茯苓細(xì)胞具體哪些生理和成分關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行了突變有待進(jìn)一步研究。