胡學(xué)軍， 李 威， 吳 瓊， 丁 寧

(大連大學(xué) 大連市糖重組與重組蛋白修飾重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

糖基化修飾在藥物蛋白功能、穩(wěn)定性及血漿半衰期等方面起到重要作用。真核生物中糖基化修飾蛋白在維持蛋白穩(wěn)定、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)控、細(xì)胞間的互作、細(xì)菌-宿主識別互作等過程中發(fā)揮著重要功能[1]。N-糖基化修飾是蛋白糖修飾的主要方式之一，寡糖通過與新生肽鏈中特定天冬酰胺的酰胺氮連接。在原核生物中也廣泛存在寡糖合成途徑與N-糖基化修飾蛋白質(zhì)機(jī)制，形成病原菌外膜上的脂寡糖。脂寡糖在病原菌黏附和宿主細(xì)胞侵入、逃避宿主免疫防御中發(fā)揮重要作用[2]。2002年，瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Wacker等研究人員首次將空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)N-糖基化基因簇(pgl) 轉(zhuǎn)入大腸埃希菌，成功地在大腸埃希菌工程菌株中N-糖基化修飾外源蛋白質(zhì)，開創(chuàng)了利用大腸埃希菌N-糖基化修飾重組蛋白新紀(jì)元[1]。近20年間，人們利用不同來源的糖基化轉(zhuǎn)移酶、寡糖轉(zhuǎn)移酶，在大腸埃希菌中開展類人源和人源化N-糖基化重組蛋白、病原菌寡糖的糖疫苗制備研究。本文詳細(xì)闡述了大腸埃希菌生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白的機(jī)制、應(yīng)用及前景。

1 利用大腸埃希菌生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白的機(jī)制

天然原核生物N-糖基化修飾系統(tǒng)主要由4個(gè)必要元件組成: 糖基化識別序列、糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyl transferase，GT)、糖苷酶、糖底物供體，它們分別負(fù)責(zé)接受、添加、修剪和提供底物以合成寡糖，并進(jìn)一步通過依賴寡糖轉(zhuǎn)移酶(oligosaccharyl transferase，OST)/非依賴OST的途徑將寡糖轉(zhuǎn)移到靶蛋白上[2]。將以上機(jī)制轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌中，實(shí)現(xiàn)N-糖基化重組蛋白，可重塑合成寡糖鏈及重組蛋白修飾，將在糖疫苗生產(chǎn)、糖基化修飾藥物蛋白等方面具有巨大應(yīng)用潛力[3]。目前應(yīng)用較多的是空腸彎曲桿菌來源的N-糖基化寡糖轉(zhuǎn)移酶(Glycosylated oligosaccharide transferase，pglB)即CjpglB和豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)來源的N-糖基化轉(zhuǎn)移酶(N-glycosyltransferase，NGT)即ApNGT兩種糖基化修飾重組蛋白系統(tǒng)，分別在大腸埃希菌的質(zhì)周腔和胞質(zhì)內(nèi)建立了N-糖基化修飾的重組蛋白途徑，其原理如圖1所示。

1.1 依賴寡糖轉(zhuǎn)移酶OST的N-糖基化修飾系統(tǒng)

一般細(xì)菌和古細(xì)菌中都存在 OST 依賴的N-糖基化修飾蛋白途徑，目前研究最清楚的原核糖基化系統(tǒng)來自空腸彎曲桿菌，其中完成N-糖基化功能的 OST 稱為CjPglB，與細(xì)菌毒力和宿主-病原體的相互作用有關(guān)[4]。通常細(xì)菌寡糖通過糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)胞質(zhì)中組裝，然后翻轉(zhuǎn)到質(zhì)周腔中，最終由 OST 轉(zhuǎn)移到受體蛋白上(圖1)。

細(xì)菌和真核生物的 OST 依賴性糖基化系統(tǒng)存在顯著的區(qū)別，這對于糖工程改造生產(chǎn)類人源化糖蛋白非常重要[5]。①細(xì)菌脂聯(lián)寡糖(lipid-linked oligosaccharide，LLO)通常組裝在十一烷基焦磷酸脂上，且與該 LLO 連接的聚糖一般不會(huì)被修剪。②單亞基細(xì)菌 OST如CjPglB 的簡單性使它們更容易進(jìn)行純化和改造，從而促進(jìn)折疊蛋白的翻譯后修飾。③與真核 OST 相比，細(xì)菌 OST 對受體序列和 LLO 有嚴(yán)格的特異性，如一些細(xì)菌 OST除要求其受體序列類似于真核生物 N-X-S/T序列，還需要相對于糖基化天冬酰胺的 X-2(D/E-X-1-N-X+1-S/T, X+1 ≠P)位置的負(fù)電荷殘基(D/E)。目前已經(jīng)鑒定了優(yōu)化的氨基酸序列 D-Q-N-A-T可作為CjPglB的糖基化識別序列 (glycosylation tag，GlycTag)進(jìn)行較高效地糖基化修飾。④就 LLO 特異性而言，細(xì)菌N-連接的 OST 比其真核生物具有更廣泛的聚糖結(jié)構(gòu)松弛性[2]。

圖1 利用大腸埃希菌生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白主要機(jī)制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the main mechanism of N-glycosylated recombinant protein production via Escherichia coliA:依賴OST的N-糖基化系統(tǒng)；B:不依賴OST的N-糖基化系統(tǒng)A:OST-dependent N-glycosylation system; B:OST-independent N-glycosylation system

1.2 非依賴寡糖轉(zhuǎn)移酶OST的N-糖基化修飾系統(tǒng)

近年來，人們發(fā)現(xiàn)了在細(xì)菌胞質(zhì)中發(fā)揮功能的N-和O-連接糖基化系統(tǒng)。這些系統(tǒng)通常糖基化修飾細(xì)胞外黏附蛋白等，促進(jìn)病原菌與人類細(xì)胞的黏附。2013年，瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院Aebi課題組首先將來源于胸膜肺炎放線桿菌的N-糖基化轉(zhuǎn)移酶(ApNGT)轉(zhuǎn)入大腸埃希菌中實(shí)現(xiàn)N-糖基化修飾重組蛋白[6]；體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用 UDP-Glc 或 UDP-Gal 作為可溶性糖供體將單糖轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中的天冬酰胺殘基上啟動(dòng)N-糖基化修飾重組蛋白[7]。隨后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其他幾種NGTs。盡管 ApNGTs 與 OST 缺乏同源性，但它們具有相同的糖基化識別序列 N-X-S/T，引起了人們極大的興趣[8]。Aebi課題組Naegeli等研究開發(fā)了 NGT可識別的其他GlycTag 序列，應(yīng)用這些 GlycTags (如 GGNWTT)成功地在體內(nèi)和體外對不同重組蛋白進(jìn)行了N-糖基化修飾[7]。目前天然存在和工程化改造的 NGTs 已被證明能利用 UDP-GlcN、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-Xyl、GDP-Glc 和 GDP-Man等底物進(jìn)行糖基化修飾重組蛋白[9]。然而，天然的NGTs 不能利用 UDP-GlcNAc 或 UDP-GalNAc 糖供體，使其直接應(yīng)用于生產(chǎn)N-連接和O-連接的人源化糖鏈仍存在困難[10]。

迄今為止，ApNGT已經(jīng)被充分表征并且用于糖工程，在靶蛋白上形成可進(jìn)一步修飾的GlcNAc位點(diǎn)。這種特有的順序性修飾特點(diǎn)可以允許基于 NGT 的系統(tǒng)規(guī)避 OST 系統(tǒng)中存在的還原端糖結(jié)構(gòu)限制的問題[11]。研究發(fā)現(xiàn)，由 NGT 安裝的單個(gè)葡萄糖殘基可以胞內(nèi)組裝成糖聚合物 (可用于疫苗的制備)[12]，多聚唾液酸[11]，N-乙酰乳糖胺和其他巖藻糖基化和唾液酸化形式的乳糖[13-14]。

與依賴 OST的N-糖基化系統(tǒng)相比較，OST 非依賴性途徑在其拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，糖組分和可能的氨基酸連接(包括天冬酰胺、精氨酸、絲氨酸、羥基賴氨酸，羥脯氨酸等)方面更加多樣化[15]，主要具有三個(gè)特點(diǎn)，使它們能夠形成優(yōu)勢互補(bǔ)。①大多數(shù)不依賴于 OST 的系統(tǒng)不需要脂質(zhì)相關(guān)的 GTs 或糖供體，使它們更容易在其原生宿主之外合成和操作[16]；②不依賴于OST的系統(tǒng)通常不需要跨膜運(yùn)輸目標(biāo)蛋白或糖供體，從而使大腸埃希菌細(xì)胞質(zhì)中的糖蛋白合成成為可能[11]；③不依賴于 OST 的系統(tǒng)可按順序依次轉(zhuǎn)移來自糖供體的單糖，不受 LLOs 的 OST 特異性的限制，允許更靈活的模塊化組裝和設(shè)計(jì)。

2 應(yīng)用大腸埃希菌生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白

利用大腸埃希菌生產(chǎn)糖基化基因工程抗體等重組蛋白及糖疫苗是目前熱點(diǎn)研究方向。自2012年Aebi課題組首次在大腸埃希菌實(shí)現(xiàn)類人源化糖鏈Man3GlcNAc2核心五糖N-糖基化修飾重組蛋白后，利用多種原核生物進(jìn)行糖基化修飾的技術(shù)一直在不斷探索中[17]，其技術(shù)核心是將其他原核生物來源的寡糖轉(zhuǎn)移酶(識別并將寡糖轉(zhuǎn)移到重組蛋白上的糖基化識別序列上)和多種糖基轉(zhuǎn)移酶(非模板驅(qū)動(dòng)合成寡糖)在大腸埃希菌中共表達(dá)，完成寡糖合成及N-糖基化定點(diǎn)修飾蛋白基本過程[18-19]。近幾年研究結(jié)果表明該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)(識別特異氨基酸序列)、均質(zhì)性(糖鏈微觀均質(zhì)、糖蛋白宏觀均質(zhì))修飾重組蛋白，這是真核系統(tǒng)無法比擬的優(yōu)勢。真核細(xì)胞合成的聚糖性質(zhì)較其他合成途徑而言與人的更為相似(圖2)。但是，天然真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)糖表位修飾N-糖基化重組蛋白的均質(zhì)性很低，這種異質(zhì)性源于哺乳動(dòng)物復(fù)合型N-多糖合成的多步驟過程。

圖2 真核細(xì)胞中存在的天然糖基化修飾示意圖Fig.2 Schematic diagram of antibody glycosylation modification in eukaryotic cells

2.1 糖疫苗的生產(chǎn)及優(yōu)化

對于大多數(shù)傳染病，目前的方法還是以疫苗預(yù)防為主。常規(guī)細(xì)菌性疫苗主要包括滅活苗、弱毒苗、類毒苗、多糖疫苗及糖結(jié)合物疫苗(提取細(xì)菌、病毒的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，篩選具有免疫活性的片段)等。多糖疫苗是由于多糖的免疫原性，可將細(xì)菌特異性的多糖純化后制成的疫苗，但因?yàn)槠涿庖咴暂^弱，應(yīng)用性受到限制。糖結(jié)合物疫苗主要由載體蛋白、聚糖抗原和佐劑三部分組成。機(jī)體遇到特定聚糖如細(xì)菌莢膜多糖O-抗原(通常是由較小糖基序的重復(fù)單元組成)會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，載體蛋白可以作為免疫佐劑與多糖共同配制或共價(jià)連接增強(qiáng)機(jī)體對疫苗的免疫應(yīng)答[20]。自1980年，第一支利用B型流感嗜血桿菌莢膜多糖預(yù)防其感染的抗菌糖疫苗獲得批準(zhǔn)以來，糖結(jié)合物疫苗的研發(fā)在預(yù)防疾病方面已經(jīng)取得很大的進(jìn)步[21]。

2.1.1 大腸埃希菌體內(nèi)生產(chǎn)糖疫苗 迄今為止，在大腸埃希菌體內(nèi)生產(chǎn)的糖結(jié)合物疫苗主要包括預(yù)防1型痢疾鏈球菌、2a型福氏志賀菌、土拉熱弗朗西斯菌等細(xì)菌的感染(表1)。目前此方法以低廉的成本和更為安全的生產(chǎn)環(huán)境成為熱門研究方向。該方法又稱生物偶聯(lián)或蛋白聚糖偶聯(lián)技術(shù)(protein glycan coupling technology，PGCT)，主要是由LLO生物合成、載體蛋白和OST的表達(dá)以及體內(nèi)糖偶聯(lián)幾個(gè)步驟組成[22]。2004年利用PGCT技術(shù)和化學(xué)方法針對B型流感嗜血桿菌治療肺炎腦膜炎的第一支糖結(jié)合物疫苗(Hib)在古巴批準(zhǔn)使用[23]。后來，利用此技術(shù)成功生產(chǎn)出了針對2a型福氏志賀菌[24]、腸致病性大腸埃希菌[25]、假馬氏伯克霍爾德氏菌[26]、O157型大腸埃希菌[27]、土拉費(fèi)朗西斯菌[28-29]、金黃色葡萄球菌[30]和肺炎鏈球菌[31-32]的多種糖結(jié)合物疫苗。另一方面由于pglB對于糖供體底物有較為嚴(yán)苛的底物特異性使O-連接的OST無法在菌體內(nèi)生產(chǎn)糖結(jié)合物疫苗。目前已開發(fā)多種屬OST，如腦膜炎耐瑟菌來源的pglL可用于生產(chǎn)針對2a型福氏志賀菌[33]和腸傷寒沙門氏菌血清型[34]，而結(jié)核分支桿菌來源的pglS則可用于生產(chǎn)針對肺炎鏈球菌[35]和致病性肺炎克雷伯菌的糖結(jié)合物疫苗[36]。

表1 細(xì)菌糖工程方法生產(chǎn)細(xì)菌糖結(jié)合物疫苗

對比化學(xué)方法合成疫苗的生產(chǎn)方式，在工程菌株體內(nèi)合成糖疫苗等具有許多優(yōu)點(diǎn)。首先，通過基因工程改造可以使多糖選擇性增加，其次整個(gè)糖結(jié)合物疫苗的產(chǎn)生過程可以轉(zhuǎn)移到大腸埃希菌工程菌體內(nèi)[38]，表明糖疫苗可以完全不涉及病原菌體而進(jìn)行生產(chǎn)。多糖成分和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白均在菌體內(nèi)鏈接，意味著在糖復(fù)合物產(chǎn)生前不需用任何純化步驟，并且蛋白表達(dá)的純化過程也因?yàn)榭煽匦愿叨兊酶咏?jīng)濟(jì)高效。將不同質(zhì)粒(分別攜帶編碼pglB、合成寡糖鏈所需酶、受體蛋白的基因)共轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌工程菌株體內(nèi)并誘導(dǎo)表達(dá)成功，就可以得到糖蛋白復(fù)合物；若受體蛋白或多糖需要更換，只需更換相應(yīng)質(zhì)粒，就可以高效表達(dá)相應(yīng)糖結(jié)合物。

2.1.2 利用細(xì)菌外膜囊泡生產(chǎn)糖疫苗 糖結(jié)合物疫苗還能以細(xì)菌外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMV)與糖鏈結(jié)合方式生產(chǎn)。OMV是一種由革蘭陰性桿菌外膜釋放的脂質(zhì)體(20～200 nm)，其組成成分與細(xì)菌外膜相似，包括膜蛋白、莢膜多糖、脂寡糖、脂多糖以及質(zhì)周腔的一些成分等[43]，具有很強(qiáng)的免疫原性[44-46]。此外，OMV還具有免疫佐劑的特性，使其制作為疫苗更為簡便[47-48]。目前，天然的OMV攜帶的免疫原性蛋白可與外膜蛋白基因融合以重組的形式表達(dá)在OMV的表面或質(zhì)周腔中，并未改變免疫原性[47,49]。這種利用細(xì)菌糖工程方法并基于OMV的形式生產(chǎn)的糖結(jié)合物疫苗，即將具有免疫原性的多糖重組展示在OMV的表面，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①在第二糖基轉(zhuǎn)移酶基因WbbL[50]中插入IS元件使菌株失去生成O-抗原多糖的能力并可保留翻轉(zhuǎn)酶和連接酶基因在內(nèi)的其余機(jī)制；②大腸埃希菌體內(nèi)可以重組表達(dá)非天然多糖；③O-抗原連接酶Waal的糖特異性較差，可在缺乏天然O-抗原的細(xì)胞中將工程多糖從und-PP轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)A中[51]；④重組O-抗原可被運(yùn)送至細(xì)胞表面并以O(shè)MV的形式釋放。

2.1.3 利用大腸埃希菌生產(chǎn)糖疫苗的優(yōu)化 一些糖結(jié)合物疫苗需要佐劑的參與從而增強(qiáng)機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。但是大多數(shù)佐劑疫苗為免疫刺激分子和抗原的共制劑，這些分子在體內(nèi)容易分離，佐劑的作用可能會(huì)喪失。最近發(fā)現(xiàn)：①一些聚糖可以使位點(diǎn)特異性修飾的糖蛋白綴合物識別自身表位，如α-Gal基序，從而在與各種肽、蛋白質(zhì)、全細(xì)胞和基于納米顆粒的免疫原結(jié)合時(shí)發(fā)揮免疫佐劑的作用[52-57]，可以有效提高疫苗有效性，有助于新疫苗的開發(fā)應(yīng)用，可以使生產(chǎn)的疫苗具有靶向樹突狀細(xì)胞上的DC-SIGN受體，然后通過MHC I類限制和II類限制呈遞抗原，最終使抗原特異性抗體的滴度增加[58]；②類人源寡糖鏈中的Sia2-3Gal結(jié)構(gòu)通過與巨噬細(xì)胞表面的siglec1(Sn，CD169)結(jié)合來實(shí)現(xiàn)抗原的靶向和內(nèi)吞作用，最終致使向T細(xì)胞呈遞的抗原增加[59]。

2.2 糖重組蛋白表達(dá)及優(yōu)化

N-糖基化修飾可以增加治療性蛋白的穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[60]。雖然糖基化修飾對每種蛋白質(zhì)的影響可能不同，但研究顯示N-糖基化修飾可通過以下方式改善蛋白的理化性質(zhì)：①通過屏蔽非結(jié)構(gòu)化、疏水性或易于蛋白酶作用的蛋白質(zhì)區(qū)域來防止變性、聚集和降解[60]；②增加分子的分子量和流體動(dòng)力學(xué)半徑以減少腎濾過[61]； ③去除免疫原性，減少免疫系統(tǒng)清除[62]；④覆蓋或去除可被人凝集素識別/清除的末端結(jié)構(gòu)[63]。下文簡要總結(jié)了利用大腸埃希菌構(gòu)建不同N-糖基化修飾途徑合成治療性糖蛋白、優(yōu)化理化性質(zhì)的幾個(gè)應(yīng)用實(shí)例(圖3)。

圖3 利用大腸埃希菌生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白的途徑示意圖Fig.3 Schematic diagram of the production of N-glycosylated recombinant proteins using Escherichia coliA:在大腸埃希菌內(nèi)N-糖基化修飾重組蛋白途徑；B:無細(xì)胞糖蛋白合成途徑A:Recombinant protein pathway modified by N-glycosylation in Escherichia coli; B:Cell-free glycoprotein synthesis pathway

2.2.1 胞質(zhì)內(nèi)合成途徑 目前在胞質(zhì)中構(gòu)建的N-糖基化修飾蛋白途徑多是基于NGT構(gòu)建的非OST依賴系統(tǒng)。Yates等[64]于2019年利用糖基轉(zhuǎn)移酶ApNGT在胞質(zhì)中構(gòu)建了類人源寡糖鏈三糖(Neu5Ac-α-2,3-Gal-β-1,4-Glc-)的合成途徑，可以進(jìn)一步被來源于不同種屬的糖基轉(zhuǎn)移酶等(包括脂寡糖、脂多糖和莢膜多糖合成途徑來源的酶)延伸，最終形成多聚唾液酸修飾的糖蛋白復(fù)合物等，其多聚唾液酸聚合度為10～80，糖基化效率為20%左右。但是該方法需要外源添加價(jià)格昂貴的Neu5Ac，菌體也需進(jìn)一步進(jìn)行代謝途徑改造。由 NGT 轉(zhuǎn)移的單個(gè)葡萄糖殘基可通過葡萄糖聚合酶(α-1,6 GlcT)延伸成葡聚糖聚合物[65]；或形成Glc短肽后進(jìn)一步聯(lián)合應(yīng)用化學(xué)-酶法，通過內(nèi)切糖苷酶的轉(zhuǎn)糖基作用產(chǎn)生高甘露糖型或唾液酸修飾的平分型GlcNAc[66-67]。研究表明在生產(chǎn)單克隆抗體糖復(fù)合物時(shí)，與使用空腸彎曲桿菌pglB糖基化識別序列相比，使用此酶識別N-X-T糖基化序列可縮短蛋白糖基化反應(yīng)時(shí)間，雖然糖基化效率沒有相應(yīng)提高，但使得在大腸埃希菌體內(nèi)建立人源化N-糖基化修飾途徑(如完全人源化聚唾液酸修飾糖蛋白)逐步得到實(shí)現(xiàn)[68]。

2.2.2 質(zhì)周腔合成途徑 目前在質(zhì)周腔構(gòu)建的N-糖基化修飾蛋白途徑大多是基于CjpglB構(gòu)建的OST依賴系統(tǒng)，近10年來先后生產(chǎn)了均質(zhì)性較高的原核生物七糖(GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,4-[Glc-β-1,3-]GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,4-GalNAc-α-1,3-Bac-β1)[1]、真核生物核心五糖(Man3GlcNAc2)[17]、類人源四糖(Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-)[69]及末端唾液酸化類人源五糖(Neu5Ac-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc-)[70]等(表2)寡糖鏈修飾的多種N-糖基化重組蛋白，如單鏈抗體、單體擬抗體及骨架蛋白等[71-72]。 胡學(xué)軍課題組于2017年以流感嗜血桿菌寡糖合成機(jī)制和空腸彎曲桿菌寡糖翻轉(zhuǎn)酶和寡糖轉(zhuǎn)移酶為基礎(chǔ)，建立了高效的類人源化四糖鏈N-糖基化修飾重組蛋白系統(tǒng)，優(yōu)化后N-糖基化修飾效率可達(dá)到100%[69]，增加了重組蛋白穩(wěn)定性[71]；并于2020年進(jìn)一步以空腸彎曲桿菌唾液酸合成酶基因簇NeuBCA和多種微生物來源的唾液酸轉(zhuǎn)移酶為基礎(chǔ)，首次在大腸埃希菌中構(gòu)建了末端唾液酸修飾類人源化N-糖基化寡糖鏈(Neu5Ac-α2,6/2,3-Gal-β-1,4-GlcNAc-β-1,3-Gal-β-1,3-GlcNAc)合成途徑[70]，此寡糖鏈長度和天然的單天線寡糖長度相近。該系統(tǒng)的優(yōu)勢是在大腸埃希菌中構(gòu)建了唾液酸合成及活化途徑，菌體可自主生產(chǎn)唾液酸修飾所需昂貴的一磷酸胞嘧啶唾液酸(CMP-Neu5Ac)，大大降低了生產(chǎn)成本。有研究表明唾液酸修飾重組蛋白可提高其可溶性等多項(xiàng)生物物理性質(zhì)，α-2,6唾液酸化N-糖基化修飾重組蛋白可顯著增加其體內(nèi)半衰期。

表2 利用大腸埃希菌合成的均質(zhì)性糖鏈

2.2.3 胞外分泌合成途徑 為了實(shí)現(xiàn)利用大腸埃希菌進(jìn)行N-糖基化修飾重組蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，不僅需要解決上述糖基化效率低問題，還需在降低生產(chǎn)成本及提高總產(chǎn)量方面取得突破性進(jìn)展。利用大腸埃希菌細(xì)胞工廠進(jìn)行胞外分泌生產(chǎn)糖基化蛋白具有顯著優(yōu)點(diǎn)，如正確折疊重組蛋白，提高產(chǎn)量及便于分離純化等。雖然YebF等分泌蛋白可以攜帶重組N-糖蛋白進(jìn)入培養(yǎng)基，但隨后的酶消化或下游變性是必需的步驟[73]，因此不利于提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和簡化下游純化步驟，然而這對于減低重組糖蛋白的生產(chǎn)成本是非常重要的。在質(zhì)周腔中表達(dá)重組蛋白因?yàn)榭臻g限制等原因，往往遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于在胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)量。但是CjpglB只有在大腸埃希菌質(zhì)周腔中才能進(jìn)行N-糖基化修飾重組蛋白，所以重組蛋白需由信號肽定位到質(zhì)周腔，結(jié)果導(dǎo)致糖蛋白產(chǎn)量受限。另一方面當(dāng)N-糖蛋白在滲漏型大腸埃希菌質(zhì)周腔表達(dá)時(shí)，此受體蛋白可能在被CjpglB識別之前就泄漏到胞外，不能及時(shí)與寡糖鏈連接，從而引起糖基化效率的總體降低。胡學(xué)軍課題組于2019年應(yīng)用自動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)方法結(jié)合敲出外膜脂蛋白lpp基因大腸埃希菌菌株，糖基化效率從目前報(bào)道的30%～75%，提高到100%。通過該技術(shù)糖基化小分子抗體總產(chǎn)量提高了3～5 倍，并且可以使糖基化抗體直接分泌到培養(yǎng)基中，分離純化時(shí)不再需要破碎細(xì)菌[71]，可直接從培養(yǎng)基中分離純化糖基化的抗體片段，大大簡化了下游分離純化程序，建立了高效生產(chǎn)糖基化重組蛋白技術(shù)平臺(tái)，為該技術(shù)走向應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2.2.4 cell-free合成系統(tǒng) 無細(xì)胞蛋白合成(cell-free protein synthesis，CFPS)系統(tǒng)突破活細(xì)胞限制，利用大腸埃希菌裂解物、氨基酸、核酸及輔助因子等，在試管中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成反應(yīng)[74]。CFPS系統(tǒng)始于1958年，Hoagland等首次脫離活細(xì)胞結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成[75]，隨后CFPS被用于氨基酸遺傳密碼子破譯[76]?；诖竽c埃希菌粗裂解物的無細(xì)胞蛋白合成技術(shù)在21世紀(jì)中期快速廣泛發(fā)展，建立了反應(yīng)成本低[77]、可持續(xù)運(yùn)行[78]、產(chǎn)量可達(dá)(2.67±0.06) g/L的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)[79]，并突破技術(shù)瓶頸獲得膜蛋白[80]、含非經(jīng)典氨基酸蛋白[81]、含二硫鍵蛋白等可正確折疊的蛋白質(zhì)產(chǎn)物[82]。CFPS兼得細(xì)菌體內(nèi)及體外合成系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，使復(fù)雜生物分子的生產(chǎn)研究更加高效、可控、易操作，在糖蛋白合成領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景。Guarino等[83]、Jaroentomeechai等[84]在2011年首次將純化的CjpglB和LLOs引入基于大腸埃希菌的CFPS反應(yīng)中，開發(fā)了“單鍋法”無細(xì)胞糖蛋白合成平臺(tái)(Cell-free Glycoprotein Synthesis，CFGpS)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白體外合成和糖基化修飾同時(shí)完成。目前，CFGpS平臺(tái)可合成包括空腸彎曲桿菌七糖及真核生物核心五糖修飾在內(nèi)的多種聚糖，并已應(yīng)用于糖復(fù)合疫苗合成[85]。Schoborg等[86]將脂質(zhì)納米盤作為細(xì)胞膜模擬物，利用CFPS系統(tǒng)高效產(chǎn)出多種活性構(gòu)象的OSTs，可識別不同N-糖基化受體序列，完成多種靶蛋白體外N-糖基化修飾，省去OSTs在細(xì)菌中表達(dá)、純化及加工等步驟。此外，基于CFPS系統(tǒng)合成NGTs、OGTs、GalNAcTs等糖基轉(zhuǎn)移酶并脫離活細(xì)胞完成體外糖基化修飾，建立了非OST依賴的無細(xì)胞糖基化體外修飾新途徑[87-89]。其中，GlycoPRIME(Glycosylation Pathway assembly by RapidInvitroMixing and Expression)體外糖基化途徑通過CFPS富集GTs并以模塊化混合匹配的方式進(jìn)行靶蛋白糖鏈合成，已實(shí)現(xiàn)37種由ApNGT起始的糖鏈合成途徑并獲得23種不同的聚糖結(jié)構(gòu)[13]。

3 展 望

目前，利用大腸埃希菌解決了均質(zhì)性修飾N-糖基化修飾重組蛋白問題。該技術(shù)有望首先在糖疫苗生產(chǎn)方面得到產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。利用大腸埃希菌生產(chǎn)N-糖基化蛋白主要問題一是表達(dá)宿主穩(wěn)定性差，二是目的蛋白總表達(dá)量偏低。

有研究表明可通過敲除大腸埃希菌的外膜蛋白基因或篩選高效的信號肽系統(tǒng)，使糖基化重組蛋白分泌至培養(yǎng)基中，解決菌體代謝負(fù)擔(dān)過重問題，可提高重組蛋白產(chǎn)量。采用cell-free系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)“一鍋法”反應(yīng)方案，將蛋白質(zhì)的生物合成與天冬酰胺連接的蛋白質(zhì)糖基化在體外完成，這一方法能否大規(guī)模生產(chǎn)糖基化重組蛋白，有待于進(jìn)一步研究。

大腸埃希菌體內(nèi)生產(chǎn)的多數(shù)N-糖基化重組蛋白是通過多質(zhì)粒系統(tǒng)完成的，造成菌株穩(wěn)定性差，使生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白產(chǎn)量低。根據(jù)合成生物學(xué)成功經(jīng)驗(yàn)，將編碼不同功能模塊的基因簇整合在大腸埃希菌的基因組上，通過優(yōu)化不同模塊間表達(dá)水平，形成穩(wěn)定的高效生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的宿主細(xì)胞，是提高目標(biāo)產(chǎn)物有效方法之一。這一方案能否應(yīng)用于大腸埃希菌N-糖基化修飾重組蛋白生產(chǎn)來解決菌株穩(wěn)定性問題有待深入研究。

2022 年初，Terra等[4]將空腸彎曲桿菌來源的編碼寡糖轉(zhuǎn)移酶pglB基因整合到大腸埃希菌基因組上，發(fā)現(xiàn)能提高菌株穩(wěn)定性。將N-糖基化過程中執(zhí)行各種功能的模塊，包括唾液酸合成與修飾功能模塊、寡糖合成功能模塊、寡糖修飾重組蛋白功能模塊整合到大腸埃希菌基因組上，通過優(yōu)化各模塊功能，構(gòu)建各模塊間功能協(xié)調(diào)作用，有望能構(gòu)建成高效、大規(guī)模生產(chǎn)N-糖基化重組蛋白的底盤細(xì)胞。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，這一方法是非常值得嘗試的解決宿主穩(wěn)定性的方案。