李思博 關(guān)梅村 曹艷菲 姜旭東 張麗娜＊

(1、佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍 江佳木斯 154000 2、佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍 江佳木斯 154000 3、大慶油田總醫(yī)院，黑龍 江大慶 163411）

作為WHOⅣ級膠質(zhì)瘤，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的成人原發(fā)性腦腫瘤，盡管積極的接受治療，但患者的中位生存期依舊不足兩年[1]。目前仍然缺乏十分有效的治療手段來對抗這一頑固性的癌癥。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具有強(qiáng)大增殖能力和侵襲能力，特別是對瘤旁正常組織的影響，這是由于腫瘤微環(huán)境中存在復(fù)雜的分子間相互作用調(diào)控機(jī)制。所以尋找可以作為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤診治的靶向分子，闡明其臨床轉(zhuǎn)化價值，從而為這一疾病提供重要的見解。

組蛋白伴侶抗沉默功能蛋白1B（anti-silencing function 1B, ASF1B）是一種重要的組蛋白伴侶蛋白，其主要功能是參與細(xì)胞增殖[2,3]。早期研究表明ASF1B 過表達(dá)與乳腺癌預(yù)后相關(guān)，ASF1B 敲除后顯著的抑制細(xì)胞增殖[4]。在另一項研究Liu 等[5]發(fā)現(xiàn)ASF1B 通過穩(wěn)定CDK9 蛋白表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌的惡性進(jìn)展，初步的揭示了ASF1B 的促癌機(jī)制。 基因富集分析 (gene set enrichment analysis, GSEA) 數(shù)據(jù)表明ASF1B 相關(guān)基因富集于增殖和免疫相關(guān)通路[6]。在肺腺癌中, ASF1B 通過抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[6]。這些研究證實了ASF1B 作為促癌基因的潛力。然而在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，ASF1B 的腫瘤生物學(xué)功能仍然未見報道。所以，本研究擬通過應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)挖掘ASF1B 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的潛在功能，并預(yù)測其臨床轉(zhuǎn)化價值。

1 資料與方法

1.1 從TCGA 數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)

從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)是最為全面的人類基因組計劃之一，其主要功能是分析并提供不同類癌癥基因組序列表達(dá)、甲基化等相關(guān)數(shù)據(jù)[7]。我們從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載156 例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及5 例正常腦組織mRNA 表達(dá)原始數(shù)據(jù)，通過R 語言軟件中DEseq2包進(jìn)行DEG(differetrial expression genes)分析。

1.2 GEPIA 數(shù)據(jù)分析

基因表達(dá)譜交互分析 (Gene Expression Profiling Interactive Analysis, GEPIA)提供了包括差異表達(dá)分析、圖譜繪制和相關(guān)性分析等可定制功能，可以將大多數(shù)癌癥與各自的正常組織或各種癌癥亞型進(jìn)行數(shù)據(jù)差異表達(dá)分析[8]。我們通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫對ASF1B 在膠質(zhì)瘤以及正常腦組織mRNA 的表達(dá)水平進(jìn)行了分析。

1.3 CCLE 數(shù)據(jù)庫分析

癌細(xì)胞百科全書(Cancer Cell Line Encyclopedia,CCLE)是對癌細(xì)胞的遺傳信息進(jìn)行大規(guī)模分析，為癌癥新驅(qū)動分子的研究提供了嚴(yán)格的框架[9]。本研究通過CCLE 數(shù)據(jù)庫分析了ASF1B 在各類癌癥中的表達(dá)情況。

1.4 HPA 數(shù)據(jù)庫分析

人蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(Human Protein Atlas,HPA) 是一個開放式數(shù)據(jù)獲取數(shù)據(jù)庫，可以檢索全基因組范圍內(nèi)單個蛋白表達(dá)與臨床結(jié)果的相關(guān)性[10]。本研究通過檢索HPA 數(shù)據(jù)庫分析了ASF1B 在高級別膠質(zhì)瘤以及正常腦組織蛋白表達(dá)情況。

1.5 PrognoScan 數(shù)據(jù)庫分析

PrognoScan 數(shù)據(jù)庫通過評估潛在的腫瘤標(biāo)記物和治療靶點與患者生存期之間的相關(guān)性來深入研究癌癥[11]。我們利用PrognoScan 數(shù)據(jù)庫分析了ASF1B 與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究中TCGA 數(shù)據(jù)由R 語言Deseq2 包進(jìn)行統(tǒng)計分析。其他生物信息學(xué)結(jié)果由相應(yīng)數(shù)據(jù)庫自備統(tǒng)計分析系統(tǒng)完成統(tǒng)計，P <0.05 表明結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASF1B 是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中上調(diào)最明顯的基因之一

通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫中156 例原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及5 例正常腦組織樣本mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)(圖1A)，ASF1B 在原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)增高，是上調(diào)最明顯的基因之一(變化倍率5.829612839，P=2.07E-42，圖1B)。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(A)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及正常組織基因表達(dá)散點圖,(B)ASF1B 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤樣本中表達(dá)上調(diào)

2.2 ASF1B 在膠質(zhì)瘤以及正常組織表達(dá)情況

本研究通過GEPIA 數(shù)據(jù)庫分析ASF1B 在正常組織以及膠質(zhì)瘤中的mRNA 表達(dá)水平。結(jié)果顯示與正常組織相比，ASF1B 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，并且在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中ASF1B的表達(dá)水平明顯高于低級別膠質(zhì)瘤(圖2A)，提示ASF1B 的表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展存在密切相關(guān)性，P<0.05。

圖2 GEPIA 數(shù)據(jù)庫(A)ASF1B 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤以及低級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2.3 ASF1B 在腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平

本研究通過CCLE 在線數(shù)據(jù)庫分析了40 種腫瘤細(xì)胞系A(chǔ)SF1B 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示ASF1B 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并且ASF1B 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平要高于多數(shù)腫瘤細(xì)胞系，提示了ASF1B 與膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長發(fā)育的密切關(guān)聯(lián)(圖3A)。

圖3 CCLE 數(shù)據(jù)庫(A)ASF1B 在40 種癌癥細(xì)胞系中的表達(dá)

2.4 ASF1B 在膠質(zhì)瘤組織以及正常腦組織中蛋白表達(dá)水平

我們的研究通過HPA 數(shù)據(jù)庫在線分析了ASF1B 在高級別膠質(zhì)瘤以及人正常腦組織中免疫組織化學(xué)染色結(jié)果。結(jié)果顯示ASF1B 在正常腦組織中染色水平低(圖4A)，而在高級別膠質(zhì)瘤中染色較強(qiáng)(圖4B)。提示ASF1B 蛋白在高級別膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，與ASF1B mRNA 在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)一致。

圖4 HPA 數(shù)據(jù)庫(A)ASF1B 蛋白在正常腦組織中以及(B)在高級別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平

2.5 ASF1B 與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)

我們通過PrognoScan 數(shù)據(jù)庫在線分析了膠質(zhì)瘤以及星形細(xì)胞瘤患者ASF1B 表達(dá)狀態(tài)與患者生存期之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，ASF1B 高水平表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者(圖5A，P<0.05)以及星形細(xì)胞瘤患者(圖5B，P<0.001) 的不良預(yù)后呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性。

圖5 Prognosacn 數(shù)據(jù)庫(A)ASF1B 表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者以及(B)星形細(xì)胞瘤患者預(yù)后相關(guān)性

3 討論

細(xì)胞增殖與腫瘤惡性進(jìn)展密切相關(guān)。ASF 家族是一種保守的組蛋白伴侶，主要有兩個子成員，ASF1A 和ASF1B。與其同源基因功能不同的是，ASF1B 主要在增殖過程中發(fā)揮作用，而ASF1A 則在多種生理過程中均有表達(dá)[12]。ASF1 家族基因與其次級因子相互作用，結(jié)合于組蛋白變體H3.3 和H3.1，并參與核小體組裝過程[13]。但ASF1B 在核小體組裝過程中發(fā)揮的功能仍不清楚。近期的幾項泛癌研究發(fā)現(xiàn)ASF1B 在多數(shù)癌癥中異常表達(dá)，并且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[14,15]。ASF1B 的功能還涉及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和免疫微環(huán)境的細(xì)胞浸潤[14]?？傊?，ASF1B 在其他腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要功能，這讓我們對ASF1B 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中發(fā)揮的腫瘤生物學(xué)功能產(chǎn)生了興趣。

生物信息學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，多種在線數(shù)據(jù)庫可以對單個基因在癌癥中的表達(dá)、預(yù)后相關(guān)性等重要信息進(jìn)行檢索。我們應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)對ASF1B 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)、分級相關(guān)性以及與患者預(yù)后的相關(guān)性進(jìn)行了分析，我們的數(shù)據(jù)初步闡明了ASF1B 與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性進(jìn)展的相關(guān)性。