李崗峰，劉璐，李劉文

榆林市第二醫(yī)院急診科，陜西 榆林 719000

心力衰竭(heart failure，HF)是因心肌病、心肌梗死等原因所致的心肌損傷而引起的心肌結(jié)構(gòu)及功能改變，最終引起心室泵血或充盈功能低下表現(xiàn)的疾病[1-2]。慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)指持續(xù)存在心力衰竭狀態(tài)，可穩(wěn)定、惡化或代償[3]。盡管近年來在控制心血管疾病方面取得了很多進展，但CHF的發(fā)病率仍在增加，因此需要新的診斷和治療方法[4-5]。內(nèi)源性小非編碼RNA(microRNA，miRNA)可以通過加速mRNA 激活來刺激基因表達，或通過與mRNA的3'-非翻譯區(qū)域的不完全序列特異性相互作用來阻止其翻譯。其中miR-208 由α-肌球蛋白重鏈(alpha-myosin heavy chain，α-MHC)內(nèi)含子編碼，并在心臟中特異性表達，證據(jù)表明miR-208 可調(diào)節(jié)心臟發(fā)育，并且參與維持對傳導(dǎo)系統(tǒng)發(fā)育重要的心臟轉(zhuǎn)錄因子的表達，miR-208的表達還與心肌細胞的增殖和分化有關(guān)，并且對心肌細胞凋亡具有重要的調(diào)控作用[6-7]。但目前關(guān)于miR-208在CHF患者中表達情況方面的研究較少。本研究旨在探討血清miR-208水平在CHF患者中的表達及其臨床意義，現(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018 年6 月至2021 年1 月期間榆林市第二醫(yī)院急診科收治150例的CHF患者納入研究。納入標準：①均符合慢性心力衰竭診斷治療指南[8]；②心力衰竭的癥狀至少持續(xù)6 個月；③患者神志清醒，可配合進行相關(guān)檢查。排除標準：①就診前6 個月內(nèi)患者發(fā)生腦血管意外；②急性感染，慢性炎癥；③嚴重心律失常；④急性心肌梗死；⑤惡性腫瘤；⑥肝腎功能衰竭；⑦精神障礙或妊娠者。150患者中男性77 例，女性73例；根據(jù)美國紐約心臟病協(xié)會心功能(NYHA)分級，將患者分為A組(NYHAⅠ～Ⅱ級)46例，B 組(NYHAⅢ級)55 例和C 組(NYHAⅣ級)49 例。選擇我院同期體檢的無CHF 患者46 例作為對照組。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 血清樣本收集 四組受檢者均空腹采集肘靜脈血標本，置含抗凝劑試管中以3 000 r/min 離心10 min，將血清轉(zhuǎn)移至無核酸酶的Eppendorf 管中并儲存于-80℃?zhèn)錂z。

1.3 資料收集 收集所有受檢者的基礎(chǔ)臨床資料，包括：(1)臨床資料：病史、吸煙史、血壓、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)；(2)實驗室檢查指標：常規(guī)血液數(shù)據(jù)、肝腎功能、血糖水平、血脂水平、血清N 端前腦鈉素(NT-proBNP)水平等血液生化指標；(3)影像學(xué)指標：左心室射血分數(shù)等超聲心動圖結(jié)果，以及左心房(LA)直徑和心胸比率等X射線檢查結(jié)果。

1.4 RNA 提取和實時定量PCR (1)總RNA 的提?。菏褂肨RIzol 試劑提取總RNA，以75%乙醇代替異丙醇進行RNA 沉淀。使用NanoDrop 1000 分光光度計測定RNA 質(zhì)量。(2) qRT-PCR：以DBI Bestar qPCR RT 試劑盒(DBI Bioscience，Ludwigshafen，德國)將1 μ g RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用7500 Fast Real-Time PCR，qRT-PCR 條件：在95℃溫育2 min 后進行40 個循環(huán)：95℃退火15 s，60℃60 s。miR-208 PCR 引物由瑞博生物科技有限公司設(shè)計，序列如下：miR-208，F(xiàn)：5'-GTCATCTAGAAAGCTTGATGCAGG AAAGAGCTTTGG-3，R：5'-TGACAGATCTCAGCTG A-CATCCTCTAGGCTGGGGTT-3'；內(nèi)參：U6，F(xiàn)：5'-CT C-GCTTCGGCAGCACATATACT-3'，R：5'-ACGCTTC A-CGAATTTGCGTGTC-3'。使用2-△△Ct公式對miRNA進行定量。重復(fù)3次，取平均值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用Lsd-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；采用Pearson檢驗分析不同指標間的相關(guān)性。均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組受檢者的一般資料比較 四組受檢者的年齡，性別，血壓，高血壓病史或糖尿病病史、BMI及血清空腹血糖、總膽固醇(total cholesterol，TC)，甘油三酯(triglyceride，TG)，肌酐(creatinine，Cr)水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 四組受檢者一般資料比較[±s，例（%）]

表1 四組受檢者一般資料比較[±s，例（%）]

注：1 mmHg=0.133 kPa。

因素年齡男/女高血壓史糖尿病史吸煙者收縮壓(mmHg)舒張壓(mmHg)BMI(kg/m2)空腹血糖(mmol/L)TC(mmol/L)TG(mmol/L)Cr(μmol/L)A組(n=46)65.53±11.74 24(52.17)/22(47.83)18(39.13)10(21.73)12(26.08)125.72±31.93 79.12±22.51 20.45±5.89 5.69±0.83 4.18±1.21 1.28±0.32 86.53±16.52 B組(n=55)64.83±16.21 26(47.27)/29(52.73)30(54.54)12(21.81)14(25.45)129.14±26.41 76.61±17.33 21.37±4.37 5.90±1.32 4.23±1.61 1.33±0.13 91.14±14.36 C組(n=49)63.24±12.38 27(55.10)/22(44.90)28(57.14)14(28.57)14(28.57)127.61±23.62 74.94±12.63 22.88±5.54 5.81±1.68 4.12±0.95 1.39±0.12 88.67±15.29對照組(n=46)59.11±13.76 23(50.00)/23(50.00)21(45.65)10(21.73)9(19.56)121.15±14.21 76.95±10.53 21.99±6.67 6.00±0.99 4.16±0.78 1.29±0.27 95.02±16.12 χ2/F值2.056 0.679 3.956 0.947 1.093 2.000 0.520 1.581 0.510 0.075 2.411 2.551 P值0.108 0.878 0.266 0.814 0.779 0.115 0.670 0.195 0.676 0.973 0.068 0.057

2.2 四組受檢者的血清miR-208 表達水平比較 A 組、B 組和C 組患者的miR-208 相對表達水平分別為1.43±0.30、1.84±0.51、2.11±0.69，均較對照組的0.99±0.14更高，且miR-208表達水平隨心功能NYHA分級升高而升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.100，P＜0.05)。

2.3 四組受檢者的心臟功能指標比較 四組受檢者的NT-proBNP，LVEF，LA直徑和心胸比率比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其中三組患者的NT-proBNP 水平較對照組升高，LVEF 水平降低，LA直徑升高以及心胸比率增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。此 外，患 者NT-proBNP 水 平 隨 心 功 能NYHA 分級升高而升高，LVEF 隨心功能NYHA 分級升高而降低，LA 直徑隨心功能NYHA 分級升高而升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表2 四組受檢者的心臟功能指標比較（±s）

表2 四組受檢者的心臟功能指標比較（±s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與A組比較，bP＜0.05；與B組比較，cP＜0.05。

組別A組B組C組對照組F值P值例數(shù)46 55 49 46 NT-proBNP(pg/mL)432.95±103.88a 519.72±142.73ab 681.99±206.17ac 309.82±95.16 55.353 0.001 LVEF(%)49.21±6.01a 38.56±5.31ab 29.64±2.43ac 58.64±9.45 195.853 0.001 LA直徑(mm)43.31±7.62a 49.69±8.83ab 53.94±4.32ac 37.29±5.97 52.429 0.001心胸比率0.61±0.07a 0.63±0.08a 0.67±0.07a 0.50±0.01 59.544 0.001

2.4 血清miR-208 水平與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清miR-208相對表達水平與患者NT-proBNP，LA直徑正相關(guān)(r=0.784，0.524，P＜0.05)，與LVEF 負相關(guān)(r=-0.375，P＜0.05)，見表3。

表3 血清miR-208與患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3 討論

心肌重構(gòu)是CHF 發(fā)生時機體對于損傷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，研究表明miRNA在心肌重構(gòu)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-10]，比如miR-21 可以通過靶向抑制p27 來影響心肌細胞自噬，而心臟的穩(wěn)態(tài)和功能需要適當?shù)淖允伤竭M行維持，自噬被抑制可能是心肌重構(gòu)的一個重要原因[11]。另有報道，外源性miR-208 可以誘導(dǎo)心臟重塑，并可通過調(diào)節(jié)肥大通路成分的表達，上調(diào)β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)而在壓力依賴性心肌生長過程中具重要作用[12]。雖然已有多項研究證實miRNA 與HF 的進展和預(yù)后密切相關(guān)，但其潛在機制尚未完全明確[13]。因此本研究旨通 過分析CHF患者的血清miR-208表達水平，以研究血清miR-208 作為CHF 患者血清生物標志物的潛力。本研究發(fā)現(xiàn)HF 患者的血清miR-208 水平高于對照組，且心功能分級越高，血清miR-208 水平越高，這些結(jié)果表明血清miR-208 水平與CHF 的發(fā)病和嚴重程度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miR-208 在心臟發(fā)育和心臟病理學(xué)過程中差異表達，與其宿主基因α-肌球蛋白(α-MHC)和β-肌球蛋白(β-MHC)表達平行[14]，該研究結(jié)果表明miR-208 在心臟中過度表達可誘導(dǎo)心肌肥大，這一過程可能與miR-208對靶向甲狀腺激素相關(guān)蛋白1和肌肉生長抑制素有關(guān)，上述因子均是肌肉生長和肥大的重要負調(diào)節(jié)因子；另外miR-208對于正常心臟傳導(dǎo)也有重要作用，心臟傳導(dǎo)功能獲得和喪失與心律失常有關(guān)。因此，血清中異常的miR-208 表達水平可能意味著甲狀腺激素相關(guān)蛋白1 和肌肉生長抑制素的失調(diào)控，進而導(dǎo)致心力衰竭嚴重程度增加。

本研究還發(fā)現(xiàn)，CHF組患者的NT-proBNP水平較高，LVEF較低，LA直徑較大，心胸比率更高。提示心功能指標：包括NT-proBNP 水平，LVEF，LA 直徑和心胸比率與CHF 的發(fā)展和進展密切相關(guān)。過去的報道顯示NT-proBNP表達可以作為CHF的一個風險參數(shù)，NT-proBNP 的表達與CHF、中風和死亡風險增加呈正相關(guān)[15]。這與本研究中CHF 患者NT-proBNP 水平明顯高于對照組的結(jié)果相一致。為了更好地了解血清miR-208 水平與心臟功能指數(shù)之間的相關(guān)性，本研究進行了Pearson相關(guān)分析以探討各指標相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-208 血清水平與LVEF 呈負相關(guān)，而與NT-proBNP，LA 直徑和心胸比呈正相關(guān)，關(guān)于miR-208對上述指標的影響機制尚未明確。過去的研究結(jié)果顯示：miR-208可能參與調(diào)節(jié)心肌肥厚，心肌纖維化和心肌離子通道變化的病理過程[16]。這可能是血清miR-208水平升高對上述心臟功能指標影響的基礎(chǔ)。

總之，本研究表明，CHF 患者的血清miR-208 表達水平升高，隨患者NYHA分級升高而愈加明顯。此外，血清miR-208水平與心臟功能指數(shù)(包括NT-proBNP 水 平，LVEF，LA 直 徑 和 心 胸 比)密 切 相 關(guān)。miR-208 血清水平可作為評估CHF 嚴重程度的潛在生物標志物。為了證實這些結(jié)果，還需要對更多的來自其他人群的患者進行相關(guān)研究。