王芳，王麗春，商麗紅，陳華，李詠梅，哈春芳，5

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床學(xué)院，寧夏 銀川 750004；

2.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，寧夏 銀川 750004；

3.寧夏銀川市婦幼保健院，寧夏 銀川 750004；

4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，寧夏 銀川 750004；

5.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750004

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)是指伴隨經(jīng)血逆流的子宮內(nèi)膜在宮腔外異質(zhì)性生長形成的一種全身性慢性炎癥性疾病，與慢性盆腔疼痛、不孕和月經(jīng)紊亂有關(guān)。研究顯示，大約10%的育齡期女性患有子宮內(nèi)膜異位癥，其中合并不孕癥者約50%，嚴(yán)重影響患者的心理和社會(huì)福祉[1-2]。盡管付出了巨大努力，但子宮內(nèi)膜異位癥的病理生理學(xué)仍是生殖醫(yī)學(xué)中的一個(gè)未解之謎。新近研究表明，該疾病的發(fā)展是多因素的，涉及激素、免疫、環(huán)境和遺傳因素[3-4]。此外有研究報(bào)道，逆行子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、黏附和侵襲性增加所引起的生物表型變化促進(jìn)了內(nèi)異癥的發(fā)展，因此，需要深入探索相關(guān)基因在EMs 中的致病機(jī)制并在此策略基礎(chǔ)上開發(fā)新的藥物治療。

研究表明，原癌基因RAS蛋白作為絲蘇氨酸蛋白激酶(MAPK)/ERK 途徑的上游通路分子在促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)功能中起著分子開關(guān)的作用，但其在內(nèi)異癥中的具體作用機(jī)制未有報(bào)道[5]。MAPK 是絲氨酸-蘇氨酸激酶，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。內(nèi)異癥相關(guān)研究顯示：MAPK通路似乎在子宮內(nèi)膜異位癥細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。與健康女性相比，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖和存活的增強(qiáng)與MAPK 信號(hào)通路的異常激活有關(guān)[6]。本課題組前期通過表達(dá)譜芯片測(cè)序分析了子宮內(nèi)膜異位癥中差異基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)RAS、絲裂原活化蛋白激酶(MEK)等因子顯著上調(diào)，但兩者在EMs中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚不清楚。因此本研究建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，旨在探討EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組織中RAS與MEK的表達(dá)水平及其與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性未孕大鼠20只，鼠齡6～8 周，體質(zhì)量(200±20)g，購買并飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。模型組大鼠及對(duì)照組大鼠各10 只，各組間鼠齡和重量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該實(shí)驗(yàn)經(jīng)由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 兔多克隆抗體RAS(ab52939)和兔多克隆抗體MEK(ab178876)購自英國Abcam 公司。SYBR?Premix Ex Taq(RR820A)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047A)均購自日本TaKaRa 公司，BCA 蛋白提取試劑盒和蛋白檢測(cè)試劑盒購自凱基公司。免疫組化檢測(cè)試劑盒和DAB 顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型 建立大鼠清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)1周，手術(shù)前2 d 以戊酸雌二醇0.5 mg/kg 灌胃統(tǒng)一動(dòng)情周期。自體移植法建模[7]：大鼠稱重后1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。腹部備皮，常規(guī)消毒后于尿道口上方1 cm處切開長約2 cm 的縱行切口，逐層進(jìn)腹，找到雙角子宮，分離并剪下約1.5 cm 長的左側(cè)子宮放入生理鹽水中，沖洗干凈后分離子宮內(nèi)膜組織，并將其剪成5 mm×5 mm 大小四塊，內(nèi)膜面貼腹壁用6～0 可吸收線四角縫合固定于兩側(cè)腹壁血運(yùn)豐富處，逐層關(guān)腹，待大鼠自然蘇醒，其中對(duì)照組大鼠只開關(guān)腹不行內(nèi)膜移植。術(shù)后肌注青霉素(1.6×105U/kg)連續(xù)3 d。術(shù)后4 周開腹觀察移植物外觀。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：移植物體積增大，形成內(nèi)含淡黃色清亮或者咖啡色液體的囊狀結(jié)構(gòu)，表面及周圍或可見血管形成。

1.2.2 組織病理學(xué)染色(HE) 取EMs 模型組大鼠在位、異位內(nèi)膜組織及對(duì)照組大鼠在位內(nèi)膜組織，于4%多聚甲醛中固定48 h，常規(guī)石蠟包埋切片(厚度5 μm)、切片經(jīng)脫蠟至水，蘇木素染核、分化液分化、返藍(lán)液返藍(lán)、伊紅染色、梯度酒精脫水及二甲苯透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色(IHC) 烤片后，組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水、微波抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，一抗MEK(1：500)、RAS(1：200)4℃冰箱孵育過夜，次日切片復(fù)溫，兔二抗孵育，DAB 顯色，蘇木素染核，梯度酒精脫水，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察各蛋白因子表達(dá)定位情況。

1.2.4 Western blot蛋白檢測(cè) 取大鼠在位及異位內(nèi)膜組織提取總蛋白，按照BCA蛋白檢測(cè)試劑盒使用說明測(cè)定蛋白濃度。每個(gè)加樣孔上樣20 μg 蛋白，經(jīng)電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，一抗MEK(1∶20 000)、RAS(1∶5 000)、β-actin(1∶5 000)4℃孵育過夜。次日室溫孵育，加抗兔二抗(1∶10 000)。加適量ECL增強(qiáng)液在BIO-RAD成像儀中進(jìn)行發(fā)光，采用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行分析，根據(jù)曝光結(jié)果計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)RAS 及MEK mRNA 表達(dá)：提取組織中的總RNA，使用微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度和純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)，融解曲線判斷PCR反應(yīng)的特異性，以GAPDH為內(nèi)參，所得各樣品Ct值利用公式計(jì)算各樣品mRNA的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩樣本間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA 分析，Pearson 相關(guān)分析法分析兩者相關(guān)性。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EMs大鼠模型建立及異位病灶肉眼觀表現(xiàn) 自體移植法建模及異位病灶肉眼觀表現(xiàn)：移植物體積增大，形成內(nèi)含清亮或者咖啡色液體的囊狀結(jié)構(gòu)，表面或周圍可見新生血管及黏連形成，見圖1。

圖1 EMs大鼠模型異位病灶外觀表現(xiàn)

2.2 EMs大鼠在位及異位的內(nèi)膜形態(tài) HE染色可見：與對(duì)照組大鼠相比，異位病灶組織見子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞或者腺體生長，即為模型建立成功，見圖2。

圖2 EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜形態(tài)（HE染色，×200）

2.3 EMs大鼠內(nèi)膜組織中RAS及MEK的表達(dá)定位 免疫組化結(jié)果顯示：RAS 蛋白主要定位于子宮內(nèi)膜腺體及腺上皮細(xì)胞的胞漿中，間質(zhì)及胞核內(nèi)少量表達(dá)。MEK主要定位于子宮內(nèi)膜腺體的胞漿中，胞核內(nèi)少量表達(dá)，見圖3和圖4。

圖3 各組中RAS蛋白的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

圖4 各組MEK蛋白的表達(dá)（免疫組化染色，×400）

2.4 EMs大鼠內(nèi)膜組織中RAS及MEK的表達(dá)比較 Western blot 結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，EMs 大鼠在位及異位內(nèi)膜組中RAS及MEK蛋白相對(duì)表達(dá)水平增高，且EMs 異位內(nèi)膜組表達(dá)高于EMs 在位內(nèi)膜組(FRAS=235.32，P＜0.001；FMEK=272.37，P＜0.001)，見圖5和表2。

表2 RAS及MEK蛋白在三組內(nèi)膜中表達(dá)水平比較（±s）

表2 RAS及MEK蛋白在三組內(nèi)膜中表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與在位內(nèi)膜組比較，bP＜0.01。

組別對(duì)照組EMs在位內(nèi)膜組EMs異位內(nèi)膜組F值P值MEK 0.50±0.05 0.94±0.08a 1.24±0.08b 272.37＜0.01例數(shù)10 10 10 RAS 0.32±0.10 0.86±0.08a 1.15±0.11b 235.32＜0.01

圖5 Western blot 檢測(cè)EMs 大鼠在位/異位內(nèi)膜中RAS及MEK 蛋白表達(dá)

2.5 EMs 大鼠內(nèi)膜組織中RAS 及MEK mRNA的表達(dá)比較 qRT-PCR 結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組中RAS及MEK mRNA表達(dá)水平增高，且EMs異位內(nèi)膜組表達(dá)高于EMs在位內(nèi)膜組(FRAS=248.72，P＜0.001；FMEK=100.28，P＜0.001)，見表3。

表3 RAS及MEK mRNA在三組內(nèi)膜中表達(dá)水平比較（±s）

表3 RAS及MEK mRNA在三組內(nèi)膜中表達(dá)水平比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.01；與在位內(nèi)膜組比較，bP＜0.01。

組別對(duì)照組EMs在位內(nèi)膜組EMs異位內(nèi)膜組F值P值MEK 0.53±0.16 0.94±0.08a 1.24±0.08b 100.28＜0.01例數(shù)10 10 10 RAS 0.32±0.09 0.79±0.08a 1.08±0.06b 248.72＜0.01

2.6 EMs 大鼠在位/異位內(nèi)膜組織RAS 與MEK蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示：EMs 在位內(nèi)膜組和EMs 異位內(nèi)膜組中，RAS 蛋白與MEK 蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r異位內(nèi)膜組=0.68，P=0.032 3；r在位內(nèi)膜組=0.79，P=0.006 9)，見圖6。

圖6 EMs大鼠在位/異位內(nèi)膜中RAS與MEK的相關(guān)性

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥作為一種常見的慢性炎癥性激素依賴性疾病，影響全球數(shù)百萬女性的健康和生活方式。迄今為止，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生發(fā)展的確切病理生理學(xué)機(jī)制尚未確定，但證據(jù)表明，包括卵巢類固醇激素失衡、炎癥、增殖侵襲表型功能轉(zhuǎn)化在內(nèi)的多種因素在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[8-9]。目前治療方式上仍以手術(shù)結(jié)合藥物治療為主，但激素類藥物的不良反應(yīng)和手術(shù)后高復(fù)發(fā)率使得EMs的治療仍面臨巨大的挑戰(zhàn)[10]。因此，探索EMs潛在發(fā)病機(jī)制及新的臨床治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)采用自體移植法誘導(dǎo)建立EMs大鼠模型，旨在探討RAS與MEK表達(dá)及其在內(nèi)異癥的發(fā)生中的相關(guān)性。

RAS蛋白激酶屬于小GTP膜結(jié)合蛋白，被錨定在質(zhì)膜的內(nèi)表面，作為有活性的RAS-GTP 和無活性的RAS-GDP 有序循環(huán)的二元開關(guān)激酶在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮作用[11-12]。研究報(bào)道，RAS 蛋白家族成員與主要下游信號(hào)通路如RAF/MAPK、PI3K/AKT 和細(xì)胞因子激活有關(guān)，從而在癌癥和腫瘤中驅(qū)動(dòng)異常信號(hào)，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，是腫瘤治療的靶點(diǎn)之一[13-14]。已有研究表明，異位內(nèi)膜細(xì)胞增殖侵襲性增強(qiáng)與EMs的發(fā)病存在明顯的相關(guān)性[15]，但EMs 患者異位內(nèi)膜增殖侵襲性增強(qiáng)是否與RAS 蛋白激酶及其下游激酶活化相關(guān)尚不清楚。課題組前期表達(dá)譜芯片測(cè)序分析了子宮內(nèi)膜異位癥中差異基因表達(dá)：發(fā)現(xiàn)RAS、MEK蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，但兩者在EMs 中的表達(dá)及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究建立EMs 大鼠模型，免疫組化結(jié)果顯示，RAS 蛋白在EMs在位及異位內(nèi)膜的腺體、間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞中均有表達(dá)。Western-blot及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示：與對(duì)照組相比，EMs 在位及異位內(nèi)膜組中RAS 蛋白及mRNA的表達(dá)量均增高，異位內(nèi)膜組的表達(dá)水平高于在位內(nèi)膜組(P＜0.05)，揭示RAS 蛋白激酶表達(dá)升高可能與EMs的發(fā)病存在一定的相關(guān)性，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)是絲氨酸-蘇氨酸激酶，在細(xì)胞增殖、細(xì)胞黏附、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。MEK是MAPK家族成員之一，活化后調(diào)控與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞遷移、侵襲等多種生物學(xué)效應(yīng)[16-17]。子宮內(nèi)膜異位癥為子宮內(nèi)膜異位病變的生存提供了獨(dú)特的微環(huán)境，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡。而對(duì)于這些細(xì)胞活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)激酶的級(jí)聯(lián)激活是必需的。越來越多的證據(jù)表明，子宮內(nèi)膜異位癥作為一個(gè)多因素調(diào)控的復(fù)雜的激素依賴性炎性疾病，MAPK激酶級(jí)聯(lián)的異?；罨贓Ms發(fā)病關(guān)系中發(fā)揮了始動(dòng)作用，但其具體作用機(jī)制仍然不清[18-21]。本研究免疫組化結(jié)果顯示：MEK蛋白主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺體及腺上皮細(xì)胞的胞漿中。Western-blot及qRT-PCR檢測(cè)EMs在位及異位內(nèi)膜組中MEK蛋白及mRNA表達(dá)均顯著增高(P＜0.05)，說明EMs中MEK蛋白處于過度活化狀態(tài)，其可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)。腫瘤研究表明，活化的RAS募集級(jí)聯(lián)反應(yīng)并激活MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的MEK1/2，使其完全激活進(jìn)而活化各種下游應(yīng)答分子，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲、存活等多種細(xì)胞功能[22-23]。本實(shí)驗(yàn)從蛋白及基因水平證實(shí)RAS與MEK蛋白在EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組織中高表達(dá)，進(jìn)一步分析二者在EMs大鼠在位及異位內(nèi)膜組織中表達(dá)均呈正相關(guān)，提示二者表達(dá)相輔相成，可能與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生密切相關(guān)，但其具體的調(diào)控機(jī)制有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RAS 與MEK 蛋白在EMs大鼠內(nèi)膜組織中表達(dá)增高且呈正相關(guān)，推測(cè)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生可能與兩者相互協(xié)同作用相關(guān)。后續(xù)本課題擬進(jìn)一步通過臨床組織水平及細(xì)胞水平驗(yàn)證RAS蛋白活化MEK表達(dá)影響EMs間質(zhì)細(xì)胞增殖侵襲性的具體調(diào)控機(jī)制，為內(nèi)異癥的潛在治療靶點(diǎn)提供系統(tǒng)深入的研究。