王奇 楊鵬 孫建軍 姚紹華

萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院骨科，江西 萍鄉(xiāng) 337000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是多發(fā)于老年及絕經(jīng)后婦女的一種以骨量減少、骨結(jié)構(gòu)異常及骨脆性增加為特征的代謝性骨骼疾病，可導(dǎo)致骨折，嚴(yán)重影響患者生命健康[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激可導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡、減弱成骨分化，與OP患者骨密度及骨量減少關(guān)系密切。研究[4]報(bào)道，何首烏中有效成分-二苯乙烯苷(tetrahydroxy stilbene glycoside，TSG)具有較好的抗氧化應(yīng)激作用，能通過降低成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平來抵抗成骨細(xì)胞凋亡，這預(yù)示TSG可能對(duì)OP骨丟失有一定的治療作用，但其作用機(jī)制還不明確。微小RNA(microRNA，miRNA)是骨骼代謝的重要調(diào)節(jié)劑，研究[5]發(fā)現(xiàn)在骨密度(bone mineral density, BMD)異常降低的老年人體內(nèi)miR-34a水平顯著高于正常成年人，且miR-34a也可靶向調(diào)控沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激、衰老及凋亡等多種生理過程[6]。但miR-34a/SIRT1是否能通過調(diào)控氧化應(yīng)激及凋亡作用，來緩解OP患者骨密度降低及骨丟失進(jìn)程，目前還研究較少。本研究將通過體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，探討二苯乙烯苷(TSG)調(diào)控miR-34a/SIRT1對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠的作用及機(jī)制，為TSG的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞：SPF級(jí)SD雌性大鼠60只，體重200～220 g，6～7周齡，購(gòu)自北京唯尚立德生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK(京)2016-0009，動(dòng)物使用許可證號(hào)為：SYXK(京)2017-0016，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)為：K501397。本試驗(yàn)符合3R原則并經(jīng)萍鄉(xiāng)市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司，批號(hào)：GD-C18518572。

1.1.2主要試劑及儀器：TSG(南京澤朗生物科技有限公司，原料藥，純度≥98%，批號(hào)：BW1537)；miR-34a過表達(dá)載體溶液、miR-34a過表達(dá)陰性載體溶液(北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：SL1048、SL1050)；丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(北京伊塔生物科技有限公司，批號(hào)：SY6488、SY6454、SY3017、SY0209、SY7003)；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、Hoechst33258染色液(上海愛必信生物科技有限公司，批號(hào)：abs9217、abs5002、abs7114、abs4018)；堿性磷酸酶(ALP)、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣蛋白(OCN)、SIRT1、β-actin單克隆抗體、羊抗鼠二抗(美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab186421、ab63856、ab92876、ab189494、ab109937、ab110035)；小動(dòng)物顯微CT(Micro-CT)系統(tǒng)(廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司，型號(hào)：ZKKS-MCT-SHARP)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：MA-6000)；凝膠成像儀(美國(guó)伯樂公司，型號(hào)：SYSTEM GelDoc XR+)；光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DMM-300 D、XSP-13CC)等。

1.2 方法

1.2.1大鼠OP模型建立及分組給藥：大鼠參照文獻(xiàn)[7]摘除雙側(cè)卵巢建立OP模型，并于手術(shù)后一周，隨機(jī)取兩只大鼠股骨遠(yuǎn)端標(biāo)本，參照文獻(xiàn)[8]方法對(duì)大鼠股骨進(jìn)行Micro-CT掃描，若大鼠出現(xiàn)骨結(jié)構(gòu)斷裂，骨量減少現(xiàn)象視為造模成功。共造模成功50只大鼠，隨機(jī)分為模型組、TSG組(80 mg/kg)、miR-34a過表達(dá)(miR-34a-agomir)組(4 nmol/kg)、TSG+miR-34a-agomir組(80 mg/kg+4 nmol/kg)、miR-34a過表達(dá)陰性對(duì)照(antagomir-NC)組，每組10只。另取10只大鼠只暴露卵巢，不摘除，其余同模型組，視為假手術(shù)組。TSG參照文獻(xiàn)[9]設(shè)置劑量，并用生理鹽水溶解成濃度為8 mg/mL的溶液，按10 mL/kg的劑量灌胃給藥，1次/d，miR-34a-agomir及antagomir-NC組參照文獻(xiàn)[5]設(shè)置劑量，經(jīng)尾靜脈注射給藥，1次/周；TSG+miR-34a-agomir組灌胃給予TSG同時(shí)，經(jīng)尾靜脈注射給予相應(yīng)劑量miR-34a-agomir；模型組及假手術(shù)組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。各組連續(xù)給藥3個(gè)月。

1.2.2大鼠血液標(biāo)本及股骨遠(yuǎn)端標(biāo)本采集：各組大鼠末次給藥，禁食禁水12 h后，麻醉取腹主動(dòng)脈血6 mL，于3 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液置于無酶EP管中- 80 ℃保存?zhèn)溆?。斷頭處死大鼠，取大鼠左右兩后肢股骨，仔細(xì)分離并剔除骨組織周圍的肌肉和軟組織，左側(cè)股骨用生理鹽水紗布包裹后，于- 80 ℃保存?zhèn)溆?，右?cè)股骨標(biāo)本用醫(yī)用紗布包裹后，置入10倍體積的4 %多聚甲醛中固定備用。

1.2.3大鼠血清MDA、GSH-Px水平檢測(cè)：取大鼠血清標(biāo)本，于4 ℃條件下解凍后，按MDA、GSH-Px試劑盒說明書方法檢測(cè)血清中MDA、GSH-Px水平。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)大鼠血清miR-34a相對(duì)表達(dá)水平：取先前在- 80 ℃冰箱中保存的血清標(biāo)本，在4 ℃冰箱中解凍后，于3 000 r/min、4 ℃條件下再次離心20 min后，用Trizol試劑提取總RNA并以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄cDNA。取cDNA，按熒光定量PCR試劑盒說明書和PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，共進(jìn)行50個(gè)循環(huán)：90 ℃ 100 s(1個(gè)循環(huán))，95 ℃ 20 s、50 ℃～55 ℃ 50 s、72 ℃ 50 s(40個(gè)循環(huán))，72 ℃ 100 s(1個(gè)循環(huán))后終止反應(yīng)。miR-34a以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-34a相對(duì)表達(dá)水平。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequence of qRT-PCR

1.2.5蛋白免疫印跡(WB)法檢測(cè)血清SIRT1蛋白相對(duì)表達(dá)水平：取先前在- 80 ℃冰箱保存的血清標(biāo)本，在4 ℃冰箱中解凍后，用蛋白提取試劑盒提取蛋白，并用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取25 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)及封閉液封閉后，加入一抗[SIRT1(稀釋倍數(shù)1∶500)、β-actin內(nèi)參(稀釋倍數(shù)1∶1 000)]孵育過夜后，加入羊抗鼠二抗(1∶2 000)在37 ℃條件下孵育3 h后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image-J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6HE染色及Micro-CT法檢測(cè)股骨組織結(jié)構(gòu)變化：取右側(cè)后肢股骨遠(yuǎn)端標(biāo)本，進(jìn)行螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋后，切成厚度為5 μm切片，按HE試劑盒說明書進(jìn)行染色、封片后置于顯微鏡下觀察病理變化。取左側(cè)股骨遠(yuǎn)端標(biāo)本，按照文獻(xiàn)[8]方法對(duì)大鼠股骨進(jìn)行Micro-CT 掃描，并計(jì)算骨連接密度(Conn.D)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、BMD等指標(biāo)。

1.2.7成骨細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：參照文獻(xiàn)[4]取成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1用α-MEM培養(yǎng)基于孵箱里培養(yǎng)、胰蛋白酶消化處理后，接種到6孔板中，并分為對(duì)照組、過氧化氫(H2O2)處理組、TSG組、miR-34a-mimic組、miR-34a-NC組、TSG+miR-34a-mimic組，對(duì)照組不做任何處理正常培養(yǎng)外，其余各組均加入300 μmol/L H2O2處理24 h，TSG組在H2O2處理組基礎(chǔ)上加入終濃度為10 μmol/L的TSG進(jìn)行培養(yǎng)，miR-34a-mimic組及miR-34a-NC組分別轉(zhuǎn)染miR-34a激動(dòng)劑及其陰性對(duì)照試劑，TSG+miR-34a-mimic組在TSG組基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染miR-34a-mimic試劑，各組均轉(zhuǎn)染培養(yǎng)24 h。

1.2.8Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡情況：取1.2.7項(xiàng)下的各組細(xì)胞，參照文獻(xiàn)[4]方法，取細(xì)胞用4 %多聚甲醛固定后加5 mg/L Hoechst33258染液染色、甘油封片后，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

1.2.9qRT-PCR及WB法檢測(cè)各組細(xì)胞miR-34a及SIRT1、ALP、OPN、OCN蛋白表達(dá)：取1.2.7項(xiàng)下的各組細(xì)胞，用Trizol抽提法提取細(xì)胞中總RNA后，按1.2.4項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞中miR-34a表達(dá)。取1.2.7項(xiàng)下的各組細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解、蛋白提取試劑盒提取蛋白、BCA法檢測(cè)蛋白濃度后取20 μg進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)后，加入一抗[SIRT1、ALP、OPN、OCN(稀釋倍數(shù)均為1∶1 000)，β-actin內(nèi)參(稀釋倍數(shù)1∶2 000)]孵育過夜后，按1.2.5方法檢測(cè)細(xì)胞中SIRT1、ALP、OPN、OCN蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TSG對(duì)OP大鼠血清miR-34a及SIRT1蛋白表達(dá)變化的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清miR-34a表達(dá)升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與模型組相比，TSG組大鼠血清miR-34a表達(dá)降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；miR-34a-agomir組大鼠血清miR-34a表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，SIRT1蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。TSG+miR-34a-agomir組大鼠上述指標(biāo)變化與TSG組相反且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠血清SIRT1蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.1 Western blot of SIRT1 protein expression in serum of rats in each group 注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：TSG組；D：miR-34a-agomir組；E：TSG+miR-34a-agomir組；F：agomir-NC組。

2.2 TSG對(duì)OP大鼠股骨遠(yuǎn)端組織病理變化的影響

表2 各組大鼠血清miR-34a及SIRT1蛋白表達(dá)比較

假手術(shù)組骨組織結(jié)構(gòu)完整，骨小梁排列有序、粗細(xì)均勻且結(jié)構(gòu)致密，成骨細(xì)胞形態(tài)清晰。模型組大鼠可見股骨遠(yuǎn)端松質(zhì)骨小梁斷裂、減少且排列稀疏，骨細(xì)胞減少且結(jié)構(gòu)模糊。TSG組大鼠可見松質(zhì)骨骨小梁排列較致密且斷裂較少，成骨細(xì)胞相對(duì)模型組較多。miR-34a-agomir組大鼠骨小梁斷裂、減少、排列疏松現(xiàn)象較模型組嚴(yán)重。TSG+miR-34a-agomir組及agomir-NC組骨組織上述病理?yè)p傷程度與模型組相近。見圖2。

圖2 大鼠股骨遠(yuǎn)端組織HE染色圖(40×)Fig.2 HE staining of distal femur of rats in each group (×40)

2.3 TSG對(duì)大鼠骨組織超微結(jié)改變的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠Conn.D、Tb.N、BMD降低(P<0.05)，Tb.Sp升高(P<0.05)。與模型組相比，TSG組大鼠Conn.D、Tb.N、BMD升高(P<0.05)，Tb.Sp降低(P<0.05)；miR-34a-agomir組大鼠Conn.D、Tb.N、BMD進(jìn)一步降低(P<0.05)，Tb.Sp進(jìn)一步升高(P<0.05)。TSG+miR-34a-agomir組大鼠上述指標(biāo)變化與TSG組相反且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 股骨遠(yuǎn)端的顯微CT成像Fig.3 Micro CT imaging of distal femur of rats in each group

2.4 TSG對(duì)大鼠血清MDA、GSH-Px變化的影響

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清GSH-Px水平降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)。與模型組相比，TSG組大鼠血清GSH-Px水平升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)；miR-34a-agomir組大鼠血清GSH-Px水平進(jìn)一步降低(P<0.05)，MDA水平進(jìn)一步升高(P<0.05)。TSG+miR-34a-agomir組大鼠上述指標(biāo)變化與TSG組相反且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.5 TSG對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響

熒光顯微鏡下顯示，對(duì)照組成骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。H2O2處理組可見成骨細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象嚴(yán)重。TSG組成骨細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象相對(duì)較輕。miR-34a-mimic組成骨細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡現(xiàn)象進(jìn)一步加重。TSG+miR-34a-mimic組及miR-34a-NC組成骨細(xì)胞核固縮、碎裂等凋亡情況與模型組相近。見圖4。

表3 各組大鼠骨組織結(jié)構(gòu)參數(shù)比較Table 3 Comparison of bone tissue structure parameters of rats in each group

表4 各組大鼠血清MDA、GSH-Px水平比較

圖4 各組細(xì)胞Hoechst33258染色圖(×400)Fig.4 Hoechst 33258 staining of cells in each group (×400)

2.6 TSG對(duì)成骨細(xì)胞miR-34a、SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，H2O2處理組成骨細(xì)胞miR-34a表達(dá)升高(P<0.05)，SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。與H2O2處理組相比，TSG組成骨細(xì)胞miR-34a表達(dá)降低(P<0.05)，SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；miR-34a-mimic組成骨細(xì)胞miR-34a表達(dá)進(jìn)一步升高(P<0.05)，SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低(P<0.05)。TSG+miR-34a-mimic上述指標(biāo)與TSG組相反且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖5、表5。

圖5 各組細(xì)胞SIRT1、ALP、OPN和OCN蛋白表達(dá)免疫印跡圖Fig.5 Western blot of SIRT1, ALP, OPN and OCN protein expression in each group注：A：對(duì)照組；B：H2O2處理組；C：TSG組；D：miR-34a-mimic組；E：TSG+miR-34a-mimic組；F：miR-34a-NC組。

3 討論

隨著我國(guó)老齡化人口的增多，OP發(fā)病率及致殘率逐年升高，大鼠切除卵巢是模擬人類絕經(jīng)后OP的常見動(dòng)物模型[10]，本研究以此建立OP大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大鼠股骨遠(yuǎn)端骨松質(zhì)出現(xiàn)結(jié)構(gòu)斷裂、骨量、骨小梁數(shù)量減少現(xiàn)象，且CT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)骨組織超微結(jié)構(gòu)Conn.D、Tb.N、BMD等參數(shù)降低，Tb.Sp等參數(shù)升高，提示造模成功。研究[3]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)在OP過程中扮演重要角色，高水平的氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起成骨細(xì)胞凋亡，減弱其分化，可能是導(dǎo)致OP患者骨組織及骨量丟失的原因之一。本研究在OP模型大鼠血清中檢測(cè)到氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA升高、GSH-Px降低，證實(shí)氧化應(yīng)激在OP過程中發(fā)揮重要作用。

表5 各組細(xì)胞miR-34a及SIRT1、ALP、OPN和OCN表達(dá)比較Table 5 Comparison of the expression of miR-34a, SIRT1, ALP, OPN and OCN in each group

中醫(yī)將OP歸屬為“骨萎”“骨枯”范疇，“腎精不足，骨髓化生及骨骼充養(yǎng)減弱”是其主要病機(jī)，補(bǔ)腎益精、填髓之物可促進(jìn)骨髓化生及濡養(yǎng)，緩解OP骨死亡及枯竭[11]。中藥何首烏有補(bǔ)腎益精、填髓、強(qiáng)筋骨之功，是治療OP的常用藥物，其活性成份TSG具有較好的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等多種藥理作用[12]。本研究以TSG處理OP大鼠，發(fā)現(xiàn)大鼠股骨遠(yuǎn)端骨松質(zhì)結(jié)構(gòu)斷裂緩解，骨量、骨組織體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量及骨密度減少等均明顯得到改善，并伴隨著血清MDA降低、GSH-Px升高等氧化應(yīng)激反應(yīng)水平的降低，提示TSG可降低OP大鼠氧化應(yīng)激水平，對(duì)其骨松質(zhì)骨量減少、骨密度降低、骨結(jié)構(gòu)異常有治療作用，但其分子機(jī)制還需繼續(xù)研究。

研究[13]發(fā)現(xiàn)，miRNA在OP患者血清及骨組織中表達(dá)異常，可作為OP篩查、診治的指標(biāo)，其中miR-34a參與介導(dǎo)OP骨穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程，上調(diào)miR-34a水平，可導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衰老凋亡，還能下調(diào)SIRT1表達(dá)，降低骨密度[14]；氧化應(yīng)激反應(yīng)是引發(fā)OP的重要機(jī)制之一[15]，而SIRT1能介導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥、自噬等多種生理過程，并可調(diào)控成骨細(xì)胞凋亡及分化，由此預(yù)測(cè)miR-34a/SIRT1可作為預(yù)治OP的潛在靶標(biāo)。本研究檢測(cè)到OP大鼠血清中miR-34a表達(dá)升高，SIRT1表達(dá)降低，miR-34a-agomir組大鼠隨著miR-34a表達(dá)進(jìn)一步升高及SIRT1蛋白表達(dá)的進(jìn)一步降低，其骨量及骨密度減少也進(jìn)一步加重，提示miR-34a上調(diào)，SIRT1下調(diào)可能是導(dǎo)致OP骨減少及骨密度下降的危險(xiǎn)因子。TSG治療組血清中miR-34a下調(diào)，SIRT1上調(diào)，而TSG與miR-34a-agomir聯(lián)合應(yīng)用后，大鼠miR-34a/SIRT1軸表達(dá)與TSG治療組相反，OP骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)改變癥狀也進(jìn)一步加重，推測(cè)miR-34a-agomir可逆轉(zhuǎn)TSG抑制OP骨量減少及組織結(jié)構(gòu)改變的作用。另外本次體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TSG干預(yù)可明顯降低H2O2誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，并抑制其凋亡，降低miR-34a表達(dá)，上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)及成骨分化相關(guān)蛋白ALP、OPN和OCN的表達(dá)，促進(jìn)成骨鈣化過程。而TSG與miR-34a-mimic聯(lián)合應(yīng)用，其miR-34a及SIRT1蛋白表達(dá)與TSG單獨(dú)干預(yù)相反，且成骨細(xì)胞凋亡增加，成骨分化減弱，提示TSG可上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)，抑制氧化應(yīng)激條件下成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)成骨分化，且上述作用可被miR-34a-mimic逆轉(zhuǎn)。本研究體內(nèi)外試驗(yàn)均證實(shí)TSG可下調(diào)miR-34a，上調(diào)SIRT1，抑制成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)其分化，改善OP骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)異常改變的癥狀。

綜上所述，TSG可能通過抑制miR-34a表達(dá)、上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)來抑制氧化應(yīng)激條件下成骨細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其分化，改善OP大鼠骨量減少及骨組織結(jié)構(gòu)異常的癥狀。但miR-34a/SIRT1信號(hào)軸調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，TSG也可能通過miR-34a/SIRT1信號(hào)軸調(diào)控自噬、炎癥及破骨細(xì)胞凋亡等途徑來改善OP癥狀，這有待后續(xù)繼續(xù)研究。