蘇敬陽，曹 斌，張耀杰，郝學(xué)偉，王 寅，于海泉（石家莊市人民醫(yī)院骨科三病區(qū),石家莊050000）

股骨頭壞死是指由多種原因?qū)е碌墓晒穷^血供中斷或受損，進(jìn)而引起骨髓成分和骨細(xì)胞因缺血缺氧而凋亡或壞死，誘發(fā)股骨頭結(jié)構(gòu)發(fā)生變化甚至塌陷的一系列病理改變和臨床表現(xiàn)[1-2]。目前認(rèn)為股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制主要包括脂質(zhì)代謝紊亂學(xué)說、骨細(xì)胞凋亡學(xué)說、骨內(nèi)壓增高學(xué)說、血管內(nèi)凝血與血管損傷學(xué)說、基因控制學(xué)說等[3-4]。Periostin 最早是從小鼠成骨細(xì)胞系中克隆出來的一種黏附分子，對(duì)骨細(xì)胞的分化具有調(diào)節(jié)作用，在骨骼生長的不同階段會(huì)有不同程度的表達(dá)[5]，但是其與股骨頭壞死塌陷進(jìn)程的關(guān)系尚未有報(bào)道，因此本研究主要考察外周血Periostin表達(dá)與股骨頭壞死塌陷進(jìn)程的關(guān)系，以期為股骨頭壞死塌陷進(jìn)程的臨床診斷提供參考指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2016年8月～2019年5月石家莊市人民醫(yī)院收治的110 例股骨頭壞死患者作為研究組。男性73 例，女性37 例；平均年齡42.30±8.47 歲，國際骨循環(huán)研究會(huì)（Association Research Circulation osseous,ARCO）分期為Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期的分別有33 例，41 例和36 例；病因?yàn)榫凭⒓に?、特發(fā)、創(chuàng)傷的分別有37 例，41 例，16 例和16 例；塌陷前70 例，塌陷后40 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者年齡均在18～65 歲范圍內(nèi)；所有患者均符合股骨頭壞死臨床診療規(guī)范的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]（2012年，中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)關(guān)節(jié)外科組）；所有患者均符合ARCO 分期Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ期。另納入我院同期進(jìn)行體檢的110 例非股骨頭壞死受試者作為對(duì)照組，男性70 例，女性40 例；平均年齡42.14±9.20 歲。研究組和對(duì)照組研究對(duì)象均無糖尿病、高血壓、冠心病及HIV 等疾病史；近半年內(nèi)均未服用過降脂類藥物、激素或?qū)谴x有影響的藥物。兩組研究對(duì)象的性別及年齡等基本資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，研究嚴(yán)格遵照赫爾辛基宣言，所有患者均知情且已自愿簽訂知情同意書。

1.2 儀器與試劑 儀器：離心機(jī)、高精度加樣器及槍頭（5～1 000 μl）（Eppendorf 公司），多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices 公司），恒溫箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），冰箱（海爾公司）。試劑：Periostin標(biāo)準(zhǔn)品（南京賽泓瑞），緩沖液、親和素-HRP試劑（北京百奧萊博科技有限公司），TMB 底物（基因有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集：所有受試者均禁食8 h 以上，于清晨抽取受試者肘靜脈血，放入到加有檸檬酸鈉抗凝的試劑管中，1 000 g 離心15 min，用移液器將上層血漿移至另一干凈的試劑管中，編號(hào)，放置于-20℃冰箱中備用。對(duì)患者定期進(jìn)行隨訪，并在隨訪中確診為塌陷后的第二日按上述方法采集血漿樣本。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：使用樣本稀釋液將樣本（血漿）稀釋至所需濃度。使用樣本稀釋液配制梯度濃度的Periostin 標(biāo)準(zhǔn)品。取100 μl 1×緩沖液加入生物素化的抗體試劑瓶中配制生物素化抗體濃縮液，混勻后，用1×緩沖液將其稀釋80 倍備用。搖晃裝有親和素-過氧化物酶試劑的試劑瓶使其混合均勻，用1×緩沖液稀釋100 倍備用。

取100 μl 梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)驗(yàn)樣本分別放入微孔酶標(biāo)板標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣板孔內(nèi)，用封板膜封住板孔，并在室溫培育2.5 h。倒掉微孔酶標(biāo)板內(nèi)的液體并沖洗，然后將微孔酶標(biāo)板倒置放于干凈的紙巾上。于每一個(gè)板孔中加入100 μl 的生物素化抗體試劑，室溫培育1 h，然后倒掉液體，沖洗，然后加入100 μl 親和素-過氧化物酶試劑，室溫培育45 min，倒掉液體，沖洗，加入100 μl TMB 底物，避光室溫培育30 min，然后加入50 μl 終止液，停止反應(yīng)30 min 內(nèi)使用多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices 公司）進(jìn)行微孔酶標(biāo)板的測(cè)量讀數(shù)，并計(jì)算各樣品的Periostin 蛋白濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS22.0 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間兩樣本比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料用百分?jǐn)?shù)形式表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson 分析；建立受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)診斷效能。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對(duì)照組受試者Periostin水平比較受試者外周血中Periostin水平（0.86±0.17）顯著高于對(duì)照組（0.65±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.167，P＜0.05）。

2.2 研究組不同病因及分期受試者Periostin水平比較 見表1。研究組患者中ARCO 不同分期組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血中Periostin水平顯著高于Ⅱ期患者，組間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。病因?yàn)榫凭?、激素性、特發(fā)性及創(chuàng)傷性患者外周血中Periostin水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 研究組不同病因及分期受試者Periostin水平比較

2.3 研究組塌陷前后Periostin水平比較 隨訪期間，共有40 例患者發(fā)生塌陷。發(fā)生塌陷患者股骨頭壞死塌陷后外周血中Periostin 濃度（0.92±0.23）比塌陷前（0.67±0.11）顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.465，P＜0.05）。

2.4 研究組Periostin水平與ARCO 分期的相關(guān)性分析 研究組Periostin水平與ARCO 分期呈正相關(guān)（r=0.563，P＜0.05）。

2.5 Periostin 在股骨頭壞死塌陷的診斷效能分析 見圖1。采用ROC 曲線評(píng)估外周血中Periostin水平對(duì)股骨頭壞死塌陷的診斷效能，結(jié)果顯示，股骨頭壞死塌陷患者外周血中Periostin 的AUC 及95%CI 為0.841（95%CI，0.786～0.895，P＜0.001），提示外周血中Periostin 對(duì)股骨頭壞死塌陷診斷效能較高。

圖1 外周血中Periostin 在股骨頭壞死塌陷的診斷效能

3 討論

股骨頭壞死是臨床上骨科常見的一種難治性的骨關(guān)節(jié)病，股骨頭血供受損是目前公認(rèn)的股骨頭壞死的始動(dòng)因素，股骨頭壞死后自身修復(fù)不充分會(huì)致使股骨頭的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使軟骨被破壞或股骨頭局部塌陷等，最終引起嚴(yán)重的功能障礙疾病[7-9]。目前國內(nèi)外專家公認(rèn)的股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制的學(xué)說主要包括：脂質(zhì)代謝紊亂及骨內(nèi)壓增高學(xué)說、血管內(nèi)凝血與血管損傷學(xué)說、骨細(xì)胞凋亡學(xué)說、基因控制學(xué)說等[10-11]。

Periostin 最初被稱為骨細(xì)胞特異性因子-2，后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于牙周韌帶及骨膜，改名為Periostin。Periostin 蛋白含有835 個(gè)編碼氨基酸，擁有自己的信號(hào)結(jié)構(gòu)，主要表達(dá)并分泌在心肌成纖維細(xì)胞[12]。有專家發(fā)現(xiàn)Periostin 蛋白對(duì)機(jī)體成骨細(xì)胞的分化具有一定的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而在機(jī)體的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮作用[13]。Periostin 蛋白主要通過兩種方式進(jìn)行信號(hào)的傳導(dǎo)：①非整合素受體介導(dǎo)的Periostin 蛋白信號(hào)的傳導(dǎo)：Periostin 可以通過與Notch 1 結(jié)合使Bcl-cl基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化作用，抑制機(jī)體細(xì)胞死亡，促進(jìn)骨骼的改建和塑性[14]。②整合素受體介導(dǎo)的Periostin 蛋白信號(hào)的傳導(dǎo)：Periostin 蛋白可與整合素受體ανβ3 結(jié)合，進(jìn)而對(duì)機(jī)體中硬骨素的表達(dá)起到抑制作用，而硬骨素主要通過調(diào)節(jié)BMP 和wnT信號(hào)傳導(dǎo)抑制骨細(xì)胞的形成，因此Periostin 蛋白可以促進(jìn)骨細(xì)胞的形成[15-16]。研究證實(shí)Periostin 蛋白與牙、骨等礦化組織的形成和再生有密切關(guān)系，其在骨骼生長的不同階段會(huì)有不同程度的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的增殖和分化影響骨骼的形成[17-18]。研究顯示骨骼生長過程中Periostin 蛋白的表達(dá)水平顯著高于成年后骨骼中的表達(dá)水平，且破壞骨骼的纖維結(jié)構(gòu)后，Periostin 蛋白的表達(dá)水平會(huì)增加[19-20]。通過對(duì)大鼠的研究顯示成年大鼠肌肉或骨骼受損后，Periostin蛋白的表達(dá)水平會(huì)顯著增加；體外培養(yǎng)小鼠中已經(jīng)敲除Periostin 蛋白表達(dá)的調(diào)控基因后的成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示這些細(xì)胞的增殖和分化能力顯著降低[18-20]。表明Periostin 蛋白是骨代謝中重要的蛋白，在骨骼的生長發(fā)育過程中具有重要作用[21]。

本研究結(jié)果顯示，研究組受試者外周血中Periostin水平顯著高于對(duì)照組。研究組患者中ARCO Ⅲ期和Ⅳ期患者外周血中Periostin水平顯著高于Ⅱ期患者，且Periostin水平與ARCO 分期呈正相關(guān)。研究組患者股骨頭壞死塌陷后與塌陷前相比外周血中Periostin水平顯著升高。且外周血中Periostin 對(duì)股骨頭壞死塌陷診斷效能較高。提示外周血中Periostin對(duì)股骨頭壞死患者的股骨頭塌陷進(jìn)程的判斷具有一定的指導(dǎo)意義，可為股骨頭壞死塌陷的臨床診斷提供一定的參考價(jià)值。

綜上，外周血中Periostin表達(dá)與股骨頭壞死塌陷有密切關(guān)系，股骨頭壞死塌陷后外周血中Periostin水平顯著升高，對(duì)股骨頭壞死患者的股骨頭塌陷程度的判斷具有一定的指導(dǎo)意義，可為股骨頭壞死后塌陷的臨床診斷提供一定的參考價(jià)值。