蘇通 代培 丁雷 劉銅華 胡浩 胡燕 秦靈靈 周靜鑫 王志程 郭翔宇

糖尿病現(xiàn)已成為繼腫瘤、心腦血管病之后第三大嚴(yán)重威脅人類健康的慢性非傳染性疾病[1]，國際糖尿病聯(lián)盟(International Diabetes Federation, IDF)2019年發(fā)布的第九版糖尿病地圖統(tǒng)計(jì)顯示，目前全球約有4.63億糖尿病患者，其中中國的成人糖尿病患者達(dá)到了1.164億[2]。已有研究證實(shí)，microRNA與2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus, T2DM)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。microRNA是一類長約20～24 nt的非編碼RNA，雖然不能直接編碼蛋白，但可部分結(jié)合于靶基因mRNA的3’非翻譯區(qū)從而抑制基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)[3]，因此，研究中藥對microRNA的調(diào)控機(jī)制是中藥現(xiàn)代化研究的重點(diǎn)方向。中國民間常用的降糖中藥番石榴葉(Folium Psidii Guajavae Psidium guajava L.)是桃金娘科植物番石榴的干燥枝葉，其單味藥制劑“消渴降糖膠囊”被收錄于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第十五冊，可治療輕、中度糖尿病[4]。本實(shí)驗(yàn)通過基因芯片技術(shù)對番石榴葉提取物干預(yù)后的Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty,ZDF)大鼠胰腺組織進(jìn)行檢測分析，從分子水平上揭示番石榴葉對T2DM大鼠胰腺microRNA表達(dá)調(diào)控的影響，為發(fā)掘番石榴葉治療T2DM的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性自發(fā)T2DM模型ZDF大鼠12只、同周齡正常雄性Zucker瘦型(Zucker lean, ZL)大鼠6只，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，6周齡，體質(zhì)量180～200 g，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實(shí)驗(yàn)室[動物許可證號：SYXK(京)2016-0038]。除每周檢測空腹血糖前禁食12小時外，大鼠均自由進(jìn)食、飲水及活動，12小時/12小時自然晝夜光線交替照射。

1.2 藥物與試劑

番石榴葉藥材原料購自四川醫(yī)藥集團(tuán)(中國成都)，其乙醇提取物由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院制備，提取過程如下：干藥材分別加入12 BV和10 BV水提取兩次，第一次提取1小時，第二次提取45分鐘，合并濾液，減壓濃縮至約1 g/mL的濃度，過濾，取上清液，直接過D101大孔樹脂柱，用60%乙醇洗脫，減壓濃縮，干燥，得到干燥粉末。血糖試紙及血糖儀均購自Bayer公司，血清胰島素Elisa試劑盒購自Sigma公司，基因芯片檢測由上海伯豪生物技術(shù)有限公司完成。

1.3 造模方法

所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，ZDF大鼠使用高脂飼料誘導(dǎo)喂養(yǎng)，ZL大鼠使用普通飼料喂養(yǎng)。2周后以尾靜脈采血法檢測ZDF大鼠血糖兩次，不同日隨機(jī)血糖均≥11.1 mmol/L視為糖尿病模型造模成功。

1.4 分組與給藥

將成模的ZDF大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組和治療組，ZL大鼠作為正常組，每組各6只大鼠。根據(jù)人體給藥劑量按照體表面積法折算為治療組大鼠給藥劑量，將番石榴葉提取物干燥粉末溶于蒸餾水中制成溶液，按0.01 mL/g體重每日灌胃給藥(折合生藥材8 g/kg)，模型組及正常組大鼠每日灌胃同體積蒸餾水，連續(xù)干預(yù)4周。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 一般情況 實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠體型、毛色、活動量、精神狀態(tài)等一般情況，每周檢測并記錄一次進(jìn)食量及體重。

1.5.2 空腹血糖 每周檢測并記錄一次大鼠空腹血糖，采用快速血糖儀取大鼠尾靜脈全血檢測，檢測前禁食不禁水12小時。

1.5.3 標(biāo)本采集與檢測 番石榴葉提取物給藥干預(yù)4周后，將所有大鼠禁食不禁水12小時，稱重，按40 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液麻醉，剖開腹腔，剝離腹主動脈，負(fù)壓真空采血管進(jìn)行取血，室溫靜置30分鐘，4℃，3 500 r/min離心15分鐘，抽取上清，用血清胰島素Elisa試劑盒按制造商使用說明檢測大鼠血清胰島素水平。迅速剖取胰腺，置于凍存管中，保存在-80℃冰箱備用。

1.6 基因芯片檢測

1.6.1 提取總RNA 采用miRNeasy Mini Kit(Qiagen公司)分別提取ZDF大鼠和ZL大鼠胰腺中的總RNA用于比對，并用RNase-free水將得到的RNA樣品稀釋至50 ng/μL。

1.6.2 樣品去磷酸化 總RNA樣品100 ng，10×CIP堿性磷酸酶緩沖液0.4 μL，標(biāo)記外標(biāo)RNA 1.1 μL，CIP堿性磷酸酶0.5 μL，共計(jì)4 μL，置于PCR儀中37℃恒溫孵育30分鐘以去除RNA5’端磷酸基團(tuán)。

1.6.3 樣品變性和標(biāo)記反應(yīng) 在得到的混合液中加入2.8 μL DMSO，并置于100℃金屬浴中加熱5分鐘，然后迅速轉(zhuǎn)入冰水浴中冷卻，然后加入10×T4 RNA連接酶緩沖液1 μL、T4 RNA連接酶0.5 μL、Cyanine3-pCp熒光染料3 μL低速離心混勻，共11.3 μL，于PCR儀中16℃孵育2小時，熒光染料在T4 RNA連接酶作用下連接至RNA3’端，然后將樣品置于50℃真空濃縮儀中完全抽干。

1.6.4 樣品雜交 將抽干的樣品重新溶解于17 μL nuclease-free水中，加入1 μL雜交外標(biāo)RNA、4.5 μL 10×基因表達(dá)封閉劑、22.5 μL 2×Hi-RPM雜交緩沖液，置于100℃金屬浴中加熱5分鐘，然后迅速轉(zhuǎn)入冰水浴中冷卻5分鐘，反應(yīng)液共計(jì)45 μL，用移液器將反應(yīng)液緩慢吸至蓋片上，按照說明安裝芯片，置于雜交爐中，溫度55℃、轉(zhuǎn)速20 r/min雜交20小時。

1.6.5 芯片洗滌和掃描 雜交結(jié)束后，小心地將芯片分別放入含有Triton X-102的基因表達(dá)洗滌緩沖液的玻璃染色缸中，置于磁力攪拌器上，于室溫下洗滌兩次、37℃洗滌一次，每次5分鐘，然后用吸水紙拭去芯片上的液體，放入掃描儀中進(jìn)行掃描，提取雜交數(shù)據(jù)。

1.7 GO及KEGG富集分析

對治療組大鼠胰腺中表達(dá)差異最顯著的microRNA進(jìn)行GO和KEGG富集分析，方法如下：采取 fisher 精確檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)包為clusterProfiler，來自R/bioconductor；挑選標(biāo)準(zhǔn)如下：落在某個term/GO上差異的基因數(shù)目≥2且p_value <0.05，畫圖中取得term/GO按照enrich factor的值從大小降序排列，取前 30 個結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 番石榴葉提取物對ZDF大鼠體質(zhì)量的影響

與正常組相比，模型組ZDF大鼠體質(zhì)量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比，治療組ZDF大鼠體質(zhì)量有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 番石榴葉提取物對ZDF大鼠空腹血糖的影響

與正常組相比，模型組及治療組大鼠空腹血糖顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療組在給藥第1周、第2周時空腹血糖無差異，第3周和第4周空腹血糖均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3 番石榴葉提取物對ZDF大鼠胰島素的影響

與正常組相比，模型組ZDF大鼠血漿胰島素水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療組大鼠胰島素水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表1 番石榴葉提取物對ZDF大鼠體質(zhì)量的影響

表2 番石榴葉提取物對ZDF大鼠空腹血糖的影響

注：紅點(diǎn)代表上調(diào)表達(dá)的差異 microRNA，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)表達(dá)的差異 microRNA。

表3 番石榴葉提取物對ZDF大鼠血漿胰島素的影響

2.4 番石榴葉提取物對ZDF大鼠胰腺組織microRNA表達(dá)水平的影響

2.4.1 治療組與模型組胰腺中存在差異表達(dá)的microRNA。見圖1。

2.4.2 模型組與治療組胰腺中差異microRNA表達(dá)水平 與模型組相比，治療組胰腺組織中共檢測到9種差異表達(dá)的microRNA，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，包括 7種表達(dá)上調(diào)和2種表達(dá)下調(diào)，其中以miR-361-5p的表達(dá)上調(diào)最為顯著(P<0.05且倍數(shù)變化≥1.40)。見表4。

2.4.3 GO富集分析 miR-361-5p的靶基因功能集中在結(jié)合磷蛋白和單羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方面，參與的生物學(xué)過程主要包括微管細(xì)胞骨架組織的構(gòu)建過程、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)過程和間腦發(fā)育過程。見圖2。

表4 模型組與治療組胰腺中差異microRNA表達(dá)水平

注：圓形代表生物學(xué)過程，三角形代表細(xì)胞組分，正方形代表分子功能，面積越大代表富集程度越高，顏色越深代表差異性越顯著。

2.4.4 KEGG富集分析 miR-361-5p的靶基因涉及的生物學(xué)代謝信號通路除了與腫瘤發(fā)生通路相關(guān)外，也與青年人中的成年發(fā)病型糖尿病和果糖、甘露糖代謝通路有密切關(guān)聯(lián)。見圖3。

3 討論

超重和肥胖是影響中國T2DM患者發(fā)病的重要因素[1]，早在《素問·奇病論篇》中就有指出：“此五氣之溢也，名曰脾癉……此肥美之所發(fā)也，此人必?cái)?shù)食甘美而多肥也，肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴?！爆F(xiàn)代T2DM的治療，應(yīng)該“治之以蘭，除陳氣也”?！疤m”可引申為具有芳香醒脾、化濁降脂功效的草藥[5]，張錫純曾言：“脾虛致渴，治渴當(dāng)先實(shí)脾”。過食肥甘厚味易傷脾胃，致運(yùn)化失司、痰濕內(nèi)生，濕性重濁粘滯，若不加以利濕化濁，只是盲目滋陰，則病情反復(fù)，難以好轉(zhuǎn)[6]。

注：圓形代表生物學(xué)代謝途徑，面積越大代表富集程度越高，顏色越深代表差異性越顯著。

番石榴葉有祛濕健脾、清熱解毒的功效，最早記載于《南寧市藥物志》：“收斂止瀉。治泄瀉，久痢，濕疹，創(chuàng)傷出血”，《臺灣藥用植物志》指出：“主治糖尿病”。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，番石榴葉降糖有效成分為三萜、黃酮類等化合物[7-8]，本課題組前期研究也證實(shí)，番石榴葉提取物分別通過多種胰島素敏感的信號通路調(diào)控肝臟[9]、骨骼肌[10]、脂肪組織[11]中代謝通路的相關(guān)蛋白，進(jìn)而促進(jìn)體重和血糖的下降。然而作為一類調(diào)控機(jī)制更為復(fù)雜的非編碼RNA，microRNA與番石榴葉提取物的關(guān)聯(lián)性及其在胰腺中發(fā)揮的作用仍然有待研究。

microRNA是糖尿病研究最直觀、準(zhǔn)確的研究切入點(diǎn)之一，2004年Mattew等人[12]率先報道了在胰島中發(fā)現(xiàn)的miR-375，并證明其影響了胰島素的分泌，揭開了T2DM胰島β細(xì)胞與microRNA相關(guān)性研究的序幕。目前，檢測藥物干預(yù)后microRNA的表達(dá)變化已成為發(fā)掘新型藥物靶點(diǎn)的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片技術(shù)篩查ZDF大鼠在番石榴葉提取物干預(yù)前后胰腺中microRNA的差異性表達(dá)，并成功檢測出了9種差異性表達(dá)microRNA，其中miR-361-5p的表達(dá)上調(diào)最為顯著。在Wang等人的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-361-5p可競爭性結(jié)合特定的編碼RNA，并作為一種拮抗劑抑制下游叉頭框(forkhead box,Fox)轉(zhuǎn)錄因子O亞族1(FoxO1)的表達(dá)，從而抑制軟骨細(xì)胞的凋亡[13]，提示miR-361-5p對FoxO1的調(diào)控可能是其作用機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

FoxO1是細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與了糖脂代謝、氧化應(yīng)激等重要的生物過程[14]。在胰腺中，它的低表達(dá)誘導(dǎo)了胰島β細(xì)胞的去分化，導(dǎo)致胰島素合成和分泌功能的丟失[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，治療組大鼠不僅血糖降低，空腹血清胰島素水平也顯著下降，且體重也有降低趨勢，說明番石榴葉提取物中的有效成在解除ZDF大鼠高糖毒性的同時還改善了胰島素抵抗?；趯iR-361-5p調(diào)節(jié)FoxO1的認(rèn)識，課題組推測miR-361-5p/FoxO1軸可能也存在于胰島β細(xì)胞中，番石榴葉可能通過上調(diào)miR-361-5p的表達(dá)抑制胰島β細(xì)胞中FoxO1的表達(dá)，使胰島β細(xì)胞發(fā)生去分化，去分化可以避免胰島β細(xì)胞因過度代償而直接凋亡，使它們在應(yīng)激條件下仍然能夠保持再度分化的潛力。當(dāng)番石榴葉提取物解除了高糖毒性和胰島素抵抗之后，去分化的ZDF大鼠胰島β細(xì)胞將再度分化成熟，以此更大限度地保留胰島β細(xì)胞的功能。

綜上所述，番石榴葉提取物可能通過調(diào)控miR-361-5p介入FoxO1誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞去分化過程，從而保護(hù)了β細(xì)胞功能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步豐富了番石榴葉的降糖作用靶點(diǎn)，為闡釋清熱祛濕類中藥降低血糖的分子機(jī)制提供了新的思路。