劉旸 王淼 王麗婷 房玉國＊ 黃曉林 韓超男

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院，黑龍江哈爾濱 150028；2.黑龍江飛鶴乳業(yè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150100）

煙酸和煙酰胺總稱為維生素PP，是人體中必需的13種維生素之一。無論是人體還是動物體，煙酸都能轉(zhuǎn)化為具有生物活性的煙酰胺，煙酰胺是輔酶Ⅰ、輔酶Ⅱ的組成部分[1-4]。這兩種輔酶是人體代謝正常氧化還原反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用的酶[5-8]。在嬰幼兒配方食品中添加煙酸和煙酰胺，對嬰幼兒的皮膚、消化和神經(jīng)系統(tǒng)的生長和正常發(fā)育都十分重要[9-13]。現(xiàn)行檢驗煙酸和煙酰胺的標(biāo)準(zhǔn)是GB 5009.89-2016《食品中煙酸和煙酰胺的測定》[14]，主要采用高效液相色譜法和微生物法進(jìn)行測定。根據(jù)GB/T 27418-2017《測量不確定度評定和表示》[15]，只要有檢驗檢測過程就會有測量系統(tǒng)誤差[16-19]，這就在煙酸和煙酰胺的測定過程中有不確定度的產(chǎn)生，為了讓測定的結(jié)果準(zhǔn)確就要引入測量不確定度。本文主要對微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測量不確定度進(jìn)行評定[20-24]。根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》[25]與CNASCL01-G003-2019《測量不確定度的要求》[26]，確定微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測量不確定度的來源，作為檢驗檢測實(shí)驗室，減小測量誤差、保證出具的數(shù)據(jù)評定報告具有準(zhǔn)確性和有效性，是一個實(shí)驗室的必備要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸（98%），分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；煙酸（C6H5NO2，CAS 號：59-67-6；純度≥98%）或煙酰胺（C6H6N2O，CAS 號：98-92-0；純度≥98%），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，美國BD Difco；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，美國BD Difco；煙酸測定用培養(yǎng)基，美國BD Difco。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，德國MMM；722 分光光度計，上海光譜儀器；電子分析天平，北京賽多利斯；pH 計，北京賽多利斯；蓋勃離心機(jī)；破壁料理機(jī)，美國Westinghouse。

1.3 實(shí)驗方法[14]

1.3.1 菌懸液的制備

將實(shí)驗用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum,ATCC 8014）菌株活化后，接種到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基上，36℃±1℃培養(yǎng)16 h～24 h，再轉(zhuǎn)種2 代-3 代來增強(qiáng)活力。將24 h 內(nèi)活化后的菌株接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，36℃±1℃培養(yǎng)16 h～24 h，以大于3000 轉(zhuǎn)/ 分鐘離心5 min，棄去上清液，加入10 mL 生理鹽水，用渦旋混合器振蕩該懸液。再離心5 min，棄去上清液。如前操作清洗2 次～3次后，再加10 mL 生理鹽水，混勻。吸取適量該菌懸液于10 mL 生理鹽水中，混勻制成測試菌懸液。以生理鹽水做空白，用分光光度計于550 nm 波長下測定測試菌懸液透光率T（%），調(diào)整上述菌液加入量，使測試菌懸液透光率在60%～80%。

1.3.2 測定用樣品及制備和保存

1.3.2.1 測定用樣品信息

嬰幼兒配方粉（中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心的質(zhì)控樣品，證書編號為803IP04051，Lot 2017.09.19，煙酸標(biāo)示值范圍為4824 μg/100 g～5595 μg/100 g）。

1.3.2.2 測定用樣品制備和保存

嬰幼兒配方粉每個包裝冷凍到-20℃存放，使用前恢復(fù)至室溫。

1.3.3 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取2 g～3 g（精確至0.0001 g）試樣于錐形瓶中，加入50 mL、0.5 mol/L 硫酸溶液，121℃水解30 min，取出迅速水浴冷卻至室溫。用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至4.5±0.2，移入250 mL 容量瓶中用水定容至刻度。用定量濾紙過濾，最初約10 mL 濾液應(yīng)棄去，吸取1 mL 濾液于100 mL 燒杯中，加水約20 mL，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8±0.2，移入100 mL 容量瓶中加水定容至刻度。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

1.3.4.1 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）

在含五氧化二磷的干燥器中取出干燥后的煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)品，稱取50.0 mg（精確至0.1 mg），用乙醇溶液（25%）溶解并定容至500 mL。

1.3.4.2 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)中間液（50 μg/mL）

吸取50 mL 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg/mL）至100 mL 容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容。

1.3.4.3 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)使用液（500 ng/mL）

吸取1.0 mL 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)中間液（50 μg/mL）至100 mL 容量瓶，用水定容至刻度。

1.3.4.4 煙酸（或煙酰胺）標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液

分兩個濃度，高濃度溶液的濃度為10 ng/mL；低濃度溶液的濃度為5 ng/mL。從使用液中（500 ng/mL）吸取兩次各5 mL，用水分別定容到250 mL 和500 mL。

1.3.5 微生物法測定煙酸和煙酰胺含量的計算公式

式（1）中：X-樣品中煙酸和煙酰胺含量，單位為微克每百克（μg/100 g）或微克每百毫升（μg/100 mL）；ρ-計算得到的試樣處理液中煙酸和煙酰胺含量的總平均值，單位為納克（ng）；f-稀釋倍數(shù)；m-試樣的質(zhì)量或體積，單位為克（g）或毫升（mL）。

2 微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺不確定度的評定

2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)P 的測量不確定度[27-28]

經(jīng)過驗證，微生物法在測定煙酸和煙酰胺時，煙酸和煙酰胺具有相同的生物活性，所以只要采用一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行煙酸和煙酰胺的測定即可。這里采用煙酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度P ≥98%（g/g），擴(kuò)展不確定度U=0.49%（g/g），相當(dāng)于：煙酸的純度P=0.98（g/g），擴(kuò)展不確定度U=0.0049（g/g），由于標(biāo)準(zhǔn)證書上沒有相關(guān)不確定度的其他信息，故假設(shè)是矩形均勻分布，煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(P)=0.0049/=0.002829。煙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對不確定度urel(P)=u(P)/0.98=0.002887。

2.2 樣品稱量m 的測量不確定度[29-30]

稱取嬰幼兒配方粉樣品7 次，選取5 ng/mL 濃度水平進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗，在相同的條件下測定樣品中的煙酸，如表1所示。

表1 微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸的結(jié)果

分析天平稱量的三個不確定度來源：重復(fù)性、可讀性（數(shù)字分辨力）和由于天平校準(zhǔn)產(chǎn)生的不確定度分量。天平的靈敏度及其線性：因為稱量范圍很窄，忽略其對不確定度的貢獻(xiàn)。

樣品稱量過程中，樣品的質(zhì)量m的不確定度受天平最大允許差和天平的分辨力影響。利用校準(zhǔn)證書的數(shù)據(jù)和制造商關(guān)于不確定度評定的建議，對標(biāo)準(zhǔn)品稱量有關(guān)的不確定度進(jìn)行估算，結(jié)果為±0.1 mg，這種評定考慮了前面已識別的3種分量。即標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)=0.0001/=0.00005774。樣品稱量質(zhì)量m的相對不確定度為urel(m)=u(m)/m=0.00005774/2.5565=0.00002259。

2.3 稀釋倍數(shù)f 的測量不確定度

根據(jù)GB/T 27418-2017《測量不確定度評定和表示》[15]可知，測量不確定度是利用可獲得的信息，表征賦予被測量量值分散性的非負(fù)參數(shù)。測量不確定度一般由若干分量組成。其中一些分量可根據(jù)一系列測量值的統(tǒng)計分布，按照測量不確定度的A 類進(jìn)行評定，并可用標(biāo)準(zhǔn)差表征。而另一些分量測量可根據(jù)經(jīng)驗或其他信息所獲得的概率密度函數(shù)，按照測量不確定度的B 類進(jìn)行評定，也用標(biāo)準(zhǔn)差表征。A 類評定是對在規(guī)定測量條件下測得的量值用統(tǒng)計分析的方法進(jìn)行的測量不確定度分量的評定。B 類評定主要基于權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的量值、有證參考物質(zhì)的量值、校準(zhǔn)證書、儀器的漂移、經(jīng)檢定的測量儀器的準(zhǔn)確度等級和根據(jù)人員經(jīng)驗推斷的極限值等。其中電子分析天平的校準(zhǔn)證書就是B 類評定的主要依據(jù)。

根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》[31]，在標(biāo)準(zhǔn)品配制和樣品稀釋過程中涉及的玻璃器皿為100 mL、250 mL和500 mL單刻度容量瓶，1 mL、5 mL和50 mL單刻度移液管。在實(shí)驗過程中所使用的天波牌玻璃器皿都是A 級玻璃器皿，并且在20℃時都已經(jīng)校準(zhǔn)，并且都取矩形均勻分布[31]，則包含因子為k=。20℃時水的膨脹系數(shù)α=0.00021℃-1，實(shí)驗室溫度變化為Δt±4℃，按矩形均勻分布，包含因子k=。玻璃器皿在測定過程中，不僅要考慮玻璃器皿內(nèi)部體積的測量不確定度，還要考慮溶液溫度和玻璃器皿與校準(zhǔn)溫度引起的不確定度，按矩形均勻分布。各玻璃器皿對標(biāo)準(zhǔn)品的配制和樣品稀釋的影響，如表2 所示。

表2 各玻璃器皿對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品稀釋的影響

由表2 可知，玻璃器皿對標(biāo)準(zhǔn)品配制過程中產(chǎn)生的相對不確定度為：

玻璃器皿對樣品稀釋過程中產(chǎn)生的相對不確定度為：

2.4 試樣處理液中煙酸含量ρ 的重復(fù)性的測量不確定度

2.5 測量不確定度的合成與評定

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)P 的測量不確定度的評定

根據(jù)2.1 節(jié)和表2 可知，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度是配制過程中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書上的不確定度以及逐步稀釋配制過程中玻璃器皿等產(chǎn)生的。由于微生物法測定的煙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合ATCC 8014 植物乳桿菌的生長曲線，并不呈現(xiàn)線性，所以不考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的不確定度的影響。即標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)P 相對不確定度U(P)=(urel2(P)+urel2(P 玻璃器皿))1/2=0.005021。

2.5.2 樣品稱量m 的不確定度的評定

根據(jù)2.2 節(jié)和表1 可知，樣品稱量m 的不確定度是樣品重復(fù)性稱量和分析天平自身產(chǎn)生的。即樣品稱量m 的相對不確定度

2.5.3 稀釋倍數(shù)f 的不確定度的評定

根據(jù)2.3 節(jié)和表2 可知，樣品的稀釋倍數(shù)為25000 倍，稀釋過程中產(chǎn)生的不確定度受玻璃器皿和溫度的影響，其中溫度的影響已經(jīng)包含在玻璃器皿的測量不確定度里。即稀釋倍數(shù)f的相對不確定度為U(f)=urel(f 玻璃器皿)=0.01145。

2.5.4 試樣處理液中煙酸含量ρ 的重復(fù)性的不確定度的評定

根據(jù)2.4 節(jié)和表1 可知，試樣處理液中煙酸含量ρ 的重復(fù)性相對不確定度為U(ρ)/5.3127=0.001134。

2.5.5 微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測量不確定度的評定

根據(jù)3.1 節(jié)～3.4 節(jié)可知，微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的測量不確定度為：U(X)=(U(P)2+U(m)2+U(f)2+U(ρ)2)1/2=0.01272 ≈0.01。

2.5.6 擴(kuò)展不確定度的計算根據(jù)測量不確定度評定指南對一般檢驗檢測實(shí)驗室的要求[16]，包含因子一般取k=2。因此，微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的相對擴(kuò)展不確定度Urel=k×U(X)=2×0.01=0.02 。由表1 可知，微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸的含量為5209.04 μg/100 g，則擴(kuò)展不確定度U=5209.04×0.02=104.18 μg/100 g ≈100 μg/100 g，k=2。

3 結(jié)論

采用微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺時，當(dāng)稱樣量為2 g～3 g（精確至 0.0001 g）、試樣處理液中煙酸含量ρ 為5.0 ng±0.5 ng 時，擴(kuò)展不確定度為U=100 μg/100 g，k=2。當(dāng)采用微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酰胺時，只需在測定煙酸的基礎(chǔ)上乘以一個系數(shù)1.008，即可轉(zhuǎn)化為煙酸的結(jié)果。其測量不確定度的評定過程和煙酸一致。在實(shí)驗過程中，影響微生物法測定嬰幼兒配方粉中煙酸和煙酰胺的主要因素是樣品的稀釋過程，標(biāo)準(zhǔn)品的配制、樣品稱量過程以及試樣中煙酸和煙酰胺含量的重復(fù)性的影響較小。其中樣品稱量過程以及試樣中煙酸和煙酰胺的含量的重復(fù)性為測量不確定度A 類評定，樣品的稀釋過程和標(biāo)準(zhǔn)品的配制為測量不確定度B 類評定。樣品的稀釋過程對測量不確定度的影響較大原因分析為稀釋倍數(shù)大，采用的玻璃器皿較多，在使用過程中，人員在操作規(guī)范的同時，要注意實(shí)驗環(huán)境如溫度、水的膨脹系數(shù)等對實(shí)驗過程的影響，避免誤差過大，提高準(zhǔn)確度。