方志榮，林 靜，清 源，曹 芮

(1.西昌學院資源與環(huán)境學院，四川西昌 615013；2.西昌學院攀西特色作物研究與利用四川省重點實驗室，四川西昌 615013)

0 引言

雞腿菇(Coprinuscomatus)又名雞腿蘑，學名毛頭鬼傘，屬鬼傘科、鬼傘屬大型真菌.雞腿菇口感鮮美，營養(yǎng)成分豐富[1]，含抗癌[2]、抗氧化、降血糖[3]等成分被聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織確定為集“天然、營養(yǎng)、保健”三種功能為一體的16種珍稀食用菌之一.雞腿菇也是一種具備極強的環(huán)境適應力的草腐糞生土生菌，其菌絲生理代謝活動活躍，具有較高的纖維素水平分解[4]，抗雜逆性強[5]，可以采用絕大部分農作物秸稈廢棄物進行栽種培育.我國是一個農業(yè)大國，每年大約產生9.40億t的秸稈，占全球秸稈總產量的18.50%，其中稻、麥秸稈占有很大的比重[6].稻、麥秸稈均是一種含纖維素、半纖維素、木質素、灰分等物質的復雜天然復合物，適合作為主要原料栽培雞腿菇[7]，因而采用稻、麥秸稈栽培雞腿菇可實現(xiàn)農作物廢棄物的資源化利用，對促進農業(yè)生態(tài)環(huán)境的健康發(fā)展和促進農民增收具有重要的意義.

雞腿菇發(fā)酵料栽培，是一種通過高溫堆積的手段把食用菌栽培原料進行發(fā)酵，促進栽培料軟化，同時生成能夠促進菌菇生長的細菌，有助于改善食用菌栽植培育的方式[8].發(fā)酵料栽培具有栽培工藝簡單、投資少、便于推廣等優(yōu)點.發(fā)酵料的質量標準為：發(fā)酵結束時有大量白色的嗜熱放線菌產生，質地松軟、淺褐色、無異味，有芳香味[9].在秸稈發(fā)酵的實際操作過程中，由于微生物發(fā)酵常常會使得發(fā)酵料產生大量氨氣，對食用菌菌種產生極大危害，致使菌種不能萌發(fā)成活.傳統(tǒng)除氨的做法是高溫時(60 ℃)在1 m左右的空中用鐵鍬等抖動發(fā)酵混合物散氨，然后攤開降溫.這不僅導致大量的氨氣散發(fā)到空氣中，引起環(huán)境污染，而且會造成發(fā)酵料氮的損失，降低發(fā)酵料的質量.

過磷酸鈣不僅可以補充培養(yǎng)(基)料中磷素、鈣元素，而且可以促進微生物的分解活動，有利于培養(yǎng)料的發(fā)酵腐熟[10].此外由于其含有的游離酸可與氨反應，是潛在的堆肥揮發(fā)氨氣回收固定的吸附劑[11].吳娟等的研究表明添加物料干重10%以上的過磷酸鈣可以顯著降低堆肥過程中NH3等的排放，增加堆肥產品中總碳和總氮含量[12].李帆等的研究表明添加物料干重5%～15%的過磷酸鈣可以有效抑制堆肥過程中銨態(tài)氮的揮發(fā)損失，增加堆肥的全氮和全磷的含量[13].毛慧玲等研究了過磷酸鈣在平菇栽培中的作用時發(fā)現(xiàn)因平菇品種不同[14].8%～10%[15]和8%～15%[16]的過磷酸鈣被用作輔料加入食用菌栽培基質，促進食用菌的生長.現(xiàn)用發(fā)酵料栽培雞腿菇技術過磷酸鈣的使用量一般為：0%～2%[17-18]，發(fā)酵混合物中添加5%以上的過磷酸鈣對雞腿菇胞外酶活性、產量和營養(yǎng)成分影響的報道尚少.李超等推薦雞腿菇發(fā)酵料袋式栽培配方中可加入7%的過磷酸鈣，但沒有胞外酶活性及營養(yǎng)成分等的相關報道[17].本研究通過秸稈發(fā)酵料中添加不同比例的過磷酸鈣，研究其對雞腿菇不同生長階段胞外酶活性、出菇期、生物學效率、品質等的影響，旨在為發(fā)酵料栽培雞腿菇提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗材料 供試菌種為雞腿菇7號(子實體米白色，廣溫型品種)，購于武漢周玉麟食用菌研究所；金寶貝10型食用菌栽培料發(fā)酵助劑購于北京華夏康源科技有限公司；稻草秸稈采購于西昌市農戶.

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 培養(yǎng)料發(fā)酵處理 曬干的稻草，用鍘草機切成2～5 cm左右的節(jié)段，按照預濕、拌料、建堆、翻堆的方法進行培養(yǎng)料的發(fā)酵.過程如下：將粉碎的稻草噴灑1%的石灰水，按照草干物質量1%的比例加入尿素，稻草干物質量的5%(P5)、10%(P10)和15%(P15)添加過磷酸鈣，以不添加過磷酸鈣(P0)作為對照，同時加入稀釋的金寶貝10型食用菌栽培料發(fā)酵助劑，將主料與輔料攪拌混勻后，調節(jié)混合物料含水率約為60%，pH值8～9.按常規(guī)堆置，堆內用直徑10 cm左右的尖頭木棒均勻打孔通氣，用厚膜覆蓋.當料溫上升至65 ℃左右時，可進行第一次翻堆；4～5 d再次翻倒，翻堆3次，發(fā)酵18 d待發(fā)酵腐熟料表面布滿白色菌絲，稻草秸稈輕拉即斷，物料呈咖啡色，即完成培養(yǎng)料的發(fā)酵處理[9].

1.2.2 雞腿菇畦栽及管理 在大棚內將發(fā)酵好的培養(yǎng)料按照2 kg/m2的用種量采用層播法進行播種，播種厚度30～40 cm分3層播種.上層蓋上地膜發(fā)菌.播種后28 d，雞腿菇菌絲布滿料層，去掉地膜覆土.在料面上鋪上3 cm左右的土，覆蓋后澆水，使覆土手抓成團，放手即散，即土壤濕度達到65%左右，再用地膜蓋住畦床，待雞腿菇菌絲體伸出土層時，揭去地膜，進行出菇管理.

1.2.3 生物學相關指標及酶活性測定

(1)菌絲體生長階段相關指標測定

采樣：采用交叉五點取樣法，取菌絲體進行營養(yǎng)生長期菌絲體羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶的活性測定.

粗酶液的提?。?0 g發(fā)菌料加蒸餾水100 mL，25 ℃下浸提4 h，過濾后，4 000轉/分鐘離心10 min，上清液即為粗酶液.另取20 g發(fā)菌料于80 ℃的鼓風干燥箱中烘干至恒重,采用上述方法提取上清液作為對照[19].

羧甲基纖維素酶活性的測定采用DNS比色法[19]，其活力單位為：在50 ℃的條件下反應1 min產生相當于1 ug分子葡萄糖的還原糖的酶量.半纖維素酶的測定采用DNS比色法[19]，其活力單位為：在50 ℃的條件下反應1min產生相當于1 ug分子葡萄糖的還原糖的酶量.漆酶的測定采用鄰甲苯胺氧化法[19]，其活力單位為：1 g干物質中的酶含量單位時間內使OD600值改變0.01定義為一個活力單位.淀粉酶的測定采用DNS比色法[19]，其活力單位為：1 g干物質與底物反應1 min釋放1 ug葡萄糖定義為一個活力單位.過氧化物酶的測定采用愈創(chuàng)木酚法[19]，其活性單位為：1 g干物質中的酶含量單位時間內使OD470值改變0.01定義為一個活力單位.

(2)子實體生長階段相關指標測定

待雞腿菇子實體七八分成熟采收.記錄每個處理下雞腿菇的現(xiàn)蕾時間、首次采菇時間、第一潮菇鮮菇產量，計算不同配方的生物學效率，采集第一潮菇進行干物質、總糖和粗蛋白含量的分析.

生物學效率(%)=鮮菇重(g)/干料重(g)×100%

子實體生長階段胞外酶活性的測定：按照上述方法采集發(fā)菌料，測定子實體階段菌絲體羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶的活性.

(3)子實體營養(yǎng)成分測定

每處理采集10個子實體，記錄子實體的鮮重，將其放入鼓風干燥箱中105 ℃烘10 min，后在80 ℃的條件下烘干至恒重，測其干物質含量.將烘干后的子實體粉碎，過10目篩，材料用于測定粗蛋白含量和總糖含量.粗蛋白含量含量的測定：采用納氏比色法[20].總糖的測定：先采用鹽酸水解后[21]，然后采用蒽酮比色法測定含量[22].

1.2.4 數據統(tǒng)計與分析 利用SPSS 23.0對胞外酶活性和子實體營養(yǎng)成分進行方差分析，并用LSD進行差異顯著性檢驗.

2 結果與分析

2.1 過磷酸鈣對雞腿菇菌絲體和子實體生長階段胞外酶活性的影響

由表1可知，添加不同量過磷酸鈣的發(fā)酵料對雞腿菇菌絲體生長階段菌絲體胞外酶活性有顯著影響.與P0相比，P5，P10，P15顯著提高了羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶的活性.羧甲基纖維酶是一類將纖維素分解為葡萄糖的酶，各處理羧甲基纖維素酶的活性大小的順序為：P10>P15>P5>P0.半纖維素酶可將半纖維素分解為五碳糖、六碳糖和糖醛酸，各處理半纖維素酶的活性大小的順序為：P5≈P10>P15>P0.漆酶和過氧化物酶是木質素分解相關的酶,可將木質素分解為復雜的小分子化合物，各處理漆酶的活性大小的順序為：P5≈P10>P15>P0；各處理過氧化物酶的活性大小的順序為：P5≈P10≈P15>P0.淀粉酶的作用主要是將低聚糖降解為葡萄糖，各處理淀粉酶的活性大小的順序為：P10>P15>P5>P0.

由表1可知，添加不同量過磷酸鈣的發(fā)酵料對雞腿菇子實體生長階段菌絲體胞外酶活性有顯著影響.與P0相比，P5，P10，P15顯著提高了羧甲基纖維素酶、半纖維素酶、漆酶、淀粉酶、過氧化物酶的活性.各處理纖維素酶的活性大小的順序為：P10>P15≈P5>P0；各處理半纖維素酶的活性大小的順序為：P10>P15>P5>P0；各處理漆酶的活性大小的順序為：P10>P5≈P15>P0；各處理過氧化物酶的活性大小的順序為：P10>P5≈P0≈P15；各處理淀粉酶的活性大小的順序為：P10>P5>P15>P0.

由表1可知，子實體生長階段羧甲基纖維素酶的活性顯著提高，P0、P5、P10、P15羧甲基纖維素酶的活性分別比菌絲體生長時期提高了2.89、2.42、1.21、1.59倍.子實體生長階段，半纖維素酶的活性降低，P0、P5、P10、P15半纖維素酶的活性分別比菌絲體生長時期降低了58.3%、39.9%、12.6%、34.1%.子實體生長階段，漆酶活性的變化趨勢比較復雜，P0與菌絲體生長階段無顯著差異，P5和P10分別比菌絲體生長階段下降28.1%和14.8%，P15比菌絲體生長階段提高22.0%.子實體生長階段淀粉酶的活性顯著提高，各處理淀粉酶的活性分別比菌絲體生長時期提高1.97、2.43倍、69.5%、54.7%.子實體生長階段過氧化物酶的活性降低，P0、P5、P10、P15的活性分別比菌絲體生長時期降低了34.8%、33.6%、18.2%、47.7%.

表1 過磷酸鈣對雞腿菇菌絲體和子實體生長階段胞外酶活性的影響

2.2 過磷酸鈣的不同添加量對雞腿菇生物學效率的影響

由表2可知，四個處理中，P10和P5處理組的雞腿菇現(xiàn)蕾時間和首次采菇時間相比于P0和P10組更短，總的看來在四個處理中P10組的雞腿菇現(xiàn)蕾時間和首次采菇時間最短；P10組第一潮菇的鮮菇產量最高，但是P5、P15組相比于P0組第一潮菇的鮮菇產量也有所提高；P10組生物學效率最大，但是P5和P15組的生物學效率相比于P0組的也有所提高.結果表明：添加適量的過磷酸鈣與P0組相比可以縮短雞腿菇現(xiàn)蕾和出菇的時間、增加產量和提高生物學效率.在四個處理中，過磷酸鈣添加量為10%時，雞腿菇現(xiàn)蕾和出菇的時間最短，產量最高，生物學效率最大.

表2 過磷酸鈣對雞腿菇生物學效率的影響

2.3 過磷酸鈣的不同添加量對雞腿菇品質的影響

由表3可知，添加過磷酸鈣的發(fā)酵料顯著增加了雞腿菇干物質、總糖和粗蛋白的含量.各處理間干物質存在顯著差異，干物質的大小順序為：P5>P10>P0>P15.P15處理的雞腿菇總糖含量最高，其次為P5和P10.雞腿菇中含有豐富的蛋白質，各處理的雞腿菇的含量大小的順序為：P10>P15>P5>P0.與P0相比，P5，P10，P15處理雞腿菇含量分別提高了22.4%、82.6%、55.0%.

表3 過磷酸鈣對雞腿菇品質的影響

3 討論與結論

雞腿菇胞外酶的活性與其自身菌絲體的生長和子實體長成有緊密的關系.菌菇胞外酶活性的高低影響其自身分解能力[23]，倪新江等人發(fā)現(xiàn)栽培料中營養(yǎng)物質含量不同只改變胞酶活性的相對大小，變化規(guī)律則不改變[24].稻草秸稈中所富含的纖維素、半纖維素和淀粉等大分子物質不能被雞腿菇直接利用，只有通過其自身分泌相應的胞外酶將以上物質分解成葡萄糖等小分子物質進行吸收利用.趙亞東[19]等人研究測得秀珍菇的羧甲基纖維素酶、淀粉酶，漆酶，過氧化物酶，半纖維素酶活性的提高能夠促進秀珍菇子實體的生長發(fā)育，張曉昱通過研究香菇胞外酶活性與其自身生產發(fā)育的關系得出，胞外酶活性高低影響其產量和品質[25].因此本研究在稻草秸稈發(fā)酵料中添加過磷酸鈣(特別是P10)，提高了雞腿菇胞外酶的活性，雞腿菇能夠分解和吸收稻草秸稈中更多的營養(yǎng)物質，促進雞腿菇菌絲體和子實體的生長發(fā)育.

楊文琪等[26]的研究表明菌絲生長時期雞腿菇主要利用半纖維素，子實體生長時期雞腿菇利用纖維素為主要營養(yǎng)物質.在本研究中，雞腿菇子實體生長階段羧甲基纖維素酶和淀粉酶的活性比菌絲體生長階段明顯提高，半纖維素酶、漆酶(P15除外)和過氧化物酶的活性比菌絲體生長階段明顯下降，這說明雞腿菇子實體生長階段主要依靠稻草秸稈中的纖維素獲得大量的碳源，這種結果楊文琪等[26]和劉朝貴等[27]對雞腿菇胞外酶活性的研究結果一致.

除碳源外，雞腿菇的生長還需要充足的氮源、氨基酸、維生素等營養(yǎng)物質的合成均需要氮素的參與.培養(yǎng)料中不同的C/N將影響雞腿菇的產量和品質，綜合考慮其適宜的C/N為28～32∶1[28-29].堆肥(發(fā)酵)料中加入過磷酸鈣降低了堆肥(發(fā)酵)過程中NH3的排放，增加了堆肥(發(fā)酵料)中的總碳和總氮含量[10].P5、P10、P15處理的發(fā)酵料中可能含更豐富的氮源，從而為雞腿菇的營養(yǎng)生長和生殖生長提供了更充足的營養(yǎng)物質，其產量的品質比P0顯著提高.P10處理第一潮菇鮮菇產量、生物學效率最高、蛋白質含量最高，可應用于實際生產.