黃志藝，謝麗琴，許嘉龍，劉琦濤，楊培奎

（韓山師范學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，廣東 潮州 521041）

牛蛙（Rana catesbeiana）原產(chǎn)于北美洲和墨西哥等地，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值較高，且其皮、油和腺體等可作為工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和醫(yī)藥業(yè)的原料［1-2］.自上世紀(jì)60年代引入我國以來，經(jīng)過多年的推廣已成為我國主要水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)之一，其年產(chǎn)量已超過15 萬噸［3］.然而，近年來由于牛蛙養(yǎng)殖密度增大、水質(zhì)惡化，病害也日益突出.目前已報道的病害主要有寄生蟲病、病毒性疾病以及由變形菌（Proteus vulgaris）、鏈球菌（Streptococcus）、達(dá)卡氣單胞菌（Aeromonas dhakensis）、金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）等引起的細(xì)菌性疾?。?-8］.其中，細(xì)菌性疾病由于致病菌種類多、致病的病因復(fù)雜、發(fā)病和致死率高等原因經(jīng)常給牛蛙養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，因此一直以來都是牛蛙養(yǎng)殖中病害防控的重點(diǎn)［9］.

在養(yǎng)殖過程中，水體環(huán)境的污染、富營養(yǎng)化等導(dǎo)致水體中致病菌大量繁殖，嚴(yán)重危害水生動物的生存，致使病害頻發(fā).因此，養(yǎng)殖環(huán)境中致病微生物的防治對于健康養(yǎng)殖、病害防控具有重要意義.為此，本研究運(yùn)用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)方法，從牛蛙養(yǎng)殖場的廢水中分離細(xì)菌，結(jié)合理化特性以及16SrRNA 擴(kuò)增和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，鑒定病原.同時，對分離細(xì)菌的耐藥性以及致病力進(jìn)行分析，以期為牛蛙養(yǎng)殖過程中環(huán)境致病菌的科學(xué)防治提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

牛蛙池塘廢水采自廣東省汕頭市澄海區(qū)鹽鴻鎮(zhèn)牛蛙養(yǎng)殖場；成體幼蛙購自同一地區(qū)的種苗繁育基地，開展實(shí)驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)5-7 天.陳皮、麻黃、虎杖、廣藿香、苦參根、野菊花、蛇床子、丁香、黃柏、艾葉、黃芩、烏梅、五味子等中藥材均購自廣東省潮州市湘橋區(qū)大森林藥房.

1.2 主要試劑和儀器

腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定管、藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司；2×Taq PCR StarMix、瓊脂糖，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’），由華大基因科技有限公司合成.SHP-150 型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；博日LifeECO 基因擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；Gel DOCTM XR+凝膠成像系統(tǒng)、PowerPac basic 電泳儀，美國Bio-Rad 公司；DYCP-31E 型水平電泳槽，北京六一儀器廠.

1.3 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨1%，酵母膏1%，氯化鈉0.5%，pH 值7.2. LB 固體培養(yǎng)基是在LB 液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%～2.0%的瓊脂，121 ℃20 min［10］.

1.4 中草藥水提取液的制備

分別取陳皮、麻黃、虎杖、廣藿香、苦參根、野菊花、蛇床子、丁香、黃柏、艾葉、黃芩、烏梅、五味子等十三種中藥30 g，加入500 mL 蒸餾水置于超聲波提取器處理提取30 min，隨后將各中草藥水提取液再加熱煮沸1 h，以無菌紗布趁熱過濾煎液，并將濾液加熱濃縮到50 mL.取1 mL濃縮液測定干物質(zhì)質(zhì)量，其余保存于-80 ℃?zhèn)溆?

1.5 病原菌的分離純化及菌懸液制備

將采集的水樣，在無菌條件下利用0.7%無菌生理鹽水進(jìn)行一系列稀釋后，取100 μL 稀釋液均勻涂布于LB瓊脂平板，28 ℃，培養(yǎng)24 h.挑選形態(tài)特征相似的優(yōu)勢菌落，通過2-3代的劃線分離純化，獲得一株優(yōu)勢的純培養(yǎng)菌株W6，4 ℃保存待用.將W6菌接種至LB液體培養(yǎng)基，28 ℃，150 rpm/min，培養(yǎng)24 h，隨后離心收集菌體并用0.7%的無菌生理鹽水重懸菌體制成菌懸液.

1.6 病原菌的形態(tài)觀察和生理生化鑒定

觀察純化后菌株W6 的單菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡觀察其形態(tài)特征.將W6 接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃，150 rpm/min，培養(yǎng)24 h，隨后收集菌體并用0.7%的無菌生理鹽水制成菌懸液后接種于生化反應(yīng)管中，28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察結(jié)果，生理生化鑒定采用杭州微生物試劑有限公司的腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定試劑盒，并按照相應(yīng)的操作進(jìn)行.

1.7 病原菌16SrRNA基因擴(kuò)增及其序列分析

利 用 細(xì) 菌 通 用 引 物27F （5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' ） 和1492R （5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3' ）對菌株S15 基因組DNA 進(jìn)行16SrRNA 基因序列的擴(kuò)增.16SrRNA 基因PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：2×Taq MasterMix（Dye）5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板1 μL，ddH2O 2 μL；PCR 反應(yīng)條件：96 ℃3 min；96 ℃30s ，55 ℃1 min，72 ℃2 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10min.隨后，取2 μL的PCR產(chǎn)物利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將單一且符合目的大小的PCR產(chǎn)物送廣州華大基因科技有限公司完成測序.

將所獲得的16SrRNA 基因序列上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，并利行BLAST 進(jìn)行序列相似性比對，選取與所測序列同源性高的已知菌株的16SrRNA 基因序列.采用MEGA7.0 軟件，Neighbor-Joining 法進(jìn)行聚類分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［5］.

1.8 抗生素敏感性試驗(yàn)

參照KB紙片擴(kuò)散法［11］，即以涂布法接種0.1 mL1.0×107CFU/mL 的菌懸液于LB培養(yǎng)基平板上，然后將藥敏紙片（杭州微生物試劑有限公司）貼于培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h 后，測定其抑菌圈直徑（mm），每種藥物平行重復(fù)三次，確定分離菌株對抗生素的敏感性.

1.9 中草藥水提取液對W6菌株抑菌活性分析

參照課題組此前的方法［12］，在LB 培養(yǎng)基平板上涂布接種0.1 mL1.0×10?CFU/mL 的菌懸液.隨后，放置直徑為6 mm 的滅菌濾紙，并用20 μL 的中草藥水提取液浸潤.將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)24 h，隨后測定抑菌圈直徑.以頭孢霉素（20 μL，0.1 mg/mL）為陽性對照，以蒸餾水20 μL為陰性對照，所有的分析進(jìn)行三次重復(fù).

用二倍稀釋法測定中槽藥水提取物對W6 菌株的MIC 和MBC.首先，在96 孔板中按照每孔100 μL的量加入LB液體培養(yǎng)基.隨后，在每一排的第一孔中加入100 μL中草藥水提取液（100 μg/mL），充分混勻后取100 μL 至第二孔，并依次稀釋至第11 孔，第12 列孔作為空白對照.每個孔接種加入1 μL 稀釋至1.0×103CFU/ml 的菌液，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄MIC、MBC，平行重復(fù)3 次，每組數(shù)值取平均值.

1.10 細(xì)菌致病性試驗(yàn)

為了檢測分離菌株W6 的致病性，以牛蛙為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行細(xì)菌致病性實(shí)驗(yàn).將W6 接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h后收集菌體，用0.7%的無菌生理鹽水制成濃度為1×109cell/mL的菌懸液.采用腹腔注射的方法進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)組每只牛蛙注射100 μL 菌懸液，對照組注射同等劑量的無菌生理鹽水.注射之后的牛蛙放入塑料桶中暫養(yǎng)，隨后每隔24 h 觀察并記錄一次牛蛙的死亡情況，實(shí)驗(yàn)為期168 h.

2 結(jié)果

2.1 病原菌的形態(tài)特征

菌株W6在LB培養(yǎng)基上形成的菌落呈圓形、中間隆起、邊緣整齊、表面光滑.革蘭氏染色的結(jié)果表明，該菌株為革蘭氏陰性菌株，鏡檢觀察其為兩端鈍圓的短桿菌（圖1）.

圖1 革蘭氏染色后病原菌的形態(tài)特征

2.2 病原菌的生理生化特性

菌株W6 生理生化特性見表1.參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，菌株W6的生理生化特性與弗氏檸檬酸桿菌的基本一致.對菌株W6 在甲基紅、硫化氫、動力瓊脂、山梨醇、木糖、葡萄糖等的檢測結(jié)果均為陽性；在靛基質(zhì)、側(cè)金盞花醇、尿素、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氫酶等的檢測結(jié)果均為陰性，上述生理生化特性鑒定結(jié)果與弗氏檸檬酸桿菌參考菌株的生理生化特性一致.

表1 W6革蘭氏陰性桿菌生理生化鑒定結(jié)果

2.3 16SrRNA基因序列分析

分離菌株W6 的16SrRNA 基因PCR 擴(kuò)增后，分別獲得大小為1 401 bp 的片段，

與預(yù)期結(jié)果一致.將測序結(jié)果在NCBI 上采用BLAST 進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果顯示分離菌株W6 的16SrRNA弗氏檸檬酸桿菌同源性均為99% 以上.采用MEGA7.0軟件，通過Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示該菌株與弗氏檸檬酸桿菌同一進(jìn)化分支.根據(jù)細(xì)菌形態(tài)觀察、生理生化鑒定結(jié)果及16SrRNA基因基因序列分析，可確定分離菌株W6 為弗氏檸檬酸桿菌.

圖2 W6菌株16SrRNA基因序列與部分相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌的耐藥性

采用藥敏紙片法測試分離菌株W6對30種抗菌藥物的敏感性，結(jié)果如表2所示.分離菌株W6 僅對呋喃唑酮和頭孢他定2 種抗生素高度敏感；對丁胺卡那、頭孢哌酮、哌拉西林、多粘霉素B 等4 種藥物中度敏感；對麥迪霉素、青霉素、諾氟沙星、苯唑西林、氧氟沙星、氨芐西林、環(huán)丙沙星、慶大霉素、羧芐西林、萬古霉素、卡那霉素、新霉素、頭孢氨芐、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、頭孢唑啉、多西環(huán)素、頭孢拉定、氯霉素、米諾環(huán)素、頭孢呋辛、克林霉素、紅霉素、頭孢曲松等24種抗生素不敏感.

表2 抗生素敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果（單位：mm）

2.5 中草藥對病原菌的抑菌作用

由表3可知，五味子、烏梅、黃芩、艾葉等4種草藥水提取液對分離菌株W6 具有一定抑菌作用.進(jìn)一步分析上述中草藥水提取液對分離菌株W6 的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）.具體結(jié)果如表4 所述，黃芩水提取液、烏梅水提取液、五味子水提取液、艾葉水提取液對分離菌株W6 的MIC 分 別 是23.0 mg/mL、1.6 mg/mL、2.4 mg/mL 和6.3 mg/mL；MBC 分別是46.0 mg/mL、3.1 mg/mL、4.9 mg/mL和12.5 mg/mL.

表3 中草藥水提取液對菌株W6的抑菌活性

表4 中草藥水提取液對菌株W6的MIC和MBC

2.6 致病性試驗(yàn)

對牛蛙進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3 所示.試驗(yàn)組的牛蛙在24 h 內(nèi)即出現(xiàn)死亡，并在48 h 內(nèi)累積死亡率即超過50%，在72 h 內(nèi)累積死亡率達(dá)到60%.而對照組僅在48 h時出現(xiàn)1個個體死亡的情況.這表明該分離菌株具有較強(qiáng)致病性.

圖3 牛蛙注射W6菌株的累積死亡率

3 討論

3.1 弗氏檸檬酸桿菌的鑒定

弗氏檸檬酸桿菌是一種革蘭氏陰性短桿菌屬腸桿菌科、枸櫞酸桿菌屬［13-14］.一般而言，不同菌株來源的弗氏檸檬酸桿菌，其理化特性可能存在差異.劉張淮等［15］分離的克氏原螯蝦源弗氏檸檬酸桿菌與陳綺梨等［16］分離的加州鱸源弗氏檸檬酸桿菌，蘇英等［17］分離的大鯢源致病性弗氏檸檬酸桿菌以及本研究發(fā)現(xiàn)的分離菌株W6 其利用尿素的特性存在差異.有研究指出，同種不同來源菌株的生理生化特性差異可能與不同菌株的來源地區(qū)、氣候、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件等差異有關(guān)［18］.因此，細(xì)菌的鑒定通常需要在生理生化分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步結(jié)合分子鑒定加以確認(rèn)［19］.

3.2 弗氏檸檬酸桿菌的致病性

弗氏檸檬酸桿菌作為一種水產(chǎn)動物常見病原菌以及人魚共患的致病菌廣泛存在于自然水體中［20-21］.感染水產(chǎn)動物之后，可引起脾臟和肝臟壞死腫大，消化道出現(xiàn)炎癥，體表出血或腐爛，肌肉水腫等癥狀［15］.此前有研究表明弗氏檸檬酸桿菌是牛蛙“紅腿癥”的致病菌之一［22-24］.同時大量的研究證實(shí)，弗氏檸檬酸桿菌可引起克氏原螯蝦［25］、羅非魚［26］、花鰻鱺［27］、團(tuán)頭魴［28］、大鯢［29］等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的病害并造成較大的經(jīng)濟(jì)損失.不同來源的弗氏檸檬酸桿菌的致病性通常存在差異.陳綺梨等［16］對鱸源的弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行人工回歸感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1×108CFU/mL 菌懸液浸泡感染，在浸泡16 h 后出現(xiàn)死亡，連續(xù)觀察7 d 發(fā)現(xiàn)其累積死亡率達(dá)60%.蘇英等［17］對大鯢源弗氏檸檬酸桿菌進(jìn)行人工感染回歸實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對大鯢的半致死濃度（LD50）為3.16×106CFU/mL.本實(shí)驗(yàn)的分離菌株在腹腔注射0.1 mL 1×108CFU/mL，在48 h其累積死亡率可達(dá)60%，這表明該分離菌株具有較強(qiáng)的致病性和毒力.

3.3 弗氏檸檬酸桿菌的耐藥性

弗氏檸檬酸桿菌對抗生素的耐藥性因菌株不同、宿主差異以及環(huán)境等因素存在差異.本研究的分離菌株對大環(huán)內(nèi)酯類、青霉素類和四環(huán)素類抗生素已經(jīng)產(chǎn)生明顯耐藥性，這與蘇英等［17］、盧君輝等［30］、白杰等［31］的報道類似.而本研究的分離菌株W6 對諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為耐藥性，這與陳綺梨等［16］的報道存在差異，但與張冬星等［28］的研究類似，這可能與菌株來源地的養(yǎng)殖環(huán)境、用藥情況以及宿主的差異有關(guān)［32］.因此，對于養(yǎng)殖過程中出現(xiàn)的細(xì)菌性病害應(yīng)快速進(jìn)行病原分離鑒定和敏感藥物篩選，從而為病害科學(xué)防治提供依據(jù)［16］.

中草藥來源廣泛、價格低廉、毒性低、不易產(chǎn)生耐藥性，在當(dāng)前限制使用抗生素的形勢下，使用中草藥提取物替代傳統(tǒng)抗生素已逐漸成為解決病原菌耐藥性的有效方式之一［12］.本研究發(fā)現(xiàn)五味子、烏梅、黃芩、艾葉等中草藥水提取液對分離菌株W6具有一定的抑菌效果.在本課題組前期的研究中，五味子對嗜水氣單胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌都具有較強(qiáng)的抑菌作用［12］.葉偉東等發(fā)現(xiàn)烏梅水提取液對加州鱸源的嗜水氣單胞菌具有良好的抑菌效果［33］.這可能與五味子含有鞣質(zhì)，烏梅含有有機(jī)酸等抗菌物質(zhì)有關(guān)［34-35］.雖然體外抑菌實(shí)驗(yàn)表面五味子、烏梅、黃芩和艾葉對弗氏檸檬酸桿菌具有一定的防治效果，但抗菌機(jī)制還需進(jìn)一步研究.