陳明輝，歐陽(yáng)正曉，鄧件良△

(1.長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科，湖南 長(zhǎng)沙 410012)

如何促進(jìn)骨折后的骨骼愈合、減少骨不連的發(fā)生，一直是臨床關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一。數(shù)據(jù)顯示，2018年全球骨折發(fā)病率約為2%，但因骨折愈合過程十分復(fù)雜，盡管嚴(yán)格依照治療規(guī)范進(jìn)行處理，骨折骨不連的發(fā)病率仍高達(dá)5%～10%[1]。脛骨干骨折是臨床中最常見的長(zhǎng)骨骨折類型之一，一般采用手術(shù)治療，但易于發(fā)生骨不連，影響患者的生活質(zhì)量。因此，對(duì)脛骨干骨折患者術(shù)后的愈合情況進(jìn)行及時(shí)評(píng)估及干預(yù)十分重要。

骨折的愈合過程復(fù)雜，涉及免疫細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及其他多種細(xì)胞、細(xì)胞信號(hào)分子。已有研究顯示，T淋巴細(xì)胞根據(jù)亞群不同，可對(duì)骨折愈合起到促進(jìn)或者抑制作用[2]。其中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)作為具有重要免疫調(diào)節(jié)、免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，其數(shù)目或功能異常已被證實(shí)與多種炎癥性疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤相關(guān)。此外，免疫系統(tǒng)的T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)等都與破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞具有相互作用[3-4]。因此，作者認(rèn)為Treg細(xì)胞異?？赡芤苍诠钦酃遣贿B的過程中發(fā)揮了一定作用，對(duì)脛骨干骨折骨不連患者Treg細(xì)胞頻率的變化進(jìn)行了研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 研究共納入自2015年5月至2020年8月長(zhǎng)沙市中心醫(yī)院收治的60例脛骨干骨折患者，術(shù)后根據(jù)脛骨干骨折影像學(xué)愈合評(píng)分系統(tǒng)(RUST)評(píng)分，將患者分為骨折正常愈合組45例，骨折骨不連組15例。此外，納入45例無骨折者作為健康對(duì)照組。骨折正常愈合組中，男25例，女20例，平均年齡(41.7±5.9)歲，平均體重(64.55±11.34)kg，平均受傷至手術(shù)時(shí)間為6.3 d。骨折骨不連組中，男9例，女6例，平均年齡(42.1±6.1)歲，平均體重(63.87±10.91)kg，平均受傷至手術(shù)時(shí)間為6.4 d。健康對(duì)照組中，男23例，女22例，平均年齡(41.9±5.5)歲，平均體重(64.10±10.25)kg。3組在年齡、性別、體重等方面比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡大于或等于18歲；(2)單純外傷導(dǎo)致的單側(cè)脛骨干骨折，經(jīng)臨床體征與影像學(xué)檢查確診；(3)研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)骨質(zhì)疏松癥、骨腫瘤、骨結(jié)核等疾病導(dǎo)致的病理性骨折；(2)患有惡性腫瘤、自身免疫性疾??；(3)長(zhǎng)期使用糖皮質(zhì)激素或其他免疫抑制劑藥物；(4)患有精神疾病或者其他身體器官嚴(yán)重疾病。

1.2方法 入院后，對(duì)患者進(jìn)行血常規(guī)、大小便常規(guī)、心電圖、胸部X線片、X線、計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)等檢查。根據(jù)患者病情，對(duì)骨折采用外固定架、鋼板或髓內(nèi)釘固定，必要時(shí)行自體骨移植。術(shù)后第1、2、4、8、12、16、20、24周復(fù)查，采用RUST評(píng)估患者脛骨干骨折愈合情況。若第24周RUST評(píng)分大于或等于7分，且骨折處無壓痛、無異常移位，評(píng)定為骨折正常愈合，否則評(píng)定為骨折骨不連。于術(shù)前和術(shù)后1、4、24周分別采集各組受試者3～5 mL外周靜脈血標(biāo)本，室溫下以2 000 r/min離心30 min，在無制動(dòng)狀態(tài)下自然停止，收集外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，隨后洗滌PBMC2次，加入抗CD4-APC-Cy7、抗CD25-PE熒光抗體，流式表面熒光抗體標(biāo)記染色20 min。洗滌PBMC2次，用Fix/Perm液及Perm液處理30 min；洗滌1次，加入抗FOXP3-Alexa Fluor-488熒光抗體，流式胞內(nèi)熒光抗體染色60 min。洗滌后，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞數(shù)量。流式熒光抗體均購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司，流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司的FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀。

2 結(jié) 果

術(shù)前，健康對(duì)照組CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞頻率(Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例)為(4.28±1.35)%，骨折正常愈合組Treg細(xì)胞頻率為(7.53±2.21)%，骨折骨不連組Treg細(xì)胞頻率為(6.29±1.74)%。健康對(duì)照組Treg細(xì)胞頻率低于骨折正常愈合組及骨折骨不連組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后1、4周，骨折骨不連組及骨折正常愈合組Treg細(xì)胞頻率較術(shù)前均呈升高趨勢(shì)，健康對(duì)照組Treg細(xì)胞仍低于骨折骨不連組及骨折正常愈合組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后4周，骨折正常愈合組Treg細(xì)胞頻率明顯高于骨折骨不連組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后24周，3組間Treg細(xì)胞頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

3 討 論

脛骨干骨折是臨床常見的骨折，約占全身骨折的12%。由于骨折后局部血運(yùn)變差、脛骨的開放性及感染等因素，患者術(shù)后常發(fā)生骨折延遲愈合，甚至骨不連等嚴(yán)重并發(fā)癥，發(fā)病率高達(dá)48%[5]。骨不連患者常需經(jīng)歷多次反復(fù)手術(shù)及長(zhǎng)時(shí)間的后續(xù)治療，患者患處的疼痛、功能障礙，以及反復(fù)外科治療不僅給患者帶來了巨大的軀體痛苦和心理壓力，也會(huì)給患者家庭造成沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[6]。因此，骨不連一直是骨科領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。解剖復(fù)位、堅(jiān)固固定、促進(jìn)骨折愈合、加強(qiáng)成骨能力均是骨不連治療的關(guān)鍵。骨折愈合過程涉及骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等的增殖、分化，免疫細(xì)胞也參與骨折后骨再生的調(diào)節(jié)。骨折時(shí)常伴隨發(fā)生周圍組織及血管系統(tǒng)損傷，繼而引發(fā)局部炎性反應(yīng)，形成血腫[7]。骨折局部及血腫周圍的高濃度促炎性因子可吸引、募集各種免疫細(xì)胞，包括中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞在炎性環(huán)境下分化為促炎性M1表型，進(jìn)一步激活獲得性免疫反應(yīng)，特別是激活T淋巴細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T細(xì)胞減少影響成骨細(xì)胞成熟，導(dǎo)致骨質(zhì)礦化延緩，缺乏T細(xì)胞的大鼠骨折后骨質(zhì)修復(fù)及骨重建均顯著減緩[8-9]。Treg細(xì)胞是一類重要CD4+T細(xì)胞亞群，具有免疫調(diào)節(jié)功能，其經(jīng)典表型為CD4+CD25+FOXP3+。Treg細(xì)胞的經(jīng)典免疫調(diào)節(jié)作用包括抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞活動(dòng)，誘導(dǎo)建立免疫耐受，以及抑制炎性反應(yīng)。Treg細(xì)胞可促進(jìn)成骨細(xì)胞并抑制破骨細(xì)胞活動(dòng)[10]。此外，Treg細(xì)胞可通過分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、白細(xì)胞介素-10等經(jīng)典的抗炎性細(xì)胞因子，以調(diào)節(jié)促炎性Th1細(xì)胞的活動(dòng)，或誘導(dǎo)抗炎性miRNA的表達(dá)，從而抑制骨折局部炎性反應(yīng)[11-12]。

本研究中采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)對(duì)脛骨干骨折患者外周血的Treg細(xì)胞頻率進(jìn)行了動(dòng)態(tài)檢測(cè)，結(jié)果顯示，術(shù)前和術(shù)后1、4周，骨折正常愈合組及骨折骨不連組Treg細(xì)胞頻率均高于健康對(duì)照組，且隨時(shí)間進(jìn)展呈升高趨勢(shì)，提示Treg細(xì)胞在骨折后參與骨質(zhì)修復(fù)與重建。值得注意的時(shí)，術(shù)后4周，骨折正常愈合組Treg細(xì)胞頻率明顯高于骨折骨不連組。術(shù)后24周，3組間Treg細(xì)胞頻率未再觀察到顯著差異。以上結(jié)果表明，骨折骨不連患者在骨折后早期，Treg細(xì)胞比例低于正常愈合患者，Treg細(xì)胞不足可能導(dǎo)致成骨細(xì)胞活動(dòng)受抑及局部炎癥清除障礙，從而引起骨折骨不連。