韋良臣，楊 琪，曾 暉，翁 鑒，劉 佩，康 斌，鐘華戈，于 斐△

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，廣東 深圳 518036；2.骨科生物材料國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，廣東 深圳 518036；3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院超聲診斷科，廣東 深圳 518036；4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胃腸外科，廣西 南寧 530021)

周?chē)窠?jīng)損傷是指周?chē)窠?jīng)干及其分支受到直接或間接創(chuàng)傷后發(fā)生的損傷，常見(jiàn)于體力勞動(dòng)者，致傷原因包括解剖性原因和損傷性原因。解剖性原因是解剖異常引起周?chē)窠?jīng)的卡壓性損傷；損傷性原因主要由于機(jī)械性原因(切割、擠壓)、物理性原因(凍傷、燙傷)、缺血性原因(栓塞)、醫(yī)源性原因(注射、手術(shù))及代謝、腫瘤等造成[1]，可導(dǎo)致軀體的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及自主神經(jīng)功能障礙等一系列癥狀。周?chē)窠?jīng)損傷的治療效果常難以估計(jì)，受到損傷部位、損傷原因、機(jī)體狀況等多種因素影響，若治療不及時(shí)，往往會(huì)導(dǎo)致不良后果，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致殘疾，這使得周?chē)窠?jīng)損傷成為骨科醫(yī)生的棘手問(wèn)題。周?chē)窠?jīng)損傷可通過(guò)藥物、電刺激等非手術(shù)方法和手術(shù)方法治療[2]。隨著醫(yī)學(xué)發(fā)展，越來(lái)越多的神經(jīng)相關(guān)因子被證實(shí)與周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)相關(guān)，例如傳統(tǒng)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子、睫狀神經(jīng)生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等[3]，均可促進(jìn)周?chē)窠?jīng)損傷后的修復(fù)。許多新的因子也能有效實(shí)現(xiàn)功能，例如Wnt5a因子[4]。

Wnt5a因子是非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的代表性配體，首先于20世紀(jì)90年代被發(fā)現(xiàn)，其基因含有5個(gè)外顯子，起始的631 bp有很強(qiáng)的啟動(dòng)子活性[5]。研究顯示，Wnt5a因子可以通過(guò)自身所在的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路、核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路等[6]，參與到骨科相關(guān)疾病如周?chē)窠?jīng)損傷、骨關(guān)節(jié)炎、骨缺損修復(fù)等[7]的進(jìn)程中。雪旺細(xì)胞是周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，延神經(jīng)元的突起分布，包裹在神經(jīng)纖維上形成有髓神經(jīng)纖維，是周?chē)窠?jīng)疾病中研究較多的一種細(xì)胞。RSC96細(xì)胞是一種細(xì)胞系，經(jīng)大鼠原代培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)后自發(fā)轉(zhuǎn)化而形成，呈貼壁樣生長(zhǎng)，能夠表達(dá)原代雪旺細(xì)胞的部分特性，常常用于周?chē)窠?jīng)損傷相關(guān)的疾病研究中，以代替原代雪旺細(xì)胞。

慢病毒載體是以人類(lèi)免疫缺陷Ⅰ型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的一種病毒載體，對(duì)多種細(xì)胞均具有感染能力，被廣泛應(yīng)用于表達(dá)RNAi的動(dòng)物及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中。該病毒可以將外源性基因穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞的染色體上，從而形成可以傳代且表達(dá)穩(wěn)定的外源性基因子代細(xì)胞，與只能實(shí)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體比較有較大優(yōu)勢(shì)，也較多地被應(yīng)用于骨科相關(guān)研究中[8]。目前，少見(jiàn)學(xué)者對(duì)RSC96雪旺細(xì)胞中應(yīng)用Wnt5a基因慢病毒進(jìn)行感染的細(xì)胞模型進(jìn)行報(bào)道。本研究中，作者構(gòu)建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，用其感染RSC96雪旺細(xì)胞，觀察慢病毒感染情況，檢測(cè)細(xì)胞中Wnt5a mRNA的表達(dá)情況，從而建立相關(guān)細(xì)胞模型，為骨科研究周?chē)窠?jīng)損傷等相關(guān)疾病提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 RSC96雪旺細(xì)胞系(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；293T細(xì)胞(上海細(xì)胞所)；Top10感受態(tài)細(xì)胞(Genechem公司)。

1.1.2主要試劑 人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)-1 p24 Antigen 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 2.0試劑盒(北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)；蘇木素、伊紅(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；Bulge-LoopTMmiRNA 定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) Primer試劑盒(廣州銳博公司)；Trizol(上海普飛公司)；oligo dT(上海生工公司)；嘌呤霉素(Clontech公司、Sigma公司)；NormalRunTM250 bp-Ⅱ DNA Ladder(GeneRay公司)；限制性核酸內(nèi)切酶(NEB公司)；dNTPs、M-MLV試劑盒、RNA酶抑制劑(Promega公司)；SYBR Master Mixture(TaKaRa公司)；GeneRuler 1 kb DNA Ladder、T4 DNA連接酶(Thermo Scientific公司)；Taq Plus DNA聚合酶(Vazmye公司)。

1.1.3主要儀器 普通光學(xué)顯微鏡(上海彼愛(ài)姆光學(xué)儀器制造有限公司)；倒置顯微鏡(上海蔡康光學(xué)儀器有限公司)；數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像儀(上海天能公司)；Blue Pard隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；生物安全柜(上海振樣創(chuàng)空氣凈化設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司、Thermo Scientific公司)；熒光顯微鏡(奧林巴斯公司)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(Applied Biosystems 公司)；反轉(zhuǎn)錄耗材(Axygen公司)；超速離心機(jī)(Beckman Coulter公司、Eppendorf公司)；移液器(Eppendorf公司、吉爾森有限公司)；超細(xì)勻漿機(jī)(FLUKO公司)；細(xì)菌搖床(華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司)；測(cè)序儀(美季生物公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司、SANYO公司)；Celigo(Nexcelom公司)；Real time PCR儀器(Roche公司)；高速離心機(jī)、Nanodrop分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司)。

1.2方法

1.2.1RSC96雪旺細(xì)胞的HE染色 取適宜量的RSC96雪旺細(xì)胞接種于3 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞接近長(zhǎng)滿進(jìn)行染色；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)沖洗5 min，2次；4%多聚甲醛固定60 min；PBS沖洗5 min，2次；蘇木素浸染3 min，水洗；伊紅浸染1 min，水洗；普通光學(xué)顯微鏡下拍照。

1.2.2Wnt5a基因慢病毒載體構(gòu)建 根據(jù)大鼠Wnt5a基因序列設(shè)計(jì)一條Wnt5a-RNAi靶點(diǎn)序列GGG TGA TGC AAA TAG GCA G，其中GC含量為52.63%，起始位點(diǎn)為614。采用吉?jiǎng)P基因GV248載體構(gòu)建Wnt5a基因慢病毒框架-a和Wnt5a基因慢病毒框架-b，見(jiàn)表1。引入AgeI和EcoRI作為酶切位點(diǎn)酶切載體，合成單鏈引物后退火形成雙鏈DNA，后用DNA連接酶將雙鏈DNA與酶切后的載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后挑選陽(yáng)性克隆的菌落進(jìn)行PCR鑒定(見(jiàn)表2)，測(cè)序測(cè)通后抽提合格質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 Wnt5a基因慢病毒框架

表2 陽(yáng)性克隆PCR鑒定引物

1.2.3Wnt5a基因慢病毒包裝 取293T細(xì)胞。離心管中加入含有GV載體質(zhì)粒20 μg、pHelp1.0載體質(zhì)粒15 μg、pHelp2.0載體質(zhì)粒10 μg的各DNA溶液，并與吉?jiǎng)P轉(zhuǎn)染試劑混合調(diào)節(jié)成1 mL，室溫溫育15 min。細(xì)胞與溫育后的液體混勻，37 ℃及CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h；PBS洗滌后用10%胎牛血清(FBS)再次于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d；上清液于4 000 g及4 ℃條件下離心10 min；濾器過(guò)濾后在25 000 r/min及4 ℃條件下離心2 h；棄上清液后用病毒保存液重懸離心沉淀物；10 000 r/min條件下離心5 min分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細(xì)胞 采用適宜量的RSC96雪旺細(xì)胞鋪12孔板，細(xì)胞密度為20%時(shí)用Wnt5a基因慢病毒進(jìn)行感染，重復(fù)感染3次，每次感染3個(gè)復(fù)孔，感染復(fù)數(shù)(MOI)為10，感染條件為Eni.S，感染16 h換液，感染72 h進(jìn)行觀察。

1.2.5感染后RSC96雪旺細(xì)胞中Wnt5a mRNA含量檢測(cè) 以GAPDH為內(nèi)參(表3)，按照各目的基因退火溫度選擇二步法完成擴(kuò)增，通過(guò)熔解曲線判斷擴(kuò)增產(chǎn)物特異性，用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表3 Wnt5a及GAPDH引物

2 結(jié) 果

2.1測(cè)序測(cè)通結(jié)果 根據(jù)測(cè)序可見(jiàn)，ccg gca GGG TGA TGC AAA TAG GCA Gct cga gCT GCC TAT TTG CAT CAC CCt gtt ttt g可測(cè)通。

2.2構(gòu)建及鑒定Wnt5a基因慢病毒載體 陽(yáng)性克隆片段及空載體克隆片段在PCR電泳圖中可以清晰看到，見(jiàn)圖1。

1為陰性對(duì)照(加入ddH2O)；2為陰性對(duì)照(空載自連對(duì)照)；3為Marker(自上而下依次為5 kb、3 kb、2 kb、1.5 kb、1 kb、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp)；4～8為Wnt5a基因慢病毒轉(zhuǎn)化子鑒定。

2.3包裝Wnt5a基因慢病毒并進(jìn)行滴度鑒定 重組的Wnt5a基因慢病毒質(zhì)粒感染293T細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下觀察可以看到感染后的293T細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，表示病毒包裝成功(圖2)。

A～H為明場(chǎng)圖片；I～P為熒光場(chǎng)圖片；A～H及I～P的慢病毒量分別為10、1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6 μL。

2.4RSC96雪旺細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 普通光鏡下觀察，可以看到RSC96雪旺細(xì)胞貼壁后呈梭形、三角形或多角形，細(xì)胞擁擠處呈鋪路石樣外觀(圖3A)；蘇木-伊紅(HE)染色后可以看到，RSC96雪旺細(xì)胞的細(xì)胞核呈較深的粉紅色或紫色，形態(tài)主要為圓形；RSC96雪旺細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈較淺的粉紅色或紫色，形態(tài)與光鏡下觀察類(lèi)似，呈梭形、三角形或多角形(圖3B)。

A為普通光鏡下觀察；B為HE染色后觀察。

2.5Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細(xì)胞 用滴度為109TU/mL的Wnt5a基因慢病毒感染12孔板中生長(zhǎng)密度為20%的RSC96雪旺細(xì)胞，MOI為10，感染后在Celigo細(xì)胞成像分析儀下觀察可以看到，感染后的RSC96雪旺細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，并且可以看到細(xì)胞的狀態(tài)較好，沒(méi)有污染，見(jiàn)圖4。

2.6感染后RSC96雪旺細(xì)胞中Wnt5a基因mRNA表達(dá)情況 分別用Wnt5a基因慢病毒感染3次RSC96雪旺細(xì)胞，RSC96雪旺細(xì)胞中Wnt5a mRNA的表達(dá)量分別為0.211±0.028、0.259±0.027、0.148±0.005，平均表達(dá)量為0.206±0.056。

A為明視野下的RSC96雪旺細(xì)胞；B為熒光視野下的RSC96雪旺細(xì)胞。

3 討 論

Wnt基因最早于1982年的乳腺癌相關(guān)研究中被發(fā)現(xiàn)，被學(xué)者命名為Int1基因。之后，學(xué)者在果蠅的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)了與Int基因高度同源的無(wú)翅基因(Wingless)，后將兩者合稱(chēng)為Wnt基因[9]。由Wnt基因調(diào)控的通路即為Wnt信號(hào)通路，該通路可分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路和非經(jīng)典的Wnt/PCP信號(hào)通路、Wnt/Ca2+信號(hào)通路。其中，Wnt5a主要屬于非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路。Wnt5a基因定位于染色體3p14.2-p21.1區(qū)，人的Wnt5a蛋白與鼠99%同源[10]。Wnt5a基因在細(xì)胞增殖、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)維持、器官發(fā)育中具有重要作用，并可以通過(guò)PTEN、MAPK、NF-κB等信號(hào)通路影響周?chē)窠?jīng)、中樞神經(jīng)損傷修復(fù)或功能重塑[4]。周?chē)窠?jīng)損傷是臨床上的棘手問(wèn)題，尤其是損傷嚴(yán)重及大段缺損條件下，由于周?chē)窠?jīng)損傷及修復(fù)機(jī)制不明確，臨床無(wú)法對(duì)其有效干預(yù)。雪旺細(xì)胞是周?chē)窠?jīng)中非常重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)機(jī)制的研究意義重大。RSC96細(xì)胞是一種能夠多次傳代并表達(dá)雪旺細(xì)胞特性的大鼠來(lái)源細(xì)胞系，可以部分代替原代雪旺細(xì)胞用于周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的研究。

研究證實(shí)，Wnt5a基因可以通過(guò)調(diào)控雪旺細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響周?chē)窠?jīng)的損傷修復(fù)。PAN等[11]發(fā)現(xiàn)，Long non-coding RNA NONMMUG014387可以通過(guò)靶向激活Wnt/PCP通路,促進(jìn)損傷部位周?chē)┩?xì)胞的增殖，這一過(guò)程中Wnt5a蛋白的表達(dá)量明顯升高，其可能影響了雪旺細(xì)胞的去分化和增殖，在周?chē)窠?jīng)再生中起重要作用。SHARMA等[12]認(rèn)為，Wnt5a在自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為雪旺細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮作用，從而在一定程度上提高了周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)元軸突再生的臨床細(xì)胞生物利用度。TIONG等[13]則認(rèn)為，褪黑素可以通過(guò)Wnt信號(hào)通路中的Wnt5a因子，影響糖尿病周?chē)窠?jīng)病變中雪旺細(xì)胞的凋亡。SIMONETTI等[14]通過(guò)動(dòng)物模型證實(shí)，阻斷脊髓背根神經(jīng)元Wnt5a-Ryk/Ror2軸可阻止活動(dòng)依賴性樹(shù)突棘重塑，顯著降低外周損傷和炎癥引起的機(jī)械性超敏反應(yīng)，從側(cè)面證實(shí)了Wnt5a基因在周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)中的作用。

慢病毒是在HIV基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種病毒載體，對(duì)分裂及非分裂的細(xì)胞均具有較強(qiáng)的感染力。本研究團(tuán)隊(duì)早期利用SIRT1基因慢病毒感染了ATDC5軟骨細(xì)胞，以及利用PTEN基因慢病毒感染了RSC96雪旺細(xì)胞[15-16]，并發(fā)現(xiàn)敲減ATDC5細(xì)胞中的SIRT1基因可以引起該細(xì)胞的退變[17]。PARK等[18]通過(guò)VEGF基因慢病毒感染胃癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)感染后可影響胃癌細(xì)胞增殖和腫瘤生長(zhǎng)。MA等[19]發(fā)現(xiàn)通過(guò)IARS2基因慢病毒感染人黑色素瘤A375細(xì)胞，證明該慢病毒可調(diào)控A375細(xì)胞的增殖及凋亡。CUI等[20]發(fā)現(xiàn)CRAD慢病毒感染人肺癌細(xì)胞，可通過(guò)claudin4調(diào)節(jié)人肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡。由此可知，慢病毒感染技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。但是，Wnt5a基因慢病毒感染RSC96雪旺細(xì)胞的相關(guān)模型少有報(bào)道，因此本研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并用其感染了RSC96雪旺細(xì)胞，通過(guò)綠色熒光的表達(dá)觀察到慢病毒感染情況。細(xì)胞中Wnt5a mRNA的平均表達(dá)量為0.206±0.056。

當(dāng)然，本研究也存在一定的不足之處。首先，本研究是一個(gè)描述性、觀察性研究，僅僅介紹了構(gòu)建Wnt5a基因慢病毒的方法及其感染RSC96雪旺細(xì)胞后的mRNA表達(dá)情況，缺乏對(duì)照組，也缺少蛋白層面的檢測(cè)。其次，細(xì)胞模型只能在離體條件下證明Wnt5a基因的作用，仍需要?jiǎng)游锬Ｐ瓦M(jìn)一步證明其與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的一致性，這些也是作者需要繼續(xù)研究的內(nèi)容。

綜上所述，本研究構(gòu)建出大鼠Wnt5a基因慢病毒，并成功利用其感染了RSC96雪旺細(xì)胞，檢測(cè)了其Wnt5a mRNA表達(dá)量。通過(guò)建立相關(guān)細(xì)胞模型，可為周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)的相關(guān)研究提供參考。