陳愛娟，蔣春波，陳 偉，胡 芳

(南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 蘇州 215009)

宮頸癌是當前第二常見的女性癌癥[1],全球每年有超過53萬的新發(fā)病例和超過20萬的死亡病例[2-3]。近年來,宮頸癌在發(fā)展中國家的發(fā)病率正在逐年上升，且患者越來越年輕化[4-5]。對于大多數(shù)早期宮頸癌患者，普遍可以通過自身免疫、根治性手術及放化療治愈，而對于預后仍較差的晚期宮頸癌患者，則將化療方案作為主要治療手段[6]。許多研究者一直在努力尋找更有效的化療藥物來治療宮頸癌。

宮頸癌的發(fā)病因素較多，其中人乳頭瘤病毒(HPV)是主要致病因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，超過70%的病例均與HPV感染相關[7-10]。細胞凋亡是一種由基因網(wǎng)絡控制的細胞自殺形式，也是包括癌癥在內諸多疾病發(fā)病機制中必不可少的過程和關鍵因素。通過藥物促進細胞凋亡來抑制惡性細胞增殖是一種有效的治療手段[11-14]。然而，許多臨床抗癌藥物所引發(fā)的不良反應和耐藥性難以解決。因此，需要尋找并開發(fā)更加安全、有效的抗癌藥物來治療宮頸癌。

火炭母是蓼科植物火炭母的地上部分，主要分布在廣東、廣西、福建、海南等地，火炭母在華南地區(qū)通常作為原材料被用于涼茶制作，但其也是一種傳統(tǒng)中藥[15-16]。火炭母含有酚酸類、黃酮類等化學成分，具有多種生物活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗氧化等[17]。已有的研究表明，植物中的酚酸具有抗腫瘤作用，如四棱草中的有機酸對人肝癌有抑制作用，水懸鉤子對人乳腺腫瘤有抑制作用，而樺樹皮中的白樺酸則對宮頸上皮腫瘤有抑制作用[18]。

研究發(fā)現(xiàn)，火炭母在肝癌和結直腸癌中具有抗腫瘤活性[19]，但少見火炭母抗宮頸腫瘤作用的相關報道。本研究以宮頸上皮鱗狀癌SiHa細胞為研究對象，考察火炭母指標性酚酸柯里拉京對SiHa細胞增殖抑制作用及誘導凋亡機制，以期發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的新物質。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 火炭母(蘇州春暉堂中藥飲片有限公司，批號20200926)，柯里拉京(南京金益佰生物科技有限公司，批號20190311)，Cell Counting Kit-8(CCK8，碧云天生物技術有限公司)，SiHa細胞(ATCC細胞庫)，磷酸緩沖鹽溶液(PBS，美國Giboco公司)，DMEM(美國Giboco公司)，胎牛血清(美國Giboco公司)，青霉素/鏈霉素雙抗(美國Giboco公司)，胰蛋白酶(美國Giboco公司)，細胞凋亡流式試劑盒(碧云天生物技術有限公司)，P53、Bax、Bcl2、半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-9、β-actin(英國Abcam公司)，甲醇、乙醇、乙腈、二氯甲烷、甲酸(美國霍尼韋爾公司)。

1.1.2儀器 Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters 公司)，Triple TOFTM5600質譜儀(美國AB 公司),MS105十萬分之一分析天平(瑞士Mettler Toledo)，Milli-Q3超純水系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)，HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，倒置相差光學顯微鏡及倒置相差熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，DNM9602A酶標分析儀(美國Molecular Devices公司)，超低溫冰箱(青島海爾公司)，移液槍(Eppendorf公司)。

1.2方法

1.2.1火炭母不同溶劑提取物制備 稱取火炭母藥材，打成粗粉，稱取3份，每份 50 g，精密稱定，分別置于圓底燒瓶中，分別加入500 mL水、乙醇、氯仿進行提取，均進行回流提取，提取2次，每次1 h。提取完畢后分別合并2次提取液，經(jīng)真空濃縮后冷凍干燥，分別得到火炭母水提、醇提、氯仿提的干燥提取物，干燥物分別以DMSO溶解，配制成5、10、25、50、100 μg/mL的溶液。

1.2.2柯里拉京溶液制備 稱取柯里拉京對照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，加入DMSO溶解，配制成1 mg/mL的對照品儲備液。以DMSO依次稀釋配制成5、10、25、50、100 μg/mL的溶液，備用。

1.2.3細胞培養(yǎng) 從液氮中取出裝有宮頸上皮鱗狀癌SiHa細胞的凍存管，置于37 ℃的水浴環(huán)境中解凍，待細胞融化完全，將細胞懸液轉移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，小心去除上清液，將細胞轉移至25T培養(yǎng)瓶中。加入含10%胎牛血清青霉素100 U/mL、鏈霉素100 U/mL的DMEM完全培養(yǎng)液，將細胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每天在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)大部分細胞變圓或間隙增大時棄去原有培養(yǎng)液，更換新的DMEM培養(yǎng)液，待細胞長至80%進行傳代培養(yǎng)[20]。

1.2.4CCK8檢測SiHa細胞的增殖抑制 取對數(shù)生長期細胞，采用0.25%的胰酶消化輕吹單細胞懸浮后計數(shù)，以5 000個/孔的細胞濃度接種于96孔板，每孔100 μL，同時設空白孔。過夜待細胞貼壁。在顯微鏡下對細胞進行觀察，發(fā)現(xiàn)細胞完全貼壁生長后，小心吸棄培養(yǎng)基，再向每個孔中加入20 μL不同水平的柯里拉京溶液處理SiHa細胞，水平梯度設置為0(DMSO)、10、25、50、75、100 μmol/L,另設空白對照組。每組平行設置5個復孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72 h。隨后去除原有培養(yǎng)基，隨后每孔加入90 μL完全培養(yǎng)基和10 μL CCK8試劑，37 ℃環(huán)境下孵育1 h。使用酶標儀于450 nm處檢測吸光度(A值)，實驗平行進行3次，計算抑制率。其中，抑制率=(A加藥-A空白)/(A0給藥-A空白)×100%；A加藥為細胞溶液、CCK8溶液和藥物溶液的A值；A0給藥為有細胞溶液、CCK8溶液，但沒有藥物溶液孔的A值；A空白為培養(yǎng)基、CCK8溶液、無細胞空白孔的A值。

1.2.5火炭母水提液液質聯(lián)用色譜分析 對火炭母水提取物進行液質聯(lián)用色譜分析。取火炭母水提取物干粉，DMSO溶解，經(jīng)0.25 μm微孔濾膜過濾，調整進樣濃度為1 mg/mL。采用0.2%(v/v)甲酸水(A)-乙腈(B)為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1，流速為1.0 mL/min，檢測波長為365 nm。進樣量為2 μL，柱溫為30 ℃。質譜條件：電噴霧離子源(ESI)；正離子模式檢測；質量掃描范圍m/z為50～2 000；噴霧電壓為5 500 V；解簇電壓為100 V；去簇電壓為40 V；裂解電壓為20 V；離子源溫度為600 ℃；霧化器為60 psi(1 psi=6.895 kPa)；輔助加熱器為60 psi；氣簾氣為40 psi。

表1 梯度洗脫程序

2 結 果

2.1火炭母對SiHa細胞增殖的抑制作用 火炭母水提液對SiHa細胞增殖的抑制作用較強，見圖1。

圖1 火炭母不同溶劑提取物對SiHa細胞增殖的抑制作用

2.2火炭母水提液液質聯(lián)用色譜分析 火炭母不同溶劑提取物經(jīng)液質聯(lián)用分析發(fā)現(xiàn)，三氯甲烷中的提取成分最少；其次為乙醇，乙醇提取物色譜峰與水提成分重疊，且水提液中色譜峰的豐度遠高于乙醇提取物。對火炭母的水提液進行液質分析，經(jīng)數(shù)據(jù)庫與文獻檢索發(fā)現(xiàn)，火炭母水提液中解析出了12種成分，其中主要為酚酸類物質(訶子酸、檸檬酸、沒食子酸、綠原酸、短葉蘇木酚酸、柯里拉京、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、鞣花酸、二氫楊梅素、槲皮素、Enyssoside、3,3-二甲基鞣花酸)，見圖2、表2。

表2 火炭母水提液解析成分表

2.3柯里拉京對SiHa細胞增殖的抑制作用 不同濃度的柯里拉京均對SiHa細胞增殖具有抑制作用(圖3)，隨著柯里拉京濃度與作用時間的增加，其對SiHa細胞增殖的抑制作用加強，呈量效依賴關系?？吕锢iHa細胞增殖的抑制作用在72 h時最強，24 h的IC50為(42.50±0.38)μmol/L，48 h的IC50為(33.20±0.21)μmol/L，72 h的IC50為(26.30±0.15)μmol/L。因此，可選擇48 h作為給藥孵育時間并用于后續(xù)的凋亡研究。

圖3 柯里拉京對SiHa細胞的增殖抑制效應

2.4柯里拉京誘導SiHa細胞凋亡結果 流式細胞實驗結果顯示，不同濃度的柯里拉京(0、25、50、75 μmol/L)作用于SiHa細胞48 h后，SiHa細胞凋亡率顯著增加，75 μmol/L的柯里拉京誘導SiHa細胞凋亡率增加到55.73%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與柯里拉京0 μmol/L組比較，SiHa細胞凋亡率表現(xiàn)出劑量依賴性，隨濃度上升而顯著升高，呈現(xiàn)時效與量效關系。柯里拉京誘導SiHa細胞凋亡主要發(fā)生在G2阻滯期，見圖4。

圖4 流式細胞檢測柯里拉京誘導SiHa凋亡

3 討 論

據(jù)估計，30%～40%的癌癥可以通過飲食和生活方式預防。目前，臨床上使用的某些抗癌藥物，如紫杉醇和喜樹堿，均是從天然產(chǎn)物中提取。由于天然產(chǎn)物的多樣性和獨特的作用機制，尋找具有抗癌活性的天然產(chǎn)物成為一個值得探索的領域。植物酚酸廣泛存在于中草藥中，是一類具有潛在抗腫瘤活性的化合物，例如茶葉中的茶多酚已被多次證實具有抗腫瘤效應。

本研究發(fā)現(xiàn)，火炭母水提液對宮頸癌細胞的體外抑制作用最佳。對其進行液質色譜分析，發(fā)現(xiàn)火炭母水提液中主要為酚酸性物質，柯里拉京是多羥基酚酸的代表性成分。本研究選取了火炭母中的柯里拉京為研究對象，發(fā)現(xiàn)其對人宮頸上皮鱗狀癌SiHa細胞具有潛在的抗增殖活性。通過流式細胞檢測發(fā)現(xiàn)，柯里拉京可以將SiHa阻滯在G2期，從而抑制SiHa細胞增殖?？吕锢┑目鼓[瘤活性可能通過2個方面來實現(xiàn)：(1)抑制細胞無序增殖的關鍵蛋白(例如P21)；(2)重新激活細胞正常凋亡通路關鍵蛋白(例如P53)，重新引導宮頸癌細胞凋亡，但具體的分子機制有待進一步研究確定。

火炭母中富含酚酸類物質，其中多羥基酚酸具有類似的骨架結構。但是作者未研究柯里拉京對正常宮頸細胞的細胞毒性，后續(xù)還需要明確柯里拉京是通過何種通路誘導SiHa凋亡?；鹛磕杆嵋褐械目吕锢╇m然對SiHa細胞有較好的體外抑制作用，然而柯里拉京是否可以聯(lián)合應用于手術、放化療中，在臨床輔助治療宮頸癌，還需要進一步的離體、在體試驗和臨床試驗。此外，仍需要分析火炭母中其他類似結構的酚酸，以及火炭母中與柯里拉京骨架結構類似的化合物是否具有相應的活性。