王樂銘，王瑜瑞，曾子軒，饒國順，吳正姣，靳緯坤，王冬英

(廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004)

大片形吸蟲(Fasciolagigantica，F(xiàn)g)是片形吸蟲病(fascioliasis)的病原之一，屬于食源性人獸共患寄生蟲。主要宿主是地處熱帶及亞熱帶地區(qū)的奶牛、水牛、山羊等家畜[1-2]。據(jù)估計，全世界畜牧業(yè)每年因片形吸蟲病造成的損失超過32億美元[3]。另外在全球范圍內(nèi)，已有至少240萬人感染片形吸蟲病，并同時威脅著1.8億人的健康安全，被世界衛(wèi)生組織認定為最受忽視的熱帶病之一[4-5]。針對該疾病的診斷主要包括臨床診斷、分子生物學診斷、免疫學診斷，其中免疫學抗原診斷因具備靈敏性高、特異性強、低成本等優(yōu)點被廣泛應用于該疾病檢測的開發(fā)研究中[5-6]。Abdolahi等[7]針對肝片形吸蟲排泄-分泌產(chǎn)物(ESP)抗原制備特異性單克隆抗體和多克隆抗體，并建立了針對機體糞便中片形吸蟲抗原的ELISA檢測方法。經(jīng)驗證，該方法陽性樣本檢出率為90%，特異性達89.7%，具備應用于臨床片形吸蟲病診斷要求。Anuracpreeda等[8]針對大片形吸蟲脂肪酸結合蛋白構建了特異性單克隆抗體及ELISA抗原檢測方法，在符合基礎診斷要求的同時，在早期診斷方面也呈現(xiàn)出較好的潛力。

組織蛋白酶L1(cathepsin L1,Cat L1) 是一種半胱氨酸蛋白酶，在許多寄生蟲體內(nèi)均有表達，主要由幼蟲和成蟲的消化道真皮上皮細胞分泌[9]，在蟲體寄生定植等過程中起到重要的作用[10-13]。此外，Cat L1也被證明可抑制機體的Th1型免疫反應，從而提高外界病原感染風險[14-15]。王曉旭[16]成功對肝片形吸蟲Cat L1進行了原核重組表達，獲得了rFhCat L1并建立了間接ELISA診斷方法，經(jīng)檢測該方法特異性為97.3%，敏感性為94.0%，最早可以檢出人工感染肝片形吸蟲28 d后的綿羊血清。證明Cat L1在片形吸蟲病診斷方面是具備相關潛力的。

近年來關于片形吸蟲免疫與防治的研究一直在不斷深化，但是現(xiàn)有的商業(yè)化診斷試劑盒存在成本較高、功能不夠全面的缺點，且國內(nèi)尚未有商品化試劑盒生產(chǎn)。本研究以前期所制備的rFgCat L1原核表達蛋白及抗rFgCat L1多克隆抗體[17]為基礎，制備抗rFgCat L1單克隆抗體并構建大片形吸蟲病雙抗體夾心ELISA檢測方法，以期為開發(fā)大片形吸蟲病快速抗原檢測診斷試劑盒提供重要的理論依據(jù)及物質(zhì)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠購自湖南省長沙市天勤生物技術有限公司；SP2/0細胞株、rFgCat L1蛋白、抗rFgCat L1多克隆抗體：廣西大學動物科技學院動物寄生蟲疾病與免疫學實驗室制備，液氮中保存；試驗所用血清樣本均采自廣西地區(qū)某養(yǎng)殖廠。

細胞融合試劑盒購自GENMED公司；DMEM基礎培養(yǎng)基、胎牛血清、HAT均購自Biological Industry公司；青-鏈霉素混合液(雙抗)購自Solarbio公司；山羊抗鼠IgG抗體亞型鑒定試劑盒購自Southern Biotech公司；特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)酶標二抗均購自上海碧云天生物技術有限公司公司；Protein L 抗體純化試劑盒購自金斯瑞生物科技有限公司。倒置顯微鏡(AE31)購自Nikon公司；超凈工作臺(SW-CJ-2FD)購自蘇凈設備有限公司；CO2培養(yǎng)箱(3111)購自Forma Scientific公司；電熱恒溫水箱HH-S6型購自北京長風有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)購自上海躍進醫(yī)療器械公司；-80 ℃超低溫冰箱(DW-HL778)購自Forma公司；細胞計數(shù)儀(TC20)購自Bio-Rad公司；液氮罐(XK02-201)購自四川亞西橡塑機器有限公司。

1.2 小鼠免疫

調(diào)整rFgCat L1蛋白濃度為1 mg/mL，分4次對5只BALB/c小鼠進行免疫。前3次免疫采用50 μL蛋白液與弗氏佐劑等體積混合，皮下多點注射免疫。第3次免疫結束7 d后，尾靜脈采小鼠血清。通過間接ELISA法測定血清中抗體效價，未免疫小鼠血清作為陰性對照，對抗體反應最高的小鼠采用100 μL抗原蛋白腹腔注射進行沖擊免疫。

1.3 雜交瘤細胞株構建

提前24 h制備飼養(yǎng)層細胞，用HAT培養(yǎng)基重懸，按104/孔平鋪在96孔板中；在超凈臺內(nèi)分離小鼠脾細胞，采用細胞篩研磨并用含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基重懸計數(shù)。將SP2/0細胞及小鼠脾細胞按1∶5的比例(SP2/0：2×106個，小鼠脾細胞：1×107個)加入至50 mL離心管中，300×g離心10 min，洗滌3次；加入37 ℃預熱細胞融合劑，常溫靜置1 min，加入終止液，300×g離心10 min，洗滌3次；吸棄上清，利用2% HAT培養(yǎng)基重懸細胞，加至預先制備含飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細胞融合后培養(yǎng)24 h后，觀察細胞狀態(tài)；待細胞團達肉眼可見后取上清，采用間接ELISA法進行鑒定，SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照；對陽性孔進行放大培養(yǎng)，并對強陽性孔采用有限稀釋法進行亞克隆，期間及時凍存細胞；亞克隆3次以后，選取陽性值較高且穩(wěn)定的雜交瘤細胞株為最終的陽性雜交瘤細胞株。

1.4 單克隆抗體制備及鑒定

1.4.1 單克隆抗體制備 準備6～8周齡BALB/c小鼠20只，注射前提前1周腹腔注射滅菌液體石蠟，500 μL/只；將所制備陽性雜交瘤細胞株按1×106/只注入小鼠腹腔；14 d后，待小鼠腹部明顯膨大，精神狀態(tài)不佳時開始逐步抽取腹水；用Protein L 抗體純化試劑盒對小鼠腹水中抗rFgCat L1單克隆抗體進行純化，并進行SDS-PAGE電泳。

1.4.2 單克隆抗體效價鑒定 將雜交瘤細胞株上清(按1∶2、1∶22、1∶23至1∶212稀釋)及小鼠腹水(按1∶10、1∶102、1∶103至1∶108稀釋)通過間接ELISA法檢測抗體效價。

1.4.3 單克隆抗體亞型Western blotting鑒定 利用Goat Anti-Mouse Ig抗體亞型鑒定試劑盒鑒定抗體亞型。具體步驟：PBS稀釋rFgCat L1至濃度為2 μg/mL，每孔100 μL加入ELISA酶標板中，4 ℃孵育12 h；PBST洗滌3次，加入1% BSA，100 μL/孔，室溫下放置1 h，阻斷自由結合位點；PBST洗滌3次，每孔加入100 μL雜交瘤細胞上清，室溫下輕搖孵育1 h或4 ℃過夜；PBST洗滌3次，將檢測抗體，用1% BSA按1∶250～1∶500稀釋，100 μL/孔，輕搖孵育1 h；PBST洗滌5次，加入顯色液，室溫靜置20 min；酶標儀讀取各孔D450 nm值。

1.4.4 單克隆抗體特異性鑒定 采用常規(guī)Western blotting法驗證抗rFgCat L1單克隆抗體特異性：將FgESP、前后盤吸蟲抗原、伊式錐蟲抗原、弓形蟲抗原進行SDS-PAGE電泳；一抗為抗rFgCat L1雜交瘤細胞上清，二抗為兔抗鼠-IgG酶標二抗；通過Image Lab軟件查看結果。

1.4.5 單克隆抗體識別抗原表位鑒定 參考萬文徽[18]方法進行疊加ELISA試驗，對7G6及5D5抗原識別表位進行鑒定。具體方案為：按2 μg/mL 濃度稀釋天然FgESP包被酶標板；分別孵育2株單克隆抗體，所測得D450 nm值記為A1及A2；后將2株抗體等比例混合后孵育，所測D450 nm值記為A12；根據(jù)公式：AI(%)=(A12-A1)/A2×100%；AI(%)>30%,證明2株抗體具有相加作用，識別不同抗原表位。AI(%)<30%，證明2株抗體呈競爭作用，識別相同表位。

1.5 雙抗體夾心ELISA方法的構建

1.5.1 單抗包被濃度及抗rFgCat L1多克隆抗體稀釋度篩選 采用包被緩沖液稀釋單克隆抗體，分別用 0.4、2、10和50 μg/mL共4個濃度的單抗包被96孔酶標板，包被96孔板；37 ℃孵育2.5 h，4 ℃過夜；采用PBST洗滌3次，加入封閉液，37 ℃孵育2 h；PBST洗滌3次，加入陰/陽性對照，100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌4次，抗rFgCat L1多克隆抗體[17]按1.56、3.12、6.25、12.5和25 μg/mL稀釋，棋盤法加樣，37 ℃孵育1 h；加入顯色液37 ℃孵育25 min；加入終止液，50 μL/孔，用酶標儀測定D450 nm值；計算陰性/陽性(P/N)值，最大值所對應條件為最佳檢測條件。

1.5.2 酶標二抗最佳稀釋度篩選 步驟同1.5.1，將山羊抗兔IgG(H+L)酶標二抗按1∶125、1∶250、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000和1∶8 000倍比稀釋，計算P/N值，最大值所對應條件為最佳檢測條件。

1.5.3 最適封閉液篩選 步驟同1.5.1，用10%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、5% BSA和1%明膠分別進行封閉，計算P/N值，最大值所對應的為最佳封閉液。

1.5.4 顯色時間篩選 步驟同1.5.1，加入顯色液，37 ℃孵育10、15、20、25、30和60 min。 計算P/N最大值所對應時間為最佳顯色時間。

1.6 雙抗體夾心ELISA方法的驗證

1.6.1 敏感性 步驟同1.5.1，將rFgCat L1從10 μg/mL倍比稀釋至0.078 μg/mL作陽性樣品，PBS作為陰性對照。通過所構建雙抗體夾心ELISA法檢測各濃度下的D450 nm值并計算P/N值(P/N>2.1即為陽性)，得到最低抗原檢測濃度，驗證該方法敏感性。

1.6.2 特異性 步驟同1.5.1，利用所構建雙抗體夾心ELISA法對rFgCat L1、FgESP抗原、前后盤吸蟲ESP抗原、伊氏錐蟲體表蛋白抗原、弓形蟲蟲體抗原進行檢測，并以PBS為陰性對照，P/N>2.1判定為陽性，驗證方法特異性。

1.6.4 臨床樣本驗證 步驟方法同1.5.1，利用所構建雙抗體夾心ELISA法檢測本實驗室保存的47份山羊大片形吸蟲病陽性血清及47份奶牛大片形吸蟲病陽性血清的陽性符合率。

2 結 果

2.1 小鼠免疫結果

終免后小鼠狀態(tài)良好，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。三免后小鼠血清間接ELISA法檢測結果顯示，4只小鼠血清抗體效價均>104，達到細胞融合要求。 四免后剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠脾臟組織較未免疫小鼠有明顯增大。

2.2 陽性雜交瘤細胞株構建

雜交瘤細胞株培養(yǎng)25 d時肉眼即可觀察到細胞團，細胞長勢良好，融合細胞孔達116個(總孔數(shù)為384個)；間接ELISA法檢測細胞上清結果顯示：共有8株雜交瘤細胞上清呈陽性反應，其中5D5及7G6呈現(xiàn)強陽性反應(表1)；亞克隆培養(yǎng)結果顯示，5D5及7G6 2株細胞上清陽性反應穩(wěn)定，可進行擴大培養(yǎng)并凍存(表2)；5D5及7G6經(jīng)傳代培養(yǎng)和凍存后，細胞上清檢測陽性值趨于穩(wěn)定(表3)，可用于大量制備抗體。

表1 rFgCat L1陽性克隆篩選結果

表2 連續(xù)亞克隆后雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性(D450 nm值)

表3 連續(xù)傳代后雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定性(D450 nm值)

2.3 單克隆抗體制備及鑒定

2.3.1 抗體制備結果 小鼠腹水純化后，可見除抗體外無明顯雜蛋白，抗體重鏈在50 ku左右，輕鏈約為20 ku(圖1)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1，純化后5D5；2，純化后7G6

2.3.2 單克隆抗體效價測定結果 間接ELISA法檢測結果顯示，5D5和7G6 2株細胞上清抗體效價分別達到29和210；5D5小鼠腹水抗體效價達107，7G6小鼠腹水抗體效價可達108(表4)。

表4 間接ELISA測定抗體敏感性結果

2.3.3 抗體亞型鑒定結果 單克隆抗體鑒定試劑盒鑒定結果顯示，5D5和7G6 2株細胞制備的抗體的亞型均為IgG1型，輕鏈均為Kappa型(圖2)。

圖2 單克隆抗體亞型鑒定

2.3.4 單克隆抗體特異性檢測結果 Western blotting檢測結果顯示，2株單抗均可與天然FgESP抗原反應，而不與前后盤吸蟲抗原、伊式錐蟲抗原、弓形蟲抗原反應(圖3)。

1,大片吸蟲分泌-排泄產(chǎn)物；2，前后盤吸蟲抗原；3，伊氏錐蟲抗原；4，弓形蟲抗原

2.3.5 單克隆抗體識別抗原表位鑒定結果 間接ELISA法檢測5D5及7G6的抗原識別表位結果顯示，A12<30%，5D5和7G6識別相同表位。根據(jù)結果2.3.2可知，7G6抗體效價高于5D5，因此確定用7G6作為捕獲抗體、抗rFgCat L1多克隆抗體作為檢測抗體進行大片形吸蟲病雙抗體夾心ELISA法的構建。

2.4 雙抗體夾心ELISA方法構建

2.4.1 7G6包被濃度及抗rFgCat L1多克隆抗體稀釋度的篩選結果 棋盤法篩選7G6抗體包被濃度及抗rFgCat L1多克隆抗體檢測濃度結果顯示，當7G6包被濃度在2 μg/mL、抗rFgCat L1多克隆抗體濃度為25 μg/mL時，所得結果P/N值最高，且此時陰性對照值<0.1，有利于更好地區(qū)分陰陽性(表5)。因此，以此結果為后續(xù)檢測條件。

表5 7G6和抗rFgCat L1多克隆抗體最佳稀釋度

2.4.2 酶標二抗稀釋度篩選結果 通過倍比稀釋山羊抗兔IgG(H+L)酶標二抗，結果顯示，當稀釋度為1∶4 000時，P/N值最高(表6)。因此，選擇1∶4 000為最佳稀釋度。

表6 酶標二抗稀釋度選擇

2.4.3 封閉液篩選結果 經(jīng)對比5% BSA、5%脫脂奶粉、10%脫脂奶粉及1%明膠的包被效果，結果顯示5%脫脂奶粉作為封閉液時P/N值最高，此條件下本底值較低，更易區(qū)分陰陽性，所以選擇5%脫脂奶粉為最終封閉液(表7)。

表7 最佳封閉液選擇

2.4.4 顯色時間篩選結果 孵育不同時間的結果表明，在孵育20 min時，D450 nm值開始趨于穩(wěn)定，且25 min時P/N值達到最高(圖4)。因此，確定最終的底物顯色時間為25 min。

圖4 最佳顯色時間測定

2.5 雙抗體夾心ELISA方法的驗證

2.5.1 敏感性檢測結果 通過梯度稀釋rFgCat L1，并以 PBS 做陰性對照驗證雙抗體夾心ELISA方法的敏感性， 結果顯示： 雙抗體夾心ELISA方法所能測的最低抗原濃度為0.625 μg/mL(表8)。

表8 敏感性檢測結果

2.5.2 特異性檢測結果 驗證結果顯示，所構建雙抗體夾心ELISA方法檢測FgESP、前后盤吸蟲抗原、伊氏錐蟲抗原以及弓形蟲抗原的P/N值分別為4.27、0.85、1.33和1.26，證明該方法具備較好的特異性。

2.5.4 臨床樣本驗證結果 通過所構建雙抗體夾心ELISA方法對實驗室所保留的47份山羊及47份奶牛感染性血清樣本進行抗原檢測，結果顯示山羊血清共檢出抗原陽性37份，抗原檢出率為78.7%；奶牛血清共檢出抗原陽性34份，抗原檢出率率為72.3%(表9)。

3 討 論

免疫學抗原診斷的關鍵在于需要制備具備高特異性及敏感性的單克隆抗體。單克隆抗體技術發(fā)明于20世紀70年代，由于其針對免疫疾病方面檢測的優(yōu)越性，已經(jīng)廣泛應用于疾病診斷及治療等多個領域[19]。為篩選優(yōu)質(zhì)抗體，本試驗在亞克隆階段采用傳統(tǒng)有限稀釋法培養(yǎng)。任瑞敏等[20]利用半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞。半固體培養(yǎng)基優(yōu)勢在于同一個孔中的不同細胞株不易混合，在亞克隆階段，可借助顯微鏡從細胞團中挑出單個細胞，減少了傳統(tǒng)細胞稀釋的工作量，提高篩查效率。但同時增加了細胞污染的幾率。其次，在細胞培養(yǎng)過程中，由于固體培養(yǎng)基所含水分較少，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中加速了液體流失的速度，若不能每天及時補充水分，細胞可因缺水而死亡[21]。而傳統(tǒng)的有限稀釋法在亞克隆階段雖然需要更大的工作量，但是對于細胞的培養(yǎng)更加穩(wěn)妥及安全。多項報道[22-24]表明，利用有限稀釋法可成功獲得穩(wěn)定的陽性雜交瘤細胞株。本試驗利用該方法成功篩選出具備高效價的強陽性株5D5和7G6。經(jīng)驗證，2株抗體效價可達29和210，對于后續(xù)所構建方法的敏感性是具備優(yōu)勢的。李雪等[25]利用抗FgESP復合抗原單克隆抗體7D1、7D2構建了大片形吸蟲雙抗體夾心ELISA方法，結果顯示該方法可特異性識別大片形吸蟲抗原，不與胰闊盤吸蟲抗原、前后盤吸蟲抗原、伊氏錐蟲抗原及弓形蟲抗原反應。而本實驗所構建單克隆抗體針對的是單一蛋白，理論上更具特異性。經(jīng)驗證2株抗體均可特異性結合大片形吸蟲ESP抗原，具備作為檢測抗體的潛力。但在對抗體的識別表位鑒定試驗中發(fā)現(xiàn)，2株單克隆抗體本身存在識別抗原位點方面存在競爭關系，同時為了使所構建方法檢測靈敏度更高，本試驗未選擇雙單克隆抗體夾心，而是選擇實驗室前期所構建的抗FgCat L1特異性多克隆抗體與單克隆抗體結合的方式，使得該方法可同時兼具敏感性及特異性的優(yōu)點。李超等[26]利用多克隆抗體及單克隆抗體結合的方法，構建雙抗夾心ELISA法，結果顯示該方法對檢測牛γ-干擾素呈現(xiàn)出理想的效果。

利用7G6和rFgCat L1多克隆抗體所構建的雙抗體ELISA檢測方法，對47份山羊及47份奶牛大片吸吸蟲感染性樣本進行檢測發(fā)現(xiàn)，抗原檢出率達78.7%及72.3%，與間接ELISA法檢測結果有所出入，原因可能是通過間接ELISA法檢測抗體判定疾病的發(fā)生不易區(qū)分既往感染及當癥感染，易出現(xiàn)假陽性，而本方法檢測的目的分子為循環(huán)抗原，對于疾病的確診及病程的判斷更具敏感性[25]。后續(xù)試驗除利用血清樣品外，可同時收集機體糞便、乳液和唾液等臨床樣本，進一步驗證其檢測效果，為商業(yè)化檢測試劑盒的研制提供新的思路及依據(jù)。

4 結 論

本研究成功制備抗rFgCat L1特異性單克隆抗體5D5和7G6，并結合rFgCat L1多克隆抗體構建了大片形吸蟲病雙抗體夾心ELISA檢測方法。經(jīng)驗證，該方法抗原最低識別濃度為0.625 μg/mL，可特異性識別FgESP抗原；另外，該方法對山羊及奶牛大片形吸蟲病陽性血清的抗原檢出率為78.7%及72.3%，說明其具備構建大片形吸蟲病商業(yè)化試劑盒的潛力。