張配穎，宋鵬琰，周 營，陳曉勇，周榮艷

(河北農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，保定 071001)

卵巢是雌性動物的主要生殖器官，卵巢卵泡顆粒細胞在維持生殖功能上起著極其重要的作用。從原始卵泡發(fā)育到卵泡成熟排卵后黃體的形成，顆粒細胞作為主要的功能細胞，其增殖與分化直接影響著卵泡的生長發(fā)育、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌等卵巢功能活動[1]。目前，對卵泡顆粒細胞功能調(diào)控機制的研究主要采用體外細胞培養(yǎng)的方法，但長期體外培養(yǎng)會造成細胞形態(tài)的改變和基因的差異表達[2]。因此，顆粒細胞體外培養(yǎng)對于探索卵巢功能活動具有重要意義。

細胞體外培養(yǎng)時的分化與增殖異常、細胞周期改變誘導的衰老、DNA片段化引起的凋亡等均受到多種因素影響，如氨基酸組成[3]、血清含量[4]、葡萄糖濃度[5]等，其中葡萄糖是機體最主要的能量物質(zhì)，在新陳代謝中發(fā)揮著重要的作用。葡萄糖水平的失衡會引發(fā)相關(guān)的應激，進而可導致細胞衰老[6]。在高糖環(huán)境下，細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，ROS可加速端?？s短、引起DNA損傷并導致衰老相關(guān)的細胞生長停滯[7-8]。在成纖維細胞[9]、內(nèi)皮細胞[10]、間充質(zhì)干細胞[11]等上的研究已證實高濃度葡萄糖可誘導細胞衰老。目前，關(guān)于體外培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細胞的研究主要集中在細胞凋亡和激素分泌方面[3,12]，細胞培養(yǎng)條件對結(jié)果有直接影響。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，采用DMEM/F12培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為17.5 mmol/L)體外培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細胞周期及衰老相關(guān)分泌表型相關(guān)基因(如細胞周期素D1(Cyclin D1，CCND1)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9，MMP9))等均發(fā)生了改變(未發(fā)表)，推測培養(yǎng)基中高濃度葡萄糖對細胞周期產(chǎn)生了影響。 目前，普遍使用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)綿羊卵泡顆粒細胞，而綿羊體內(nèi)血糖生理濃度為1.5～4 mmol/L[13]，關(guān)于培養(yǎng)基中葡萄糖濃度對細胞影響的研究鮮見報道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖可影響細胞周期/衰老相關(guān)基因的表達，誘導細胞衰老并抑制顆粒細胞的增殖(未發(fā)表)。因此，為了明確葡萄糖誘導綿羊卵泡顆粒細胞衰老的機制，本試驗通過RNA測序(RNA-Seq)技術(shù)，對2個葡萄糖濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)的綿羊卵泡顆粒細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，選取細胞衰老關(guān)鍵基因錨定蛋白重復域蛋白1(ankyrin repeat domain-containing protein 1,ANKRD1)[14]、細胞衰老相關(guān)分泌表型蛋白白細胞介素8(interleukin-8,IL-8)[15]、具有緩解細胞衰老功能的催產(chǎn)素(oxytocin,OXT)[16]、晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)[17]等4個差異表達基因用實時熒光定量PCR進行驗證，旨在篩選差異表達基因和信號通路，以期為細胞衰老相關(guān)功能基因的篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F12無糖培養(yǎng)基(PM150323)、D-葡萄糖溶液(PB180418)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰酶(12604013)均購自Gibco公司；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(C0602)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Forget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix購自BIOTIUM公司。

1.2 顆粒細胞的分離培養(yǎng)

綿羊卵巢采自保定振宏食品加工有限公司。將采集的卵巢用75%酒精消毒后，用預熱生理鹽水清洗，剪去多余脂肪及系膜。選擇直徑為3～7 mm的卵泡將全部卵泡液吸至離心管中，吹打后靜置5 min，取上清液，1 500 r/min離心10 min，棄上清，分別用含17.5(H組)和2 mmol/L(L組)葡萄糖的培養(yǎng)基(DMEM/F12無糖培養(yǎng)基+10% FBS+1%雙抗+50 μg/mL丙酮酸鈉)吹打混勻后接種于細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 β-半乳糖苷酶染色

將L和H組顆粒細胞以5×104/孔的密度接種于12孔板，每組設(shè)置3個重復。孵育72 h后分別進行β-半乳糖苷酶染色。加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min后加入染色液。37 ℃孵育過夜，細胞藍染表示衰老細胞，在普通光學顯微鏡下觀察并計算藍染細胞陽性率。

細胞陽性率(%)=藍染細胞數(shù)/全部細胞數(shù)×100%

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序分析

將細胞收集于無菌EP管中，低溫保存運輸，由組學生物(北京)有限公司進行樣品檢測、文庫構(gòu)建及其質(zhì)量控制和上機測序。用NanoDrop微量分光光度計檢測RNA的純度、濃度、核酸吸收峰，用Agilent 2100生物分析儀精確檢測RNA的完整性。樣品檢測合格后，進行mRNA富集，然后以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后進行PCR富集得到最終的cDNA文庫。文庫構(gòu)建完成后，對文庫質(zhì)量進行檢測，檢測結(jié)果達到要求后進行上機測序。對測序得到的原始序列進行過濾，去除含有接頭的序列和低質(zhì)量的序列，得到高質(zhì)量的純凈序列用于后續(xù)分析。

1.5 差異表達基因分析

對不同處理組進行重復相關(guān)性評估，用DESeq進行樣品組間的差異表達分析。在差異表達基因檢測過程中，將差異倍數(shù)|FoldChange|≥1.5且錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.01作為篩選標準。通過KOBAS(2.0)從生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)及細胞成分(cellular component，CC)等方面進行差異表達基因的GO功能富集分析，通過KOBAS(2.0)對差異表達基因進行KEGG信號通路富集分析，P<0.05被認為是顯著富集。

1.6 實時熒光定量PCR驗證

將L和H組顆粒細胞以2×105/孔的密度接種于6孔板中，每組設(shè)置3個重復。孵育72 h后用Trizol法提取細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank中ANKRD1、IL-8、OXT、NOX4基因序列用Primer-Blast設(shè)計特異性擴增引物，引物具體信息見表1。引物均由廣州銳博生物科技有限公司合成。以綿羊GAPDH基因為內(nèi)參，進行實時熒光定量PCR反應。PCR反應體系20 μL：Forget-Me-Not EvaGreen qPCR Master Mix 10 μL,ROX 3 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 4.2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。每個樣品3次重復，檢測結(jié)果用2-△△Ct法進行統(tǒng)計分析。

表1 引物信息

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件的獨立樣本t檢驗進行組間差異比較，用GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖，結(jié)果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖對顆粒細胞衰老的影響

孵育72 h后，β-半乳糖苷酶染色結(jié)果表明，H組細胞的體積變大，細胞呈現(xiàn)大量陽性藍染；細胞陽性率統(tǒng)計結(jié)果表明，H組細胞陽性率極顯著高于L組(P<0.01)(圖1)。

①A，β-半乳糖苷酶染色結(jié)果(100×)；B，細胞陽性率。②*，差異顯著(P<0.05);**，差異極顯著(P<0.01);無標記，差異不顯著(P>0.05)。圖5同

2.2 差異表達基因轉(zhuǎn)錄組測序分析

轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果表明，不同濃度葡萄糖處理細胞72 h后，差異表達基因共401個，其中上調(diào)基因有153個，下調(diào)基因有248個(圖2)。與細胞周期相關(guān)的基因有2個(SENP5、GNAI1基因)表達上調(diào)， 4個(ARL2、RGS2、 ENSOARG00000001444、ENSOARG00000014182基因)表達下調(diào)；與高糖誘導的細胞異常相關(guān)基因有9個，其中上調(diào)基因有6個(NOX4、PIK3CB、TGFB2、EDN1、IL-8、F3基因)，下調(diào)基因有3個(COL4A2、HRAS、SELE基因)(表2)。

圖2 差異表達基因火山圖(A)和聚類熱圖(B)

表2 與高糖誘導細胞異常和細胞周期相關(guān)的差異表達基因

2.3 差異表達基因GO功能富集分析

對處理后綿羊卵泡顆粒細胞的差異表達基因進行GO功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因富集在生物過程、分子功能和細胞成分三大類，其中生物過程占單基因注釋的大多數(shù)。生物過程中差異表達基因主要富集在細胞過程、生物調(diào)節(jié)、代謝過程、繁殖、多細胞生物過程、細胞運動、細胞組成、組織和生物發(fā)生等；細胞成分中差異表達基因主要富集在胞外區(qū)、膜、突觸、細胞器及超分子復合體等；分子功能中差異表達基因主要富集在催化活性、整合、轉(zhuǎn)運活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、結(jié)構(gòu)分子活性及分子傳感器活性等(圖3)。

圖3 差異表達基因的GO功能富集注釋

2.4 差異表達基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析結(jié)果表明，共有901個差異基因富集在245個信號通路中，主要的信號通路有AGE-RAGE信號通路、胰島素信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號通路、雌激素信號通路等(圖4)，其中AEG-RAGE信號通路與糖尿病并發(fā)癥相關(guān)。

圖4 差異基因的KEGG信號通路富集注釋(前20)

2.5 差異表達基因?qū)崟r熒光定量PCR驗證結(jié)果

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與L組相比，H組IL-8基因表達水平極顯著上調(diào)(P<0.01)，ANKRD1基因表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，OXT基因表達水平極顯著下調(diào)(P<0.01)，NOX4基因表達量呈上升趨勢，但差異不顯著(P>0.05)(圖5)。實時熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。

圖5 實時熒光定量PCR驗證RNA-Seq結(jié)果

3 討 論

高濃度葡萄糖可誘導細胞衰老，細胞衰老主要表現(xiàn)為細胞代謝、分泌細胞因子、表觀遺傳調(diào)控和蛋白表達的改變[18]，同時會出現(xiàn)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增強以及衰老相關(guān)染色質(zhì)聚集等[19]。本研究結(jié)果顯示，高糖組細胞β-半乳糖苷酶染色陽性率顯著上升，李炳旻等[20]和Sonia等[21]研究表明高糖會誘導皮膚成纖維細胞和內(nèi)皮細胞衰老。以上研究說明高濃度葡萄糖可促進顆粒細胞、皮膚成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等體細胞衰老。

AEGs是治療糖尿病的重要物質(zhì)，其可通過促進活性氧生成和氧化應激，影響細胞的衰老[22]，其中AEG-RAGE信號通路是AEGs發(fā)揮主要作用的關(guān)鍵通路[23]。糖基化終產(chǎn)物是AGEs結(jié)合受體，RAGE信號途徑可激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)信號通路，PI3K-Akt信號通路也是胰島素信號通路中的重要信號通路，胰島素與其受體結(jié)合導致胰島素受體底物(IRS)通過胰島素受體酪氨酸激酶(INSR)的酪氨酸磷酸化，IRS與PI3K的調(diào)節(jié)亞基相關(guān)聯(lián)激活PI3K-Akt信號通路，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)可經(jīng)PI3K-Akt信號通路來促進大鼠軟骨細胞衰老[24]。TNF家族的2個成員是TNF-α和TNF-β，TNF-α通過PI3K-Akt信號通路促進細胞的衰老[25]。PPAR是核激素受體超家族的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，包括PPARα、PPARγ和PPARβ/δ 3種亞型，在PPAR信號通路中起著核心調(diào)控作用，且均參與細胞衰老的調(diào)控[26-29]，PPAR的激活可能對細胞衰老有預防作用[30]。PPARδ可通過PI3K-Akt信號通路協(xié)調(diào)血管緊張素Ⅱ誘導血管平滑肌細胞衰老[29]。PI3K-Akt信號通路與細胞衰老的調(diào)控密切相關(guān)[31]。本試驗通過對葡萄糖誘導綿羊卵泡顆粒細胞衰老過程中的差異表達基因進行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要富集的通路為糖尿病并發(fā)癥中的AEG-RAGE信號通路、胰島素信號通路、TNF信號通路、PPAR信號通路等，表明高濃度葡萄糖可能通過不同途徑激活PI3K-Akt信號通路來調(diào)控顆粒細胞的衰老。

ANKRD1已被證實與老年供體骨髓中骨髓間充質(zhì)干細胞的體內(nèi)衰老有關(guān)[14]。IL-8是趨化因子家族(CXC)的一種細胞因子，作為衰老細胞過度表達的趨化因子和衰老相關(guān)分泌表型的組成部分[15]，調(diào)控細胞周期進程與細胞增殖等過程[32-33]。本研究中共有401個差異表達基因，這些基因主要參與細胞過程、代謝過程、細胞組成或生物發(fā)生等生物過程，差異表達基因中ANKRD1、IL-8基因表達水平顯著升高，OXT基因表達水平顯著降低，實時熒光定量PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。H組顯著上調(diào)ANKRD1和IL-8基因的表達水平，表明高濃度葡萄糖可能通過ANKRD1和IL-8基因調(diào)控顆粒細胞的衰老。OXT與血糖穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，具有降糖作用[34-35]，且能夠調(diào)節(jié)細胞增殖和細胞周期進程[36-37]。H組OXT基因表達水平顯著降低，推測高濃度葡萄糖通過下調(diào)OXT基因的表達引起細胞周期阻滯誘導細胞的衰老。

綜上所述，葡萄糖通過ANKRD1、IL-8和OXT等基因相關(guān)信號通路調(diào)控綿羊卵泡顆粒細胞的衰老，本研究為深入研究葡萄糖對綿羊卵泡顆粒細胞衰老的分子機制提供了參考。

4 結(jié) 論

17.5 mmol/L葡萄糖可誘導綿羊卵泡顆粒細胞的衰老，用2和17.5 mmol/L葡萄糖處理細胞后，共有401個差異表達基因，這些基因主要參與細胞過程、代謝過程、細胞組成或生物發(fā)生等生物過程，主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AEG-RAGE信號通路、TNF信號通路和PPAR信號通路等。