宋 超，程洪斌，竇思遠(yuǎn)，李泯錕，王 耘*

（金陵科技學(xué)院園藝園林學(xué)院，江蘇南京 210038）

柿子在我國有著悠久的歷史，種植面積和產(chǎn)量位居世界之首。柿果實營養(yǎng)豐富，含有多種抗氧化功能性成分[1]，其中單寧是柿功能性成分中最具關(guān)注的一種，它賦予柿子特有的澀感，多羥基酚類的結(jié)構(gòu)決定了它還有吸收紫外線、清除自由基、防腐和美白保濕等諸多優(yōu)良特性。目前柿單寧提取多以果實為原料，柿葉利用較少，而研究發(fā)現(xiàn)，柿葉中也富含多酚類、黃酮類、萜類、鞣質(zhì)等多種功能性成分[2]，以柿葉為原料提取柿單寧，可以減少果實資源的浪費。

單寧的提取方法多種多樣，例如水提取法、有機(jī)溶劑-水提取法、儀器輔助提取法等，目前常采用超聲波輔助法提取單寧[3-4]。如余先純等[5]采用該方法以70%的丙酮溶液為溶劑提取野柿葉中的單寧，曾鑫海等[6]用此法以及鄰二氮菲分光光度法來提取橄欖中的單寧，王秋亞[7]用50%乙醇提取苦菜中的單寧，從提取溫度、提取時間、料液比等方面考察對單寧提取量的影響。黑柿是黑色柿品種[8]，前期的研究發(fā)現(xiàn)，黑柿葉中單寧含量相比較紅柿葉中多，因此，黑柿葉可以作為一種較好的提取單寧的新資源。關(guān)于黑柿葉單寧提取方法和抑菌活性相關(guān)的報道極少[9]，本試驗在前人研究基礎(chǔ)上，通過單因素試驗和正交試驗，研究了超聲輔助提取黑柿葉中單寧的最佳工藝，并對黑柿葉中的單寧抑菌性進(jìn)行了研究，該結(jié)果為黑柿葉資源開發(fā)利用提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柿葉的制備

試驗當(dāng)天在金陵科技學(xué)院園藝站進(jìn)行黑柿葉片采樣，將樣品在95℃條件下烘干（至恒重），研磨后過40目篩，粉末密封保存置于干燥器中，留待后續(xù)試驗使用。

1.2 黑柿葉中單寧的提取及測定方法

參照韓衛(wèi)娟等[10]及于曉銳等[11]對單寧的提取方法，用電子天平精密稱取0.2g黑柿葉粉，優(yōu)化提取液乙醇的體積分?jǐn)?shù)，優(yōu)化不同料液比，在固定溫度下超聲提取，過濾，收集濾液，定容至25mL。

通過牛廣財?shù)萚11]使用的福林-酚比色法測定（略作修改），其中飽和碳酸鈉溶液作為提供穩(wěn)定的堿性環(huán)境的溶液，靜置顯色反應(yīng)時間改為2h。標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)一步測定樣品。

公式中：x是利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得到的濃度，mg/mL；V為定容容量，mL；m是樣品質(zhì)量，g；N為稀釋倍數(shù)。

1.3 超聲提取黑柿葉中單寧的單因素試驗

1.3.1 不同料液比對提取效果的影響。在60%乙醇、溫度60℃、超聲頻率為100W條件下，分別以1︰20、1︰30、1︰40、1︰50和1︰60（g︰mL）5個料液比進(jìn)行試驗，提取40min，觀察不同料液比對提取單寧的影響。

1.3.2 乙醇濃度對提取效果的影響。利用弱酸性醇-水體系能夠更好地溶出樣品中的縮合單寧[13]。在料液比1︰40（g︰mL）、溫度60℃、超聲頻率為100W的條件下，選擇40%、50%、60%、70%和80%5個梯度的乙醇濃度進(jìn)行試驗，提取40min，探索乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效果的影響。

1.3.3 不同溫度對提取效果的影響。在料液比1︰40（g︰mL）、60%的乙醇溶液、超聲頻率為100W的條件下，選取提取溫度分別為40、50、60、70和80℃，提取40min，分析單寧提取效果。

1.3.4 比較不同時間對提取效果的影響。在料液比1︰40（g︰mL）、60%的乙醇溶液、超聲頻率為100W、溫度為50℃條件下，選取成梯度提取時間進(jìn)行試驗，時間分別為10、20、30、40和50min，分析單寧提取效果。

1.4 正交試驗

根據(jù)對上述單因素試驗的結(jié)果分析后選出了4個因素中較好的水平進(jìn)行正交試驗，確定最佳提取因素和水平（表1）。

表1 黑柿葉單寧提取的正交試驗因素水平

1.5 對細(xì)菌生長的影響

挑取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，活化2代后，37℃過夜培養(yǎng)，作為測試菌菌液。取測試菌液50μL接種于25mL培養(yǎng)液中，以提取單寧用無菌水配制成濃度為2.5%、1.25%和0.625%的溶液，在培養(yǎng)液中各添加2.5mL單寧溶液，無菌水為空白，每隔2h取樣測定600nm下的吸光值，每組做3個平行。

1.6 統(tǒng)計與分析

采用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)處理及制圖利用Excel2019進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1），沒食子酸濃度在0～0.10mg/mL范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出較良好的線性關(guān)系，此范圍內(nèi)的線性回歸方程為y=15.235x+0.0617，R2=0.9983。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 不同料液比的影響。伴隨料液比的逐漸增加，提取量大致呈現(xiàn)出先上升后緩慢下降的趨勢，1︰50時的提取量比1︰40時稍高，但是1︰40時，單寧在溶劑中的溶解基本達(dá)到飽和，考慮到提取效果和成本的影響及后續(xù)濃縮的時間和能耗，可考慮低料液比。

圖2 料液比對單寧提取的影響

2.2.2 不同乙醇濃度的影響。單寧的提取量隨乙醇濃度增加先升高再下降，主要原因是低濃度時隨著乙醇濃度升高，單寧與另外一些物質(zhì)的鍵合被打開，從而游離出來，但是高濃度時，水分的減少使得溶液通透性下降，單寧提取率隨之下降[14]。

圖3 乙醇溶液濃度對單寧提取量的影響

2.2.3 不同提取溫度的影響。溫度50℃有提取峰值，在此之前升高溫度可增加單寧在水溶液中的溶解度，而高于50℃后，黑柿葉中的單寧提取量明顯下降，當(dāng)溫度達(dá)到80℃時，提取量為123.58mg/mL，僅略高于40℃時（221.15mg/mL）的一半。溫度過高，可能加速單寧的氧化和分解或引起單寧結(jié)構(gòu)的變化，導(dǎo)致結(jié)果測定出提取的單寧量偏低。因此，傳統(tǒng)提取條件下長時間高溫不利于活性高的單寧提取。

圖4 提取溫度對單寧提取的影響

2.2.4 不同提取時間的影響。隨著提取時間的延長，單寧提取量有較明顯的增加，40min后不再增加。有研究表明，時間過長，會使得單寧中的酚羥基經(jīng)氧化反應(yīng)變成酮基，從而使得提取量下降[15]。超聲輔助提取既可縮短提取時間又能降低提取溫度，可提高柿葉中單寧的提取率。

圖5 超聲波提取時間對單寧提取量的影響

2.3 最佳提取工藝的優(yōu)化

在單因素試驗的結(jié)果上，正交試驗結(jié)果及極差分析可知（表2），影響黑柿葉單寧提取率的4個因素的主次關(guān)系為提取溫度（A）＞料液比（D）＞提取時間（B）＞乙醇濃度（C）。最佳提取條件為A1B2C2D3，即提取溫度50℃，提取時間40min，60%乙醇，料液比1︰50（g︰mL）。

表2 黑柿葉片單寧提取的正交實驗結(jié)果

2.4 柿葉單寧對細(xì)菌生長影響的分析

試驗采用分光光度法，以光度值來表示細(xì)菌效果。由圖6可知，只有2.5%黑柿葉單寧在大腸桿菌生長至對數(shù)期之前稍微有抑制效果，其他濃度都沒有抑制作用。由圖7可知，不同濃度的黑柿葉單寧對金黃色葡萄球菌的抑制效果都較好，4h后對照組中金黃色葡萄球菌開始快速增殖，至6h后懸浮液的吸光值明顯高于試驗組，且之后試驗組的增殖一直很緩慢，單寧濃度相對較高時抑菌性更好一點。說明黑柿葉中單寧對金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用。

圖6 黑柿葉單寧對大腸桿菌生長的影響

圖7 黑柿葉單寧對金黃色葡萄球菌生長的影響

3 結(jié)論

（1）根據(jù)上述優(yōu)化工藝，利用60%乙醇、1︰50（g︰mL）料液比、超聲頻率100W的條件下，50℃提取40min時，可以較好地提取出黑柿葉中的單寧成分。

（2）不同濃度的單寧溶液對2種不同細(xì)菌（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）的繁殖生長有不同的影響。與噴灑了無菌水的2種細(xì)菌培養(yǎng)基相比，添加了單寧溶液的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液中，菌體增殖較緩，而對大腸桿菌的抑制作用不明顯，由此可明顯看出，單寧溶液具有一定的抑制金黃色葡萄球菌的能力，2.5%單寧溶液的抑菌效果更好一些。

黑柿葉片是提取單寧的一種很好的原料，可有效利用黑柿葉資源，研發(fā)天然防腐劑，對資源合理應(yīng)用和食品防腐具有較好的研究意義。