蔡達 王玉濤 王文博

摘要：為快速、準確定性定量十字花科蔬菜中的活性成分萊菔素與萊菔硫烷，本試驗建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）同時測定蘿卜、西蘭花、白菜中萊菔素與萊菔硫烷含量的方法。采用水解-乙酸乙酯提取萊菔素和萊菔硫烷，WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm ×2.1mm，1.7μm）分離，流動相A為0.1%甲酸-水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫，質(zhì)譜采用電噴霧正離子（ESI+）電離，多反應監(jiān)測掃描模式（MRM）。萊菔素與萊菔硫烷在5～500μg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，添加回收率分別在82.09% ～107.42%、89.79% ～105.55%，相對標準偏差（RSD）分別在2.16% ～4.80%、1.52% ～4.96%，檢出限分別為0.5、0.4μg/L。該方法準確度、精密度和靈敏度均滿足定性定量分析的要求，可以準確測定十字花科蔬菜中萊菔素和萊菔硫烷的含量。

關(guān)鍵詞：十字花科蔬菜;萊菔素;萊菔硫烷;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

中圖分類號：TS207.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2022）01-0144-08

十字花科植物因花冠呈十字型而得名，屬于雙子葉植物綱，五椏果亞綱，白花菜目中的一科，約有388個屬，3700余種，現(xiàn)已被引種到世界各地。常見的十字花科蔬菜主要有蕓薹屬的白菜、西蘭花、甘藍，以及蘿卜屬的蘿卜等。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，十字花科蔬菜具有防癌抗癌的作用，隨著十字花科蔬菜攝入量的增加，可以明顯降低多種惡性腫瘤的發(fā)病風險，包括肺癌、肝癌、結(jié)腸癌等[1-4]，此外，十字花科蔬菜還有抗氧化、抗衰老、預防心腦血管疾病的功效[5-9]，具有重要的營養(yǎng)保健價值，備受廣大消費者青睞。

與其它蔬菜相比，十字花科蔬菜突出的防癌抗癌功效主要歸功于其含有大量的異硫氰酸酯類物質(zhì)，如萊菔素和萊菔硫烷等[10]。萊菔素[（4-異硫氰酸基-1-（甲基亞磺?；?1-丁烯，分子式C6H9NOS2）]和萊菔硫烷（1-異硫氰酸-4-甲磺?；⊥?，分子式C6H11NOS2）在化學結(jié)構(gòu)上僅相差一個雙鍵。目前發(fā)現(xiàn)，萊菔素主要來源于蘿卜，其在蘿卜種子中的含量高達7mg/g[11]，因此蘿卜又名萊菔。而萊菔硫烷主要來源于西蘭花及其種子[12]，在西蘭花花球、莖、葉片中的含量分別為1.782、0.436、0.204μmol/g[13]。已有研究表明，萊菔素和萊菔硫烷對結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、前列腺癌和胃癌等均有明顯的抑制作用[14-20]，兩者還具有抗炎抑菌、提高機體抗氧化能力和免疫力等功能活性[21-23]。因此，萊菔素和萊菔硫烷含量被視為評價十字花科蔬菜品質(zhì)和營養(yǎng)保健價值的重要指標。

萊菔素和萊菔硫烷檢測方法主要有化學滴定法、分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[24-32]。其中，化學滴定法、分光光度法步驟繁瑣，檢測靈敏度較低;氣相色譜法在檢測過程中高溫會破壞萊菔素和萊菔硫烷的結(jié)構(gòu)，定量準確度不高;高效液相色譜法僅以出峰時間定性，對這兩種分子結(jié)構(gòu)相近的物質(zhì)難以實現(xiàn)基線分離，無法同時定性定量檢測，且洗脫時間較長，檢測較為耗時。而超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）準確度和靈敏度較高，分析時間短，能同時測定十字花科蔬菜中的萊菔素和萊菔硫烷。目前國內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在單獨測定萊菔素或萊菔硫烷方面[24-32]，尚未發(fā)現(xiàn)基于UPLC-MS/MS同時測定萊菔素和萊菔硫烷的研究報道。因此，本研究選擇具有代表性的樣品蘿卜、西蘭花、白菜作為研究對象，建立基于UPLC-MS/MS技術(shù)的十字花科蔬菜中萊菔素和萊菔硫烷含量分析方法，對于萊菔素和萊菔硫烷的快速、準確檢測具有重要價值，同時可為十字花科蔬菜優(yōu)異種質(zhì)挖掘和異硫氰酸酯類活性成分產(chǎn)品開發(fā)及蔬菜產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)和保健功能提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器設備

WatersACQUITYUPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，美國Waters公司;ABSCIEXQTRAP5500三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國ABSCIEX公司;高速冷凍離心機，北京京立離心機公司;RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，MS3渦旋混合器，勻漿機，德國IKA公司;FA2204分析天平，上海上平儀器有限公司;Milli-Q超純水機，美國Millipore公司。

1.2 試驗材料與試劑

萊菔素標準品，純度≥98%，美國Sigma公司;萊菔硫烷標準品，純度≥95%，美國Sigma公司;乙腈、甲醇、乙酸乙酯，色譜純，美國Fisher公司;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、磷酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 標準溶液配制

稱取萊菔素和萊菔硫烷標準品各5.00mg，用甲醇溶解，分別轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中，定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1000mg/L萊菔素和萊菔硫烷單標儲備液，于-20℃避光保存。將標準儲備液用甲醇逐級稀釋成500、100、50、10、5μg/L的混合標準工作溶液。

1.4 樣品制備

采用四分法分取樣品，取約200g新鮮樣品于勻漿機中勻漿均勻，編號，置于-20℃保存，備用。

1.5 萊菔素和萊菔硫烷的提取

稱取蔬菜勻漿樣品0.200g于50mL離心管中，分別加入3mLpH5.0的磷酸緩沖液、pH5.6的磷酸緩沖液、pH6.2的磷酸緩沖液、pH6.8的磷酸緩沖液，混勻，置于25℃水解1h，然后加入乙酸乙酯40mL，萃取30min，以4500r/min離心5min，取上層有機相，置于旋蒸瓶中，再重復萃取2次，合并萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用20mL甲醇水溶液（甲醇∶水=7∶3，V/V）定容，過0.22μm濾膜，待UPLC-MS/MS分析測定。

1.6 儀器測定條件

1.6.1 色譜條件 為優(yōu)化色譜條件，分別選用WatersACQUITYUPLCBEHC8色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）、WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）和Symmetry300C18色譜柱（75mm×4.6mm，3.5μm）3種不同色譜柱。柱溫：40℃;流動相A：0.1%甲酸-水溶液;流動相B：乙腈;流速：0.3mL/min;進樣體積：2.0μL;梯度洗脫程序如表1所示。

1.6.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）;正離子模式;離子源溫度（TEM）450℃;霧化氣壓力（GS1）89.6kPa;氣簾氣壓力（CUR）137.9kPa;電噴霧電壓（IS）5500V;駐留時間100ms。采用多反應監(jiān)測掃描模式（MRM），以獲取萊菔素與萊菔硫烷的最佳檢測條件。

1.7 定量分析

分別取標準溶液和樣品溶液上機測定，通過標準工作液的濃度與相應的色譜峰面積繪制標準曲線，以樣品溶液中萊菔素或萊菔硫烷的峰面積代入標準曲線，從而得到相應的萊菔素或萊菔硫烷的濃度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗平行測定3次，結(jié)果用均值表示。采用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

通過蠕動泵恒流注射進樣1mg/L的萊菔素和萊菔硫烷單標溶液，分別進行全掃描，得到準分子離子。結(jié)果顯示，萊菔素和萊菔硫烷的母離子分別是m/z176.0、m/z178.1。之后分別對確定的母離子進行子離子掃描，通過優(yōu)化碰撞能量，獲得二級特征碎片離子。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，萊菔素的主要特征碎片離子為m/z112.0、m/z78.1，如圖1（a）所示。萊菔硫烷的主要特征碎片離子為m/z114.1、m/z72.0，如圖1（b）所示。在MRM模式下，優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量，最終得到萊菔素和萊菔硫烷的監(jiān)測離子對和最佳參數(shù)，如表2所示。

2.2 色譜柱的選擇

試驗結(jié)果顯示，WatersACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm ×2.1mm，1.7μm）分離效果明顯優(yōu)于另外兩種柱子，峰對稱性較好，具有良好的峰形和穩(wěn)定的柱效。因此，選擇C18（100mm ×2.1mm，1.7μm）作為分離色譜柱。

2.3 流動相條件的選擇

由于甲醇和水比例接近1∶1時，混合溶液粘度大，色譜柱柱壓高，為降低柱壓，延長色譜柱使用壽命，故選擇乙腈和水作為流動相，同時加入0.1%甲酸以改善峰形。梯度洗脫程序如表1時，萊菔素和萊菔硫烷的響應值較高，峰形較好，基線穩(wěn)定，無雜質(zhì)干擾，且分析時間較短。萊菔素和萊菔硫烷標準溶液和樣品溶液選擇離子色譜圖分別如圖2、圖3所示。

2.4 提取條件的選擇

萊菔素和萊菔硫烷的前體物質(zhì)硫代葡萄糖苷在不同pH條件下生成的水解產(chǎn)物不同，在中性偏酸性條件下，水解產(chǎn)物以異硫氰酸酯類為主，而萊菔素和萊菔硫烷均屬于該類物質(zhì)。有研究顯示，當水解pH 為5左右時，萊菔素提取率最高[33]，而萊菔硫烷的最適pH一般在6～7之間[34]。本研究考察了不同水解pH值對提取效果的影響，如表3所示。結(jié)果表明，pH5.6條件下，萊菔素和萊菔硫烷的提取效果較好，且添加回收率和相對標準偏差（RSD）均可滿足定量分析的要求。

2.5 方法的線性范圍

以濃度為500、100、50、10、5μg/L的萊菔素和萊菔硫烷混合標準工作溶液，繪制色譜峰面積對濃度的標準曲線（圖4）。在5～500μg/L濃度范圍內(nèi)，萊菔素和萊菔硫烷的標準曲線線性關(guān)系均良好。

2.6 方法的準確度、精密度和靈敏度

方法的準確度和精密度通過添加回收試驗進行考察。在蘿卜、西蘭花、白菜中分別添加低、中、高3個濃度水平的萊菔素和萊菔硫烷標準溶液，每個濃度均做5個平行，進行3水平5平行加標回收試驗。由表4可知，在1～60μg/g添加水平下，萊菔素添加平均回收率在82.09% ～107.42%之間，RSD為2.16% ～4.80%。由表5可知，在5～80μg/g添加水平下，萊菔硫烷添加平均回收率在89.79% ～105.55%之間，RSD為1.52% ～4.96%。

逐步稀釋樣品上機測定，以信噪比S/N≥3計算檢出限，萊菔素的檢出限為0.5μg/L，萊菔硫烷的檢出限為0.4μg/L。上述結(jié)果表明，回收率、精密度和靈敏度均滿足定性定量分析的要求。

2.7 實際樣品中萊菔素和萊菔硫烷的分析檢測

選取3種有代表性的十字花科蔬菜樣品蘿卜、西蘭花、白菜，按照上述已建立的方法進行分析測定，結(jié)果如表6所示。蘿卜中的萊菔素含量較高，為38.59μg/g。西蘭花中的萊菔硫烷含量較高，為22.06μg/g，而萊菔素含量低于檢出限。白菜中的萊菔素和萊菔硫烷含量均相對較低。

3 討論

利用本試驗建立的方法對實際樣品進行分析檢測，發(fā)現(xiàn)蘿卜中的萊菔素含量較高，為38.59μg/g。萊菔素在蘿卜中的含量遠遠高于其它蔬菜，是蘿卜中主要的異硫氰酸酯類化合物[33]。華貝貝等[30]研究表明，不同產(chǎn)地、不同品種蘿卜中萊菔素含量存在顯著差異，萊菔素含量分布范圍為34～1447mg/kg。姚玉慶[31]對43個不同品種蘿卜中萊菔素含量進行了分析，發(fā)現(xiàn)其含量變化范圍為43.26～468.27μg/g。本研究中蘿卜樣品的萊菔素含量相對略低，可能與蘿卜品種、產(chǎn)地環(huán)境包括溫度、土壤條件、日照長短及強度等不同有關(guān)[35]。萊菔硫烷是西蘭花中最主要的異硫氰酸酯類物質(zhì)，本試驗對西蘭花樣品的分析檢測表明，西蘭花中萊菔硫烷含量較高，為22.06μg/g，而萊菔素含量低于檢出限。楊杜等[36]對西蘭花中異硫氰酸酯進行分析鑒定，也未檢出萊菔素。Liang等[37]分析發(fā)現(xiàn)西蘭花中萊菔硫烷的含量在1.4～32.9mg/kg之間;孔凡華等[32]研究顯示西蘭花中萊菔硫烷含量為每100g中3.86mg，與本研究測定結(jié)果大致相當。對白菜樣品進行分析檢測發(fā)現(xiàn)，白菜中的萊菔素和萊菔硫烷含量均較低，與廖永翠等[38]的研究結(jié)果一致。

國內(nèi)外關(guān)于萊菔素和萊菔硫烷檢測方法的研究報道主要集中在單獨測定萊菔素或萊菔硫烷方面[24-32]，目前僅發(fā)現(xiàn)1篇研究報道建立了HPLC法同時測定萊菔素和萊菔硫烷[39]。在該報道中，通過在流動相中加入四氫呋喃，提高了萊菔素和萊菔硫烷的分離度，但是四氫呋喃會對色譜柱和儀器產(chǎn)生較為嚴重的損傷;此外，該方法洗脫時間較長，需要30min，檢測效率較低。尚未發(fā)現(xiàn)利用UPLC-MS/MS同時測定萊菔素和萊菔硫烷的研究報道。由于UPLC-MS/MS具有更高的靈敏度和準確度，且分析時間較短，因此在同時測定萊菔素和萊菔硫烷方面具有明顯的優(yōu)勢。對此，為了解決萊菔素和萊菔硫烷分析檢測中存在的問題，本研究首次建立了基于UPLC-MS/MS同時檢測十字花科蔬菜中萊菔素與萊菔硫烷含量的方法，可為十字花科蔬菜營養(yǎng)評價及育種研究提供技術(shù)支持。

4 結(jié)論

本研究建立了UPLC-MS/MS同時檢測十字花科蔬菜中萊菔素與萊菔硫烷含量的方法。確定色譜條件為WatersACQUTTYUPLCBEHC18色譜柱（100mm × 2.1mm，1.7μm），乙腈-（0.1%甲酸）水溶液作為流動相，梯度洗脫，流速0.3mL/min。質(zhì)譜采用ESI+模式，MRM掃描模式。萊菔素和萊菔硫烷在5～500μg/L濃度范圍內(nèi)均與峰面積具有良好的線性關(guān)系。萊菔素、萊菔硫烷的添加回收率分別為82.09% ～107.42%、89.79% ～105.55%，RSD分別為2.16% ～4.80%、1.52% ～4.96%。萊菔素、萊菔硫烷的檢出限分別為0.5、0.4μg/L。該方法前處理簡單、分析時間較短，準確度、精密度和靈敏度均滿足定性定量分析的要求，適用于十字花科蔬菜中萊菔素和萊菔硫烷含量的測定。