周朝陽 王韶 羅亞燦 周賢用 董服波 李西*

先天性心臟病是最常見的先天性畸形之一，其臨床表現主要取決于畸形的大小和復雜程度［1］。研究先天性心臟病的發(fā)病機制，對于提前預防、診斷和治療具有重要的作用。斑馬魚因其基因保守、體外受精、胚胎透明、具有一心房一心室等生理特點，已成為研究心臟發(fā)育的重要模式動物［2］。在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，心肌前體細胞可以在囊胚期檢測［3］，一些早期的標記基因如nkx2.5［4］，hand2［5］，cmlc［6］等特異度表達在此區(qū)域。蛋白激酶C（PKC）是一個絲氨酸和蘇氨酸特異度蛋白激酶家族，在多種的細胞活動中發(fā)揮重要作用，如調控細胞周期等。PKCα 是心肌細胞中主要表達的PKC 亞型，對Ca2+有強烈的依賴，是心肌細胞生長的調節(jié)因子［7］，在心臟發(fā)育和許多心血管疾病的病理生理學中起著多方面的作用，其中PKCα 是心肌細胞收縮力的重要調節(jié)因子［8］。胚胎致死性異常視覺樣蛋白1（embryonic lethal abnormal vision like 1，ELAVL1）是一種廣泛表達的RNA 結合蛋白，主要通過調控靶mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率來調控相應基因的翻譯表達［9］，對個體的發(fā)育存活和器官的形成起著重要作用。Elavl1+/-小鼠交配產生的純合Elavl1-/-老鼠在胚胎發(fā)育至14.5 d前全部死亡［10］。全身條件性敲除的成年小鼠因間接上調p53的表達導致多器官中前體細胞凋亡而死亡［11］。研究證實PKC 能通過磷酸化ELAVL1 的Ser158 與Ser221位點誘導ELAVL1 核質穿梭，而突變上述磷酸化位點會阻斷ELAVL1 的核質穿梭過程，顯著性降低細胞質中ELAVL1 含量［12］。上述研究提示PKC 可能通過介導ELAVL1 磷酸化，影響靶基因的穩(wěn)定性，進而調控胚胎發(fā)育的正常進行。筆者既往的研究顯示，斑馬魚中存在兩個 elavl1 基因亞型，其中起主要作用的是elavl1a［13］。因此，筆者擬以斑馬魚為研究對象，觀察PKC 對elavl1a的影響及與斑馬魚的心臟發(fā)育的關系。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚的飼養(yǎng) 成年斑馬魚在28±1℃的光/暗周期中飼養(yǎng)14 h/10 h，并喂以豐年蝦。斑馬魚胚胎在E3 溶液（0.25 M NaCl、0.0085 M KCl、0.0165 M CaCl2·H2O、0.0165 M MgSO4·7H2O）中于28℃±1℃下飼養(yǎng)。所有動物實驗均符合溫州醫(yī)科大學機構動物護理和使用委員會的指導原則。

1.2 主要試劑 Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix、Lipofectamine2000、Lipofectamine LTX and Plus 試劑購于美國Invitrogen 公司；Vinculin 單克隆抗體、elavl1a 多克隆抗體購于美國Abcam 公司；ECL 顯影液購于美國Millipore 公司；山羊抗兔IgG HRP抗體購于美國Jackson 公司；PCR 試劑盒購于北京天根公司；RIPA 蛋白裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天公司；引物合成于南京金斯瑞公司；抗地高辛AP，BCIP/NBT 儲備溶液購于瑞士Roche 公司；星形孢菌素，卡馬拉素，Go6976 購于上海MCE 公司。

1.3 藥物實驗 使用胚胎培養(yǎng)液將星形孢菌素，卡馬拉素，Go6976 原液稀釋至對應濃度。去除原有胚胎培養(yǎng)液，加入含有DMSO 或藥物的胚胎培養(yǎng)液；放置于28℃胚胎培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h 后取出做后續(xù)實驗。

1.4 原位雜交 使用標記有抗地高辛AP 的單鏈RNA探針進行全套原位雜交。將固定和分期的胚胎預雜交3 h，然后與指示探針雜交過夜。經過一系列嚴格的清洗后，胚胎被2%的牛血清白蛋白封閉，并與堿性磷酸酶結合抗體孵育過夜。用洗滌液洗滌后，用BCIP/NBT儲備溶液標記樣品。

1.5 顯微注射 設計特異度敲降斑馬魚elavl1a 的寡聚核苷酸，具體序列如下所示：elavl1a MO：TGTGGTCTTCGTAACCGTTCGACAT。DEPC 水 稀 釋elavl1a MO 至2 ng/nL 與4 ng/nL，陰性對照組注射等量DEPC 水。顯微注射儀壓力閥調節(jié)氮氣壓力，校準注射壓力及注射時長，使單次注射體積固定為2 nl，將稀釋所得MO/對照組MO 注入注射針，調整位置。斑馬魚產卵后5 min 內收集受精卵，將魚卵單個排列貼于凹槽，使用毛細管將胚胎擺放至動物極朝向注射針相對位置，便于注射。將MO 依次快速注入斑馬魚胚胎（1-2 細胞期），顯微注射后的斑馬魚胚胎移回培養(yǎng)皿，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。顯微注射后12 h 挑除未受精或死亡胚胎。

1.6 Western Blot 收集顯微注射后斑馬魚胚胎，加入1 mL 去卵黃液，室溫搖床快搖15 min，離心機常溫，300 g，離心30 s。去除上清液，沉淀中加入50μL RIPA細胞裂解液 （含有0.1%蛋白酶抑制劑、0.1%磷酸酶抑制劑），置于冰上30 min，離心機4℃，15,000 rpm，離心10 min。收集上清，-80℃保存?zhèn)溆?。使用BCA 試劑盒檢測總蛋白濃度。將樣品加到SDS-PAGE 凝膠上分離，并轉到PVDF 膜上，PVDF 膜室溫下用5.0%牛奶封閉2 h，PBST 洗膜三次，每次5 min，隨后與2%BSA 稀釋的一抗4℃孵育過夜。第二天用PBST 洗膜三次，將膜與相應二抗室溫下孵育1 h。調整曝光度曝光拍照，使用ImageJ 軟件進行條帶灰度值定量分析。

1.7 實時熒光定量PCR 使用Trizol 試劑提取總RNA， 分 光 光 度 計 測RNA 濃 度 和 純 度。 將RNA 通 過 使 用 PrimeScript? RT Master Mix 逆 轉 錄成cDNA。 使 用 SYBR? Premix Ex Taq?試 劑 通 過實時熒光定量PCR 進行定量。相對轉錄水平通過2-ΔΔCT法進行數據分析。Nkx2.5 引物序列：前引物：5’-AGCATCCAACCTTCACAGTCC-3’； 后 引 物：5’-AAAAACAT CCCAGCCAAACC-3’；EF-1α 用 作內參，前引物：5’-CTGGAGGCCAGCTCAAACAT-3’；后 引物：5’-ATCAAGAAGAGTAGTACCGCTAGCATT AC-3’。

1.8 統計學方法 采用Prism 6 統計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，采用t檢驗。圖像分析軟件使用Image J 進行分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 抑制斑馬魚體內PKC 活性后胚胎心臟發(fā)育異常 Staurosporine、Rottlerin、和Go6976 均為常用的PKC 抑制劑，其中Staurosporine 是廣譜的PKC 抑制劑，Rottlerin 是PKCɑ 抑制劑，Go6976 是PKCδ 抑制劑。通過在斑馬魚胚胎培養(yǎng)液中添加Staurosporine（1μM），Rottlerin（50μM）和Go6976（2.5μM）抑制胚胎體內相應PKC 活性，持續(xù)暴露48 h。隨后通過整胚原位雜交檢測心肌細胞標記物cmlc 的表達，顯示使用這些PKC抑制劑處理后的胚胎心臟發(fā)育畸形顯著增加（見圖1）。

圖1 PKC抑制劑處理導致斑馬魚胚胎心臟發(fā)育異常。A. PKC抑制后，原位雜交實驗顯示胚胎心臟發(fā)育異常；B. PKC抑制后胚胎心臟發(fā)育統計結果，其中Rottlerin組和Staurosporine組的異常率最高，其次為Go6976組

2.2 elavl1a 的Ser219 與Ser316 位點突變對心臟發(fā)育的影響 為了探究elavl1a 是否與胚胎心臟發(fā)育有潛在聯系，突變elavl1a 的Ser219 和Ser316 磷酸化位點，同時注射不同形式的flag-elavl1a mRNA 進入胚胎，Western blot 驗證顯示 elavl1 蛋白表達水平升高。與對照組相比，整胚原位雜交檢測心肌細胞標記物cmlc 的表達顯示 elavl1a Ser219 和Ser316 位點突變的斑馬魚胚胎心臟發(fā)育出現異常（見圖2）。

圖2 elavl1a點突變可導致斑馬魚胚胎發(fā)育異常。A. 不同形式elavl1a-flag mRNA注射后 elavl1a蛋白表達水平明顯增加；B. 注射后，原位雜交實驗顯示點突變的elavl1a導致胚胎心臟發(fā)育異常；C. elavl1a點突變后胚胎發(fā)育統計結果

2.3 elavl1a 調控斑馬魚早期心臟的發(fā)育 nkx2.5 在心臟發(fā)育期間發(fā)揮著重要作用，也是胚胎發(fā)育階段心臟系統中表達較早的基因之一。通過生物信息學工具分析發(fā)現在nkx2.5 的3’非編碼區(qū)存在三個 elavl1a 潛在結合位點（見圖3A），因此推測nkx2.5 可能是 elavl1a 的潛在靶基因。首先通過顯微注射寡聚核苷酸特異度敲降elavl1a 表達，與對照組相比，敲降組斑馬魚nkx2.5 表達量顯著降低（見圖3B），且心臟發(fā)育出現異常（見圖3C）。

圖3 elavl1a調控斑馬魚早期心臟的發(fā)育 。A. 斑馬魚nkx2.5 3’非編碼區(qū)存在elavl1a三個潛在結合位點；B. 敲降elavl1a后nkx2.5的表達量顯著下降；C. 敲降elavl1a后心臟發(fā)育出現異常表型

3 討論

先天性心臟病發(fā)病率在我國發(fā)病率較高，統計顯示我國每年新增先天性心臟病嬰兒15～20 萬。本文通過抑制PKC 活性及敲降elavl1a 表達發(fā)現斑馬魚心臟發(fā)育出現異常，且elavl1a 可能是通過影響nkx2.5 基因的表達而調控斑馬魚胚胎心臟發(fā)育。

PKC 作為蛋白激酶家族成員之一，在細胞的增殖和分化中起著關鍵作用，參與心臟形成過程以及心臟病發(fā)病過程，其中尤以PKCɑ 為主要亞型。廣譜抑制PKC 活性或主要抑制PKCɑ，均可影響斑馬魚胚胎心臟發(fā)育，幼魚心臟畸形顯著增加。

筆者既往的研究已經發(fā)現，PKC 可以介導elavl1 的Ser219 與Ser316 位點磷酸化，促進elavl1 的核質穿梭，從而發(fā)揮相應的功能。在人髓系白血病細胞K562 中，轉染過表達ELAVL1 的Ser219 位點和Ser316 位點突變載體后，氯高鐵血紅素誘導的ELAVL1 核質穿梭受到抑制，從而抑制了人髓系白血病細胞的分化［15］。在本研究中突變了elavl1a 被PKC 調控的磷酸化位點——Ser219和Ser316，顯示斑馬魚幼魚心臟發(fā)育更容易出現畸形。nkx2.5 已被驗證是與人類多種心臟疾病相關［16］，且對維持斑馬魚心室同一性至關重要［17］。本研究發(fā)現在敲降elavl1a 斑馬魚中nkx2.5 表達量顯著降低，且nkx2.5上存在elavl1a 三個潛在結合位點，提示elavl1a 可能是通過調控nkx2.5 表達而影響斑馬魚幼魚心臟發(fā)育。

綜上所述，本研究發(fā)現抑制PKC 或敲降elavl1a 都能導致斑馬魚胚胎心臟發(fā)育畸形，這一病理過程可能是elavl1a 通過調控nkx2.5 的表達而實現，說明PKC 與elavl1 對斑馬魚胚胎心臟發(fā)育具有重要的調控作用。