冉小琴 姚欽 姜望予 屠思懿 龍夢(mèng) 陳芳*

間質(zhì)性肺病（Interstitial lung disease，ILD）是一類(lèi)異質(zhì)性疾病，以進(jìn)行性發(fā)展的肺實(shí)質(zhì)炎癥和纖維化為特征。特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是ILD 中的特殊類(lèi)型，病因不明，在老年男性、有吸煙史等群體中發(fā)病率高。相較其他類(lèi)型ILD，IPF 預(yù)后差，死亡率逐年遞增，中位生存期2～3 年［1］。臨床上多使用抗纖維化、抗氧化、抗炎藥物等治療IPF，但存在藥品昂貴、副作用大等情況。生物信息學(xué)是跨學(xué)科領(lǐng)域，它結(jié)合了生物學(xué)、計(jì)算機(jī)和統(tǒng)計(jì)學(xué)來(lái)分析和解釋生物數(shù)據(jù)中所含的生物學(xué)意義。隨著公共數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善，可以利用生物信息學(xué)方法來(lái)挖掘公共數(shù)據(jù)庫(kù)中肺纖維化的差異表達(dá)基因并進(jìn)行分析，為探索IPF 的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)，為疾病的診治提供新思路及新方向。

1 資料與方法

1.1 IPF基因表達(dá)數(shù)據(jù)獲取 使用NCBI（National center for biotechnology）的GEO 在線數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），以“Idiopathic pulmonary fibrosis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，芯片來(lái)源選擇“Homo sapiens”，獲得以GPL6480 為平臺(tái)的GSE53845 數(shù)據(jù)集，其中包括40份IPF 患者和8 份正常肺組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達(dá)基因篩選 使用GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）獲取出IPF 與正常肺組織的差異表達(dá)基因原始數(shù)據(jù)，隨后以P值＜0.01 且|log2 FC|＞2（FC 為差異倍數(shù)）作為截?cái)嘀岛Y選出顯著差異表達(dá)基因，其中l(wèi)og2 FC＞2 為上調(diào)基因，log2 FC＜-2 為下調(diào)基因，并繪制火山圖。選取上調(diào)的前10 個(gè)基因與下調(diào)的前10 個(gè)基因，將其調(diào)整為二維矩陣格式后導(dǎo)入熱圖繪制網(wǎng)站（http：//www.heatmapper.ca/expression/），使用該網(wǎng)站在線繪制聚類(lèi)熱圖。

1.3 GO 與KEGG 通路富集分析 將所獲得的顯著差異基因?qū)隓AVID（富集分析）數(shù)據(jù)庫(kù)（2021 版）（https：//david.ncifcrf.gov/）并進(jìn)行GO 與KEGG 通路富集分析。在GO 分析中輸出差異基因的前十條分子功能（molecular function）分析，在KEGG 通路富集分析中以P＜0.05 輸出通路富集分析結(jié)果。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與可視化分析 在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//cn.string-db.org/）中輸入所獲得的顯著差異表達(dá)基因，進(jìn)行蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。將所獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)出后使用Cytoscape 軟件對(duì)其進(jìn)行可視化分析，利用Cytoscape中的Cytohubba插件對(duì)差異基因使用3種常規(guī)算法（MCC、Degree、Closeness）進(jìn)行篩選，以每一種算法所獲得的前十位基因作為IPF 發(fā)病相關(guān)的核心基因。

2 結(jié)果

2.1 差異基因篩選結(jié)果 根據(jù)篩選條件，在數(shù)據(jù)集GSE53845 中，IPF 組和健康組之間共得到148 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因108 個(gè)，下調(diào)基因40 個(gè)。繪制火山圖（見(jiàn)圖1）其中紅色表示上調(diào)的表達(dá)基因，綠色表示下調(diào)的表達(dá)基因，黑色表示無(wú)明顯表達(dá)差異的基因，繪制聚類(lèi)熱圖（見(jiàn)圖2）。

圖1 差異表達(dá)基因火山圖

圖2 顯著差異表達(dá)基因聚類(lèi)熱圖

2.2 差異基因的GO 與KEGG 通路富集分析 GO 分析顯示在分子功能方面，差異基因多富集于蛋白酶連接、趨化因子活性、免疫球蛋白受體結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分、細(xì)胞因子活性等（見(jiàn)表1）。KEGG 通路富集分析顯示差異基因多富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、蛋白質(zhì)消化吸收、NF-κB 信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路等（見(jiàn)表2）。

表1 差異基因GO富集分析結(jié)果

表2 差異基因KEGG通路富集分析結(jié)果

2.3 差異基因的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵基因篩選 將所獲得的148 個(gè)差異表達(dá)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3）。再用Cytoscape 進(jìn)行可視化分析（見(jiàn)圖4），其中紅色表示表達(dá)上調(diào)的基因，藍(lán)色表示表達(dá)下調(diào)的基因；最后使用Hubba 插件中的MCC、Degree、Closeness 算法得到12 個(gè)關(guān)鍵基因（CXCL12、MMP1、MMP7、CXCL1、SPP1、VCAM1、COL1A1、CCL2、CCR7、CCL19、SELE、THY1），（見(jiàn)圖5）。

圖3 差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖4 差異表達(dá)基因的Cytoscape可視化分析

圖5 3種算法結(jié)果排名前10基因相互作用關(guān)系（節(jié)點(diǎn)顏色越深表示各算法分值越高）

3 討論

特發(fā)性肺纖維化屬于一種致死性、進(jìn)行性發(fā)展的肺部疾病，病因不明，以肺間質(zhì)彌漫性滲出、浸潤(rùn)和纖維化為主要病變［2］。當(dāng)前針對(duì)肺纖維化的治療主要包括藥物、肺康復(fù)、終末期肺移植等［3］；藥物主要分為抗纖維化、抗氧化以及抗炎三類(lèi)。目前臨床上公認(rèn)的抗纖維化藥物包括吡非尼酮、尼達(dá)尼布，相關(guān)臨床研究報(bào)道［4］其具有減慢肺功能下降速度、改善生活質(zhì)量等作用。但同時(shí)存在用藥周期長(zhǎng)、價(jià)格高昂、副作用大等情況。隨著大數(shù)據(jù)時(shí)代的到來(lái)，生物信息學(xué)等技術(shù)得到了飛速發(fā)展，也為IPF 作用機(jī)制的研究提供了新方法新思路。

本研究通過(guò)篩選GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)中的GSE53845 數(shù)據(jù)集得到特發(fā)性肺纖維化與正常肺組織差異表達(dá)的148個(gè)基因，其中在病變組織高表達(dá)的基因共108 個(gè)、低表達(dá)的基因共40 個(gè)，通過(guò)GO 與KEGG 通路富集分析獲得相關(guān)分子功能與作用通路。在分子功能分析方面，趨化因子活性分子功能相關(guān)研究［5］涉及支氣管哮喘等肺部疾?。患?xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分相關(guān)研究［6］涉及支氣管發(fā)育不良等；細(xì)胞因子活性分子功能所涉及研究較多，全身各系統(tǒng)疾?。?］均與其相關(guān)，包括但不限于膿毒癥、腫瘤等。在通路富集分析方面，NF-κB 信號(hào)通路和趨化因子信號(hào)通路存在作用通路的重疊，在呼吸系統(tǒng)［8］中NF-kB 信號(hào)通路研究多見(jiàn)于肺損傷、哮喘等疾病。

通過(guò)Cytoscape 中的插件獲取到CXCL12、MMP1、MMP7、CXCL1、SPP1、VCAM1、COL1A1、CCL2、CCR7、CCL19、SELE、THY1 等12 個(gè)基因，通過(guò)對(duì)比上述基因的GO 分子功能分析與KEGG 通路富集分析及綜合MCC、Degree、Closeness 等算法篩除SELE、THY1，對(duì)余下10 個(gè)基因進(jìn)行分析，此10 位基因在IPF 患者中均為高表達(dá)。VCAM-1（血管細(xì)胞黏附分子1）由VCAM1基因表達(dá)，其多存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面，在血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)和白細(xì)胞之間充當(dāng)介質(zhì)作用，使細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間相互黏連。在炎癥發(fā)生時(shí)，VCAM-1 作為一種炎性介質(zhì)，可參與中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的黏附與遷移過(guò)程。目前在肺纖維化的相關(guān)研究中，VCAM-1 被認(rèn)為通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞間的黏附聚集來(lái)引起纖維細(xì)胞增殖［9］，從而在肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中起著重要作用。

CXCL12、CCL2、CXCL1、CCL19 同為趨化因子家族，屬于一類(lèi)可使白細(xì)胞定向移動(dòng)的小分子分泌蛋白，在炎癥過(guò)程中可誘發(fā)免疫細(xì)胞遷移、參與炎性促腫瘤微環(huán)境形成。Hubba 插件中算法提示CXCL12、CCL2 可能與IPF 存在較大相關(guān)性。在呼吸系統(tǒng)疾病中，此兩種基因研究報(bào)道多見(jiàn)于肺癌、肺動(dòng)脈高壓等，與IPF 相關(guān)性研究國(guó)內(nèi)報(bào)道較少。鐘家寶等［10］通過(guò)一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，在IPF 的診斷中，血清中CCL2水平聯(lián)合其他趨化因子水平曲線下面積可達(dá)0.944，具有良好預(yù)測(cè)價(jià)值，但未涉及具體作用機(jī)制的研究。CCR7是一種趨化因子受體，其主要配體為CCL19、CCL21，關(guān)于其研究報(bào)道多為癌癥領(lǐng)域相關(guān)。在對(duì)過(guò)敏性氣道疾病的研究中，CCR7 被認(rèn)為可以通過(guò)參與細(xì)胞外信號(hào)的調(diào)節(jié)，參與氣道炎癥反應(yīng)，增加黏液的分泌。同時(shí)KAUR 等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在哮喘患者中，CCR7 與CCL19結(jié)合后會(huì)產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致氣道平滑肌的增殖。因此合理預(yù)測(cè)在肺纖維化的患者中，也會(huì)出現(xiàn)上述病理生理過(guò)程，但目前相關(guān)報(bào)道較少，需待進(jìn)一步研究。

SPP1 名為分泌磷酸蛋白1，又稱(chēng)骨橋蛋白，其相關(guān)研究多涉及腫瘤類(lèi)、炎癥相關(guān)性疾病。有研究［12］表明，SPP1 在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）間的相互作用來(lái)參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。在SPP1 與臟器纖維化領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外研究顯示抑制SPP1 表達(dá)可降低臟器纖維化的程度、增強(qiáng)SPP1表達(dá)可加快臟器纖維化導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在相關(guān)器官中異常表達(dá)與過(guò)度沉積［13］。多項(xiàng)研究證實(shí)SPP1 通過(guò)參與ECM 合成、代謝等過(guò)程在組織纖維化中起著重要作用，同時(shí)IPF 也是以細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為特征的疾病，后期在基礎(chǔ)研究與臨床研究中，可將SPP1 作為靶點(diǎn)基因進(jìn)行深入探討。

MMP1、MMP7 同屬基質(zhì)金屬蛋白酶家族，基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）參與血管平滑肌生長(zhǎng)、增殖、血管生成、組織修復(fù)等過(guò)程。嚴(yán)梅等［14］研究發(fā)現(xiàn)，MMP7在IPF 患者組織中高表達(dá)，且與肺功能損傷程度成正比，可作為IPF 的臨床輔助診斷生物標(biāo)志物。同時(shí)在大鼠肺纖維化組織中，許夢(mèng)婷等［15］發(fā)現(xiàn)MMP1 在組織中表達(dá)增加，且經(jīng)MMP 組織抑制劑處理后肺纖維化程度有所下降，這在一定程度上說(shuō)明MMP1 與組織肺纖維化進(jìn)程密切關(guān)聯(lián)。COL1A1 屬于膠原蛋白家族，是I 型膠原蛋白的α1 鏈，其在IPF 中高表達(dá)并多沉積于胸膜下、血管周?chē)胺闻蓍g隔，是導(dǎo)致氣管壁增厚及氣道重塑的主要原因，明確了膠原蛋白在IPF 發(fā)病過(guò)程中的重要作用。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)工具篩選出VCAM1 等10 位顯著差異表達(dá)基因并對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)分析。其中MMPs、COL1A1 等基因已被多項(xiàng)研究報(bào)道證實(shí)與纖維化組織密切相關(guān)，在后期肺纖維化的研究中，可將SPP1、趨化因子家族（CXCL12、CCL2、CXCL1、CCL19）作為關(guān)鍵基因靶點(diǎn)，進(jìn)行動(dòng)物研究與臨床資料驗(yàn)證，以期在IPF 的診治方面得到突破。